实验三-细菌分离培养与培养性状观察

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细菌的分离培养

细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。

实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。

实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。

若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。

操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。

划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。

可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。

1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。

2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。

3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。

微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查

实验一细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养基，一部分标记“前”，另一部分标记“后”，然后将手指在标记“前”的部分沾一下，洗手后在标记“后”的部分沾一下。放入37℃温箱培养24h后观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表皮葡萄球菌。
二、理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm，对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌，一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基液体培养基
固体培养基
观察细菌动力大量繁殖细菌细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基半固体培养基

叶部病害分离

间接测定方法有很多种，比如：全氮量和核酸分析，干菌丝体含氮量是4.5－8.5％，DNA 0.4－0.8％。此外，可以通过分析培养液中糖的含量的变化，来间接证明菌丝的生长量。
7. 真菌菌种的保存
分离到的真菌要用适当的保存方法，以保持它的生活力和原有的性状，并避免其他杂菌和螨类的污染。
保存的菌种要注明菌种的种、菌系和保存日期。
有些生活力差的真菌，存放在-20度的低温冰箱中效果最好；近年来受到重视的是超低温保存法，降菌种通过特殊的处理后，放入-70－-80度的低温环境中。
一、实验目的
1. 为了证实其病原菌的特性；
2. 为了进一步研究病原菌的形态、生活史、生理和生态特性；
3.Байду номын сангаас为了获得其发酵液等
鉴于以上原因，分离和纯化真菌是必需的，是保证整个实验能够顺利进行的前提。
二、实验原理
真菌的分离就是将所需要的真菌与其他杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯培养菌株。
直接测定的方法有以下几种：
① 目力估测
优点：快速；缺点：精确度低。
② 直线生长
优点：能够进行多次测量，精确表明菌丝生长率；缺点：测量的次数过多，容易造成培养菌的污染。
③ 湿重测定
优点：快，并且菌丝是未经处理而保持其原来的状态；
缺点：精确度低，只能测定一次，不能体现其延续性。
④ 干重测定
优点：比较精确；缺点：同上。
注意事项： ① 待分离组织必需是新鲜发病的。 ② 要掌握培养基的温度。 ③ 要掌握孢子悬浮液的浓度。

细菌的分离培养与培养性状观察

冷至约５０￣Ｃ，用接种环取一环培养物于第一管内，随
即用两手掌心搓转振荡，由第一管取入第二管，搓匀又从第二管取出一环至第三管振荡后，分别倒入３个灭菌空平板内，摇匀待凝固后，倒置于３７ ℃温箱内 ‘ 培养，２４小时后观察结果。第一个平板菌落最多，第二个、第三个递减，可得到单个菌落。
约５０克置于密封容器内与接种的厌氧菌共同培养。焦性没食子酸法是利用焦性没食子酸与碱作用
板盖使之成１条狭缝，并靠近火焰旁。右手持接种环
克，１０％氢氧化钠或氢氧化钾１０毫升。常用方法有试管培养法，干板培养法，干燥器培养法。二氧化碳培养法利用少数细菌如牛型布氏杆
菌，在含有５％～１０％的二氧化碳环境下生长良好，常用的方法为烛缸法。取干燥器（盖口抹上凡上林），将接种好的平板或斜面放入器内，点燃燃烛直立于缸的隔板上，盖上盖子，因器内氧气耗尽蜡烛自灭，
１～２毫米者为小菌落；２～４毫米者为中等大菌落；４毫米或更大者为大菌落或巨大菌落。菌落外形有圆形、不规则形、卷毛状、根状等。隆起度呈扩散、台状、凸
起、乳头状、突脐状、覆轮状等。边缘如整齐、缺刻状、圆锯齿形、波状裂片状、镀边等。观察菌落表面是否光滑、皱褶、颗粒状、同心环状、龟裂状等。表面光泽

微生物实验中的接种分离和培养操作步骤

微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。

2、掌握无菌操作基本环节。

二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。

在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。

微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。

然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。

三、实验材料1、恒温培养箱。

2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。

3、培养基（上次实验配制的）。

4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。

四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。

（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。

（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。

（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。

（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。

从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。

有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。

从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。

有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。

微生物检验学之细菌的培养与分离技术

细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L型的检查一、基本条件（一）细菌实验室中华人民共和国卫士行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则。

1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。

且室内禁用风扇，避免细菌的播散。

2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。

3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。

同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器。

4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。

5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。

同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。

6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。

同时室内应设置必要的消防设备。

7.细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。

（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。

1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。

2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。

3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。

4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。

5.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。

（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。

实验三病原菌的分离培养

注：试管加棉塞(最好)
培养基分装完毕以后，在管口
上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。
加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。
（五）病原真菌的分离培养
1．组织分离法按照以下步骤进行：
(1) 取灭菌培养皿一个，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2) 取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(边长3--4mm)病组织数块。提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
4. 在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，
【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶
塞. 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌. 6.摆斜面,凝固后放冰箱备用.
用于活化菌种，或培养菌种的斜面
用于保存菌种的斜面
搁置斜面
当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一
端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。
（二）灭菌与消毒

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐源自射灭菌、化学药品灭菌等方法。

细菌的分离与培养

细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。

实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。

若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。

课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。

可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。

1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。

2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。

3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。

细菌的分离培养及培养性状的观察

实验四细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。

从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。

分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。

细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。

目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。

2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。

3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。

4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。

操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。

但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。

划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。

划线法示意图见图4-3。

（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。

将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。

将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。

划线完毕，关上皿盖。

灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。

培养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。

培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。

常见植物病原菌物形态观察

实验一常见植物病原菌物形态观察一实验目的认识和掌握常见植物病原菌物的分类特征。

二实验内容在显微镜下观察下列菌物形态（1）假霜霉属（Pseudoperonospora ）孢囊梗、孢子囊（2）盘梗霉属（Bremia）：孢囊梗、孢子囊、孢囊孢子（3）霜疫霉属（Peronophythora）：孢囊梗、孢子囊（4）根霉属（Rhizopus）：假根、匍匐丝、孢囊梗、孢囊孢子、接合孢子（永久玻片）（5）单孢锈菌属（Uromyces）冬孢子，夏孢子（6）镰刀菌属(Fusarium)：分生孢子（7）壳二孢属（Ascochyta）：分生孢子器、分生孢子示范片：（1）核盘菌属（Sclerotinia）子囊盘，子囊，子囊孢子（永久玻片）（2）炭疽菌属（Colletotrichum）：分生孢子盘、分生孢子三实验方法1．培养菌（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子或挑针从培养皿中取少量的霉状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将霉状物分散开；（4）盖上盖玻片后放到显微镜下观察。

2．浸泡标本（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子或挑针从病斑处取少量霉状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将霉状物分散开；（4）盖上盖玻片后放到显微镜下观察。

3．病征为粉状物的浸泡标本：（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子或挑针从病斑处取少量粉状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将粉状物分散开；（4）盖上盖玻片后放到显微镜下观察。

4．病征为粒状物的浸泡标本：（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子取一小块有病菌生长的病斑组织，或在病斑处取明显的粒状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将病斑组织分散开后，盖上盖玻片后放到显微镜下观察；（4）然后轻轻敲击盖玻片，压迫分生孢子器以释放分生孢子，放到显微镜下再次观察。

四病原菌的主要形态特征1．假霜霉属（Pseudoperonospora ）：黄瓜霜霉病菌孢囊梗无色，无分隔，不对称状分枝，有限生长，分枝末端尖锐；孢子囊褐色椭圆形，顶端有乳状凸起，着生在孢囊梗顶端或已脱落。

病原物的分离与培养

病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。

一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。

所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。

病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。

－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。

灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。

在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。

但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。

火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。

涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。

通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。

此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

设计实验微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术一．实验目的1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。

2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。

3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。

二.实验原理菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

1.涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

2.平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

大肠菌群的培养鉴定大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。

还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。

其他病原菌的菌落呈粉红色。

再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。

即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。

菌种保藏菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。

保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。

对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的三.实验器材1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基和马铃薯固体斜面培养基。

微生物检验学之细菌的培养与分离技能技术总结

精心整理细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查一、基本条件（一）细菌实验室1.2.3. 4. 5.菌处理。

6.7. 1. 2. 3.4. 5. pH二、细菌的接种与分离技术（一）平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。

常用的平板划线分离法有以下两种： 1.连续划线分离法杂菌不多的标本。

2.分区划线分离法杂菌量较多的标本。

（二）斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。

（三）液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。

（四）穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。

（五）倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。

（六）涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。

三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。

常用的有需氧培养法、二氧化碳培培养瓶置35℃6～18h后，用肉眼观察其生长现象，如：溶血、产生气体或混浊度等。

应每天肉眼检查细菌生长情况，若为生长阳性应做进一步的分离鉴定和药敏；若为生长阴性，应孵至第7天弃去。

有些细菌如奈瑟菌属和嗜血杆菌属的菌株，心杆菌属、放线杆菌属的细菌都需要较长时间培养。

血培养孵育24h后，肉眼观察阴性的血培养瓶，一般不需做常规显微镜检查，因培养物中有105菌落形成单位CFU/ml，才能通过革兰染色检出细菌。

（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。

五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。

(第三组)微生物实验设计

一、实验原理肠道杆菌的细菌为革兰氏阴性菌，大多数有鞭毛，能运动。

少数无鞭毛不能运动，不产生芽孢，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐。

这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。

有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。

二、实验材料1.病鸡：怀疑被大肠杆菌或沙门氏菌感染2.培养基：半固体培养基麦康凯平板三糖铁高层斜面蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水3.革兰式染色试剂：草酸铵结晶紫溶液、革兰氏碘溶液、95%酒精，沙黄水溶液4. 生化管：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、枸橼酸盐、H2S、尿素5. 生化试剂：吲哚试剂， MR 、VP 试剂7.药敏实验试剂：青霉素、复方新诺明、氯霉素三、实验内容及其安排（一）、制备培养基：麦康凯、半固体、三糖铁高层斜面、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水。

（二）、解剖实验动物，细菌分离培养：病料抹片，染色镜检。

划线接种麦康凯或S·S琼脂平板。

（三）、观察细菌培养性状，选择可疑菌落进行纯培养。

普通琼脂平板、伊红美兰琼脂平板、三糖铁琼脂斜面。

（四）、观察细菌纯培养结果，细菌抹片，革兰氏染色镜检，观察细菌抹片及纯培养情况，。

（五）做生化试验、药敏试验。

（六）观察实验结果，写实验报告。

第一天：制备培养基解剖实验动物、病料抹片、细菌分离培养1.S.S培养基：50g S·S培养基+800ml蒸馏水，煮沸溶化浇平板（15ml/块平板），无需高压2.麦康凯培养基3.三糖铁琼脂4.葡萄糖蛋白胨水：1.25g蛋白胨+1.25g葡萄糖+1.25g磷酸氢二钾+250ml水，加热溶解，调pH至7.6，分装40根短试管高压（3指半高，约5-8ml）5.蛋白胨水：1.25g蛋白胨+0.625gNaCl+125ml水，调pH至7.6，分装40根短试管，捆扎，高压，121℃15分钟（2指高，约2-4ml）6.半固体：分别称取蛋白胨5g、牛肉膏2.5g、氯化钠2.5g、磷酸氢二钾0.5g、蒸馏水500ml，加热溶解，调pH7.6，过滤称琼脂粉2g+肉汤500ml,煮沸，待琼脂粉完全溶化，分装短试管（2指高，约2-4ml）病鸡剖检的方法和步骤一、剖检要求：剖检鸡最好在死前或濒死期进行。

微生物的接种、分离和培养

实验六微生物的接种、分离和培养一、目的要求1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理与操作要领。

2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。

3．了解微生物需氧培养的方法。

4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。

二、实验原理1. 微生物接种指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。

根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。

2. 微生物分离指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。

常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。

平板分离法的基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

3. 微生物培养指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。

本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。

4. 微生物的培养形状培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。

平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。

菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。

菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。

兽医微生物实验指导

兽医微生物实验教案实验一显微镜油浸系的使用及细菌基本形态构造的观察【目的要求】1.掌握正确使用及护理显微镜的方法，特别是油浸系的使用及护理。

2.正确认识细菌的基本形态和构造。

【油浸系的原理】油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。

油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。

其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表示。

而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。

其使用原理是由于香柏油与玻璃的折光率相似(香柏油为1.515，玻璃为1.52)。

镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气(折光率为1.O)而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰。

【器材及试剂】1.菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本片；2.仪器：普通光学显微镜；3.材料：香柏油，二甲苯，擦镜纸等。

【操作步骤】(一)细菌基本形态构造的观察1.准备安置显微镜?调节光源?调节双筒目镜间距?调节聚光器数值孔径值。

将光圈完全开放，升高聚光镜与载物台同高，置标本片于载物台上，在低倍镜下对光，用于转动反光镜以调节之，至视野最亮时为止。

若用天然光源宜用反光镜平面，较弱光源用凹面。

检查未染色标本，光不宜太强，染色标本需强光。

光线强弱可通过放大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。

2.观察将香柏油一滴滴于标本片有颜色的观察区，并置于载物台上，用片夹固定好，用推进器将观察区置于物镜正下方，依次用高倍镜?油镜观察。

用油浸镜检查，使油镜头浸入油滴中，几乎与标本面接触为度。

然后由接目镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)至能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动一般不超过1周)，直至物像清晰为止。

病原菌的分离培养和纯化

普通植物病理学实验十七、病原菌的别离培养和纯化一、目的要求(1)了解别离与纯化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和组织别离、稀释别离、平板划线别离的基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。

二、基本原理植物病原菌的别离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。

为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供应它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。

植物病原真菌的别离方法主要有组织别离法和稀释别离法两种。

最常用的方法是组织别离法，而稀释别离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的别离。

病原细菌的别离方法以划线别离法为最常用，在有些情况下也采用稀释别离法。

为了获得别离菌的纯培养，必须要进行别离菌的纯化，纯化的方法类似于别离工作中采用的稀释别离法或划线别离法。

三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，以下材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。

(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。

(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。

(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。

(5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。

(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。

(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。

(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。

(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。