胶体金免疫层析试验须注意的几个问题
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
免疫胶体金检测
胶体金免疫试纸技术在食品兽药残留检测中应用摘要：动物产品中兽药残留是威胁人体健康和影响畜产品质量安全的重要因素。
虽然检测兽药残留的方法很多，但皆因其设备昂贵、操作繁琐、费时而受到限制。
而胶体金免疫层析技术因其快速、灵敏、简便等特点，在兽药残留检测中广泛研究与应用。
论文就胶体免疫层析法的原理，在兽药残留检测中研究应用以及发展前景做了较为详细的阐叙。
关键词：胶体免疫层析法；兽药残留；检测引言在残留毒理学意义上比较重要的兽药，按照用途主要有抗微生物类、驱虫类、抗球虫和抗原虫药物、抗生素类生长促进剂、合成代谢荷尔蒙类生长促进剂等[1]。
目前，国际上通用的兽药残留检测方法是先采用一种简便的方法对待检样品进行快速初筛，再采用准确性更高的方法对初筛为阳性的样品进行确证分析[2].国内食品受兽药污染问题严重，国家和政府对此已做了大量的投入，但执行情况仍不尽人意，造成该现象的主要原因之一是缺乏快速、灵敏、简便的检测方法[3]。
薄层层析、ELISA法、高效液相色谱、质谱检测技术，由于上述方法需借助仪器设备来完成检测过程时间较长不适宜现场快速检测。
近年来，胶体金免疫层析法因操作简单，不需辅助仪器和试剂，3~5分钟出结果，并可肉眼判断等特点。
因此它在大批量兽药残留现场和初筛检验中得到研究与应用。
1胶体金免疫层析法胶体金(colloidal gold)是氯金酸( chloroauricacid)的水溶液，是氯金酸在还原剂如白磷、柠檬酸三钠等的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定胶体溶液。
由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性,且颗粒聚集达到一定密度时，出现肉眼可见的粉红色斑点，因而可以作为免疫层析试验的指示物。
因此胶体金免疫层析法是一种以胶体（红色）作为示踪标记物[4]。
让其与蛋白质等各种大分子物质结合，再利用抗原抗体反应以达到检测目的的一种新型的免疫标记方法。
GICA主要包括夹心法和竞争抑制法，夹心法包括双抗体夹心法测抗原和双抗原法测抗体，主要用于病毒、细菌和寄生虫等的检测[5]。
胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析技术原理胶体金免疫层析技术是一种基于胶体金颗粒的分析方法，常用于生物医学领域的分子检测和诊断。
该技术的原理是利用胶体金颗粒与特定抗原或抗体的高度特异性结合能力，通过可视化或仪器测量的方式实现目标分子的定量或定性分析。
胶体金是一种具有特殊光学性质的纳米材料，其颗粒大小一般在10-100纳米之间。
这种材料具有高度的稳定性和生物相容性，并且在可见光范围内具有强烈的吸收和散射光谱特性。
在胶体金免疫层析技术中，胶体金颗粒表面通常被修饰上特定的抗原或抗体。
在分析过程中，样品中的目标分子与胶体金颗粒表面的抗体结合形成复合物。
这种结合通常是由于抗原与抗体之间的特异性配对引起的。
复合物的形成会导致胶体金颗粒的聚集或分散状态发生变化。
胶体金免疫层析技术通常采用纸条或膜作为载体。
样品在载体上流动时，复合物会在特定位置停留，形成可见的信号线。
这个信号线的强度与目标分子的浓度成正比。
通过测量信号线的长度、颜色强度或使用专门的仪器分析，可以确定目标分子的存在与否以及其浓度。
胶体金免疫层析技术具有以下优点：1. 高度特异性：由于抗原与抗体之间的高度特异性结合，胶体金免疫层析技术可以准确地检测目标分子，避免了其他杂质的干扰。
2. 灵敏度高：胶体金颗粒具有强烈的吸收和散射光谱特性，使得该技术能够检测到非常低浓度的目标分子。
3. 快速简便：胶体金免疫层析技术通常只需要几分钟到几小时的时间完成分析，操作简单，不需要复杂的仪器设备。
4. 可视化结果：该技术可以通过肉眼观察或简单的仪器测量获得结果，无需复杂的数据处理。
胶体金免疫层析技术在临床诊断、食品安全监测、环境污染检测等领域具有广泛应用。
例如，在临床诊断中，可以利用该技术检测血液中的肿瘤标志物、病原体和药物残留等；在食品安全监测中，可以检测食品中的致病菌和有害物质；在环境污染检测中，可以检测水体、土壤和大气中的污染物。
胶体金免疫层析技术是一种快速、准确、简便且可视化的分析方法。
第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
LA T E R A L FLO W T E S T S T R IP O F V E D A LA B
30
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的抗 体1＋标本中待测 抗原＋金标记的 抗体2显色
• 用于测抗原
原 • 是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术 理 • 将结合各的种以反应微试孔剂滤分膜点为固载定体在的测快试速版的相固应相
• 通区膜域过免，毛疫检细分测析管标作技用术本加使在样试品纸溶条 液的 在一 层端析材料 上泳动，样本中的待测物与层析材料中 的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特 定区域（检测线），通过标记抗体显色
§ 最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为 载体的免疫测定技术
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术具有简单、快速、灵敏等特 点，得到了广泛应用
§ 20世纪90年代兴起的胶体金免疫层析技术，特 别是试纸条的发展，使操作更加方便快捷
§ 胶体金标记免疫检测技术在临床医学检测、激 素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速 检测，以及抗原抗体分析等诸多领域迅速发展
食品 食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精
安全 各监管部门
等）,大肠杆菌,黄曲霉素
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
—
瘦 肉 精
克 伦 特 罗
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
—
兽 药
恩 诺 沙 星
致病菌--大肠杆菌O157
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1、1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1、2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1、3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留
胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留周萍;李樱红;尹志红;吕泽田;尹君;王静;徐初【摘要】建立了胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留的检测方法.样品在碱性条件下溶解稀释,20％高氯酸溶液除杂过滤后,加入碱化剂适量,经乙酸乙酯提取,盐析净化后,再用乙酸乙酯提取吹干,加入正己烷和复溶液溶解后,用胶体金快速检测试剂板快速检测.结果表明,胶体金免疫层析法对蜂胶及蜂胶提取物中氯霉素残留量的检测限分别为0.1μg/kg和0.2μg/kg.经高效液相色谱-串联质谱确证,假阳性率和假阴性率均为0％.该方法操作简单、灵敏度高、准确可靠,可用于加工蜂胶及蜂胶乙醇提取物过程中对氯霉素残留量的质量控制.【期刊名称】《中国蜂业》【年(卷),期】2019(070)005【总页数】5页(P68-72)【关键词】蜂胶;蜂胶乙醇提取物;氯霉素;胶体金免疫层析法【作者】周萍;李樱红;尹志红;吕泽田;尹君;王静;徐初【作者单位】杭州碧于天保健品有限公司,桐庐311500;浙江省食品药品检验研究院,杭州310052;杭州碧于天保健品有限公司,桐庐311500;中国蜂产品协会蜂胶专业委员会,北京100050;杭州碧于天保健品有限公司,桐庐311500;杭州碧于天保健品有限公司,桐庐311500;杭州碧于天保健品有限公司,桐庐311500【正文语种】中文蜂胶是工蜂采集胶源植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性物质[1]。
蜜蜂主要用蜂胶堵塞蜂巢缝隙，以防止有害细菌、病毒或真菌的入侵，保证蜂箱洁净卫生。
蜂胶的化学成分复杂，含有多种活性物质，其功效成分主要为黄酮类、酸类、酯类化合物等[2]。
《中华人民共和国药典》（2015年版一部）载明蜂胶补虚弱，化浊脂，止消渴；外用解毒消肿，收敛生肌；用于体虚早衰，高脂血症，消渴；外治皮肤皲裂，烧烫伤[3]。
蜂胶凭借独特的医疗保健作用，正越来越受到消费者的青睐。
胶体金法操作注意事项
胶体金法操作注意事项全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：胶体金法是一种将金属离子还原成金属纳米粒子的技术，广泛应用于纳米材料制备、生物医药、传感器等领域。
在进行胶体金法操作时，有一些注意事项需要遵守，以确保实验顺利进行并获得理想的结果。
实验室安全是最重要的一点。
在进行胶体金法操作时，通风良好的实验室环境是必要条件。
操作人员应戴好实验室防护眼镜、手套等防护用具，避免金属离子或其他化学物质对皮肤和眼睛的刺激。
胶体金法操作中需要使用高纯度的试剂。
金属离子溶液、还原剂、稳定剂等试剂应该经过严格的处理和净化，以确保实验的准确性和可重复性。
实验器材也需要经过严格的清洁和消毒处理，避免杂质对实验结果的影响。
实验中需要严格控制反应条件。
胶体金纳米粒子的形貌和粒径大小受到反应条件的影响，如温度、pH值、还原剂浓度等。
操作人员需要根据实验要求精确控制反应条件，避免因条件不当导致实验结果不稳定或无法复制。
实验过程中需要定期监测反应的进行情况。
通过观察反应体系的颜色、浑浊度等变化情况，可以了解反应的进行情况，并及时调整操作步骤。
在操作过程中，遇到异常情况如反应失控、溶液溢出等，应立即停止操作并进行处理，避免事故发生。
实验后需要对产物进行适当的处理和储存。
胶体金纳米粒子具有一定的稳定性，但在长时间保存过程中仍可能发生聚集或变性现象。
操作人员需要选择合适的稳定剂、储存条件等手段，保证产物的质量和活性。
胶体金法是一种有效的制备金纳米材料的方法，但在操作过程中需要遵守一系列注意事项，以确保实验顺利进行并获得理想的结果。
只有严格按照操作规程进行操作，准确控制反应条件，及时监测反应的进行情况，对产物进行适当处理和储存，才能保证实验的成功和产物的质量稳定。
希望以上内容对胶体金法操作有所帮助。
第二篇示例：胶体金法是一种常用的合成纳米材料的方法，其中金纳米颗粒通过还原金盐来制备。
在进行胶体金法操作时，需要遵守一定的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。
胶体金检测技术
3.检测时，避免阳光直射和电风扇、空调的风直吹 尿样一开始在NC膜上泳动时，是利用毛细管作用，如
1.1939年（英，植物）Kausche和Ruska把烟草叶病毒吸 附在金颗粒上，在电子显微镜下观察呈现高电子密度的细状 颗粒，开启了免疫胶体金技术的研究。 2.1971年（美，微生物）Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌 抗血清与胶体金颗粒结合，用直于检测沙门菌的表面抗原。 3.1974年（奥）Romano等将胶体金标记在马抗人IgG上， 实现了间接免疫金染色法。同年Bauer等报道将胶体金标记 在凝集素上的应用。
待检尿样检测区出现红色条带为阴性 待检尿样检测区不出现红色条带为阳性
阳性结果 样品中可能含有等于或高于3ng/ml的盐酸克伦特罗。
培训资料
四、ß-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍
以盐酸克伦特罗胶体金快速检测卡为例
一．适用范围： 主要用于定性检测，测定动物尿液，如猪尿、牛尿、羊 尿等样品中盐酸克伦特罗的残留。整个检测过程只需要 5~10分钟左右，灵敏度为3 ng/ml(3ppb)。也就是说当 尿液中盐酸克伦特罗的残留大于或等于3 ng/ml时，检测 卡才能检测到。
规定尿液中盐酸克伦特罗的胶体金免疫层析测定方法。适用于 猪、牛尿液中盐酸克伦特罗的筛选，最低检测浓度为3ng/ml。
培训资料
-------结果判定依据
阴性对照出现红色条带，阳性对照不出现红色条带，说 明检测卡有效。
如阴性对照不出现红色条带，或阳性对照出现红色条带， 出现任何一种现象或两种同时出现，说明检测卡失效。
胶体金免疫层析试验须注意的几个问题
胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。
此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。
目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。
1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。
胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。
层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。
而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。
其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。
目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。
胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。
1 胶体金颗粒大小的选择胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。
我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。
各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。
由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。
食品检测中胶体金免疫层析技术的运用
食品检测中胶体金免疫层析技术的运用摘要：免疫层析法是一红新型的快速免疫分析技术，其中融合了色谱层析技术与免疫技术，近年来随着胶体金免疫层析技术的发展，其在食品检测当中取得了广泛的应用，本文就主要结合胶体金免疫层析技术的特点，对免疫层析技术在食品检测中的应用予以分析。
关键词：食品检测；胶体金；免疫层析技术相对于其他类型的食品检测技术，胶体金免疫层析技术具有操作简便、快速、检测效果好等诸多的优点，这使得其在食品检测领域的应用越来越广泛，不仅仅能够提升检测准确率，还能够有效的提升检测特异性与敏感度。
一、免疫层析类型按照免疫层析中抗原与抗体结合方式的不同，可将免疫层析分为两类：非竞争性免疫层析和竞争性免疫层析。
非竞争性免疫层析即双抗体夹心法。
将着色标记物（一般采用胶体金）与待测抗原的特异性抗体（Ab1）相偶联，并将其沉积在结合区上。
当样品（尿、血浆、饮料等）加到样品区后，由于毛细管作用，样品迅速浸透结合区，带有标记物的Ab1被溶解，并在上部材料吸水涨力的牵引下随着样品溶液沿膜条向前移动。
若样品中存在待测抗原，它就会和带有标记物的Ab1结合形成Ag-Ab1[1］。
随后，样品通过固相化有捕获抗体（一般是待测抗原的另一表位特异性抗体Ab2）的检测线（testline）区域时，Ag-Ab1复合物被捕获，形成Ab1-Ag-Ab2复合物。
一部分未与Ab1结合的样品继续前移，通过固相化有抗Ab1抗体（Ab3）的质控线（controlline）区域，形成Ab3-Ab1复合物。
这种方式通常用于检测带有多个抗原位点的分析，常用于致病细菌、大分子蛋白质等的检测等。
竞争性免疫层析：将着色标记物与待测抗原的特异性抗体（Ab1）相偶联，沉积在结合区。
而检测区处固相化的是待测抗原或待测抗原的类似物。
若样品中含有待测抗原，则样品中的抗原和带有标记物的Ab1形成Ag-Ab1复合物。
随后在通过固相化有待测抗原或其类似物的检测区时，由于竞争抑制，不再发生反应，检测线处不显色；样品继续前移，Ag-Ab1复合物被固相化在质控线处的抗Ab1抗体（Ab2）所结合，形成Ab1-Ag-Ab2复合物，使质控线显色。
动物源性食品中喹诺酮类物质快速检测胶体金免疫层析法（KJ202206）
动物源性食品中喹诺酮类物质快速检测胶体金免疫层析法（KJ202206）附件6动物源性食品中喹诺酮类物质的快速检测胶体金免疫层析法(KJ202206)1 范围本方法规定了动物源性食品中喹诺酮类物质的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、猪肉、猪肝、猪肾中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、噁喹酸残留的快速测定。
2 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。
样品中的喹诺酮类物质与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化，通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中喹诺酮类物质进行定性判定。
3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1 乙腈。
3.1.2 甲酸。
3.1.3 分散固相萃取剂I：分别称取硫酸镁18g、醋酸钠4.5g放于研钵中研碎。
3.1.4 分散固相萃取剂II：分别称取硫酸镁27g、N-丙基乙二胺（PSA）4.5g放于研钵中研碎。
3.1.5 甲酸-乙腈溶液：98mL乙腈中加入2mL甲酸，混匀。
3.1.6 甲醇。
3.1.7 稀释液：脱脂奶粉︰水（1︰10）。
3.2 参考物质喹诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。
表1喹诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量序号中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量1洛美沙星Lomefloxacin98079-51-7C17H19F2N3O3351.352培氟沙星Pefloxacin70458-92-3C17H20FN3O3333.363氧氟沙星Ofloxacin82419-36-1C18H20FN3O4361.374诺氟沙星Norfloxacin70458-96-7C16H18FN3O3319.335达氟沙星Danofloxacin112398-08-0C19H20FN3O3357.386二氟沙星Difloxacin5522-39-4C28H33N3F2449.587恩诺沙星Enrofloxacin93106-60-6C19H22FN3O3359.168环丙沙星Ciprofloxacin85721-33-1C17H18FN3O3331.139氟甲喹Flumequine42835-25-6C14H12FNO3261.2510噁喹酸OxolinicAcid14698-29-4C13H11NO5261.23注：或等同可溯源物质。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常有影响要素剖析自胶体金作为特别标记物进行研究以来 ,成立的各样免疫胶体金技术以其特异性强、敏捷度高、操作简捷等特色 ,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被宽泛应用。
免疫胶体金技术的反响过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动向联合的反响过程 ,在这个过程中每个环节的利害都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又遇到好多要素的影响和限制 ,下边将影响免疫胶体金技术的要素作一剖析 ,为成功制备胶体金检测产品供给参照。
1耗材的选择1.1 不一样型号膜的挑选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要 ,作为反响载体影响到整个试验的成败。
不一样的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的根源、种类和数目均大不同样 ,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和散布构造不一样。
膜孔径减小 ,膜的实质可用表面积递加 ,膜联合蛋白的量也递加 ;膜孔径越小 ,层析速度也越慢 ,金标复合物经过 T 线的时间就越长,反响也就越充分 ;所以膜孔径越小敏捷度越高 ,可是同时也减慢了跑板速度 ,增添了非特异性联合的时机 ,也就是假阳性越高。
用于金标免疫迅速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素 / 醋酸纤维素混淆膜 ,不一样的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应依据蛋白质的性质选择适合孔径大小和散布构造的膜 ,找到适合的均衡点 ,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最正确。
1.2 联合垫的选择。
联合垫位于层析系统的中间 ,一般要求联合垫的网格均一且非特异性吸附低 ,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品 ,而不被吸附 ;玻璃纤维素膜具备以上长处 ,同时拥有必定的硬度 ,为试验中常用。
1.3 样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应依据试纸条检测样品的性质选择适合的样品垫和吸水纸 ,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或许改变样品的性质。
胶体金免疫层析试验注意事项
胶体金免疫层析试验注意事项胶体金免疫层析试验，这东西就像一场微观世界里的小竞赛，想要顺利完成它，可得多留几个心眼儿。
做这个试验，样本的采集那是相当重要的。
就好比你要做一道好菜，食材得新鲜优质才行。
如果是采集血液样本，扎针的手法得稳准狠。
可别像新手厨师切菜，哆哆嗦嗦的。
采血的时候，消毒要彻底，不然就像做菜不洗干净食材，容易混进杂质，影响试验结果。
要是采集的是其他样本，比如尿液或者唾液，也得保证样本的纯净度，不能被其他东西污染了。
试验的环境也不能马虎。
这就像运动员比赛得有个合适的场地一样。
温度和湿度都得合适，温度太高或者太低，胶体金可能就不听话了。
就像人在过热或者过冷的环境里会没精神一样，胶体金在不合适的温度下活性也会受影响。
湿度太大，那些检测试纸可能就受潮了，就像饼干受潮变得软趴趴的，检测结果就不准了。
检测试纸的保存也是个大问题。
把它想象成珍贵的茶叶，得好好保存。
要放在干燥、阴凉的地方，避免阳光直射。
要是把检测试纸放在大太阳底下晒着，那就和把茶叶放在烤箱里一样，试纸的性能肯定大打折扣。
而且打开包装之后，要尽快使用，不能让它在外面暴露太久，就像打开的零食要尽快吃完，不然就容易变质。
在进行试验操作的时候，操作手法要规范。
这就跟绣花似的，一针一线都得讲究。
加样的时候，量得准确，不能多也不能少。
多了就像煮汤的时候水放太多，味道都淡了，结果就不准确了。
少了呢，又像炒菜盐放少了，没味道，也得不出正确的结果。
滴加样本的时候，要垂直滴加，可不能歪着滴，不然就像倒水的时候歪着杯子，水会洒出来一样，样本滴加不均匀，也会影响检测。
判读结果的时候，那可不能心急。
要按照规定的时间去看结果，不能提前也不能推后。
提前看结果就像菜还没煮熟就急着吃，肯定不对。
推后看结果呢，就像饭都放凉了才吃，也不是原本的味道了。
而且判读的时候要仔细，要清楚知道什么样的条带是阳性，什么样的是阴性，就像认识不同的水果一样，苹果是苹果，香蕉是香蕉，不能混淆。
免疫胶体金层析法的原理
免疫胶体金层析法的原理免疫胶体金层析法是一种常用的生物分析技术，主要用于检测和分离生物样品中的特定分子。
其原理基于胶体金颗粒在特定条件下与抗原-抗体相互作用而发生的可见光学变化。
胶体金是一种具有特殊光学性质的纳米材料，其表面可以修饰上特定的抗体。
在免疫胶体金层析法中，首先将待检测的抗原样品与标记有特定抗体的胶体金颗粒相混合。
当抗原与抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
这些复合物在溶液中具有一定的电荷，会影响胶体金颗粒的稳定性。
之后，将混合物置于层析膜上，这是一种特殊的过滤膜，具有特定的孔径大小。
混合物在层析膜上进行渗透层析。
由于抗原-抗体复合物较大，其在层析膜上的渗透速度较慢，而未结合的胶体金颗粒则能够更快地通过层析膜。
最终，在层析膜上形成了不同区域，其中包括有含有抗原-抗体复合物的区域和只含有未结合胶体金颗粒的区域。
这种区域的形成可以通过肉眼观察或者使用特定的检测设备来实现。
由于胶体金颗粒的特殊光学性质，当抗原-抗体复合物存在时，溶液的颜色会发生变化，通常由红色变为紫色或蓝色。
通过观察颜色变化的位置和程度，就可以判断样品中是否存在特定的抗原。
这种免疫胶体金层析法具有简单、快速、灵敏等优点，广泛应用于临床诊断、食品安全检测、环境监测等领域。
除了上述基本原理外，免疫胶体金层析法还可以通过不同的改进和优化来适应不同的应用需求。
例如，可以通过调节胶体金颗粒的大小和表面修饰来改变其稳定性和灵敏度。
此外，还可以利用纳米技术的进展，将免疫胶体金层析法与其他分析技术相结合，进一步提高检测的灵敏度和准确性。
免疫胶体金层析法是一种基于抗原-抗体相互作用的生物分析技术。
通过胶体金颗粒的特殊光学性质以及层析膜的选择，可以实现对特定抗原的快速检测和分离。
该方法具有简单、快速、灵敏等优点，广泛应用于生命科学研究和临床诊断等领域。
随着纳米技术的发展，相信免疫胶体金层析法在未来会有更加广泛的应用前景。
胶体金免疫层析法原理
胶体金免疫层析法原理胶体金免疫层析法是一种常用的生物化学分离技术，它利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合来实现对生物分子的快速、准确检测和分离。
胶体金颗粒具有良好的生物相容性、分散性和表面活性，因此在生物医学领域得到了广泛的应用。
该方法的原理是利用抗原与抗体的特异性结合，将胶体金颗粒标记在抗原或抗体上，形成胶体金-抗原/抗体复合物，然后通过免疫层析技术将目标分子与其他非特异性结合的物质分离开来。
这种方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点，因此在临床诊断、生物学研究和生物制药等领域得到了广泛的应用。
胶体金免疫层析法的操作步骤主要包括样品处理、制备试剂、样品加载、洗涤和检测等几个步骤。
首先，需要对样品进行预处理，将目标分子从样品中提取出来。
然后，制备胶体金-抗原/抗体复合物，并将其加载到固相载体上。
接下来进行洗涤步骤，将非特异性结合的物质去除，最后通过检测手段对目标分子进行定量或定性分析。
胶体金免疫层析法的优势在于其操作简便、快速高效、具有较高的特异性和灵敏度。
同时，由于胶体金颗粒的小尺寸和良好的生物相容性，使得该方法在生物医学领域具有广泛的应用前景。
例如，在临床诊断中，可以利用该技术对各种疾病标志物进行检测，实现快速、准确的诊断；在生物学研究中，可以用于蛋白质、核酸等生物分子的检测和分离；在生物制药领域，可以用于药物的质量控制和疫苗的研发等方面。
总之，胶体金免疫层析法作为一种快速、准确、灵敏的生物化学分离技术，具有广泛的应用前景。
随着生物医学技术的不断发展和完善，相信胶体金免疫层析法将在临床诊断、生物学研究和生物制药等领域发挥越来越重要的作用，为人类健康事业做出更大的贡献。
胶体金免疫层析试纸条原理
胶体金免疫层析试纸条原理胶体金免疫层析试纸条（Colloidal Gold Immunochromatographic Strip）是一种通过胶体金纳米颗粒与抗体互作用检测特定生物标志物的生物分析方法。
胶体金免疫层析试纸条是一种基于抗体与抗原特异性结合的快速检测试剂，具有简单、快速、灵敏、特异性和便携等优点。
胶体金免疫层析试纸条的原理是利用胶体金纳米颗粒的特性与生物分子相互作用，完成快速检测分析。
试剂条通常由三个部分组成：采样孔、检测膜和吸收纸。
其中检测膜是由贴在聚丙烯酸纤维膜上的抗体分子组成。
检测过程中，样品通常在采样孔处进入试剂条，并沿着检测膜滤过。
样品中的目标分子与膜上的抗体分子结合，并形成膜上的免疫复合物。
在此过程中，胶体金纳米颗粒被添加进样品中。
这些胶体金纳米颗粒上载有反向包被（reverse electrophoretic coating），使胶体金纳米颗粒呈负电荷状态，防止颗粒之间发生不可逆聚集作用。
在测试区和控制区之间的吸收纸层包括了大量的胶体金纳米颗粒。
当测试完成时，样品和胶体金纳米颗粒将被移动到吸收纸层，并进一步与该层的各种化学试剂和物质反应。
控制区内的抗体分子能够与胶体金纳米颗粒发生特异性结合，从而产生红色的线条。
胶体金免疫层析试纸条是一种快速、可视化的生物分析方法，通过免疫反应，通过控制区和测试区之间可见免疫反应条带的形成，快速检测并定性或半定量特定生物标志物。
胶体金免疫层析试纸条的应用范围较广，主要应用于临床检测、环境监测和食品安全等领域。
在临床检测方面，胶体金免疫层析试纸条被广泛应用于诊断感染性疾病，如肺炎、流行性感冒、艾滋病和病毒性肝炎等。
胶体金免疫层析试纸条还可被用于检测肿瘤标志物。
在环境监测方面，胶体金免疫层析试纸条可被用于检测重金属、农药残留、水质监测和气体污染等。
在食品安全方面，胶体金免疫层析试纸条可被应用于检测食品中的防腐剂、色素、激素和有毒污染物等。
胶体金免疫层析试纸条具有多种优势。
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胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。
此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。
目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。
1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。
胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。
层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。
而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。
其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。
目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。
胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。
1 胶体金颗粒大小的选择
胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。
我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。
各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。
由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。
在胶体金免疫层析试
验时，我们既要灵敏度高，又要特异性强，所以，我们在选择胶体金颗粒的大小时应慎重。
2 最佳pH值的选择
胶体金与蛋白质的结合成功与否，与胶体金溶液的pH值有很大关系。
胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果等于或低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。
如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷产生排斥而不能互相结合。
我们将已制备好的胶体金用0.1M K2CO3调不同的pH，各取1ml分别放在不同的试管内，加入抗HBsAg单抗，5分钟后分别加入0.1ml 10％NaCl，混匀后静止2hr，离心，结果见表2，最适pH为6.9[4]。
由表2看出，随着pH值的升高，其灵敏度会下降，一般来说，能使标记后离心沉淀物完全溶解的最低pH再加0.1－0.2即为标记物的最佳pH值。
不同的抗原及抗体其等电点不同，操作中一定要认真试验，选择合适的pH值。
3 最佳蛋白量的选择
标记蛋白的量对胶体金的稳定性起决定作用。
我们将抗HBsAg单抗稀释为不同浓度，分别加入装有1ml胶体金的试管内，5分钟后分别加入0.1ml 10％NaCl，混匀后静止2hr，离心，结果见表3，最佳标记蛋白量为11μg/ml。
由表3可看出：未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，胶体金标记物离心后呈现由完全不溶到部分溶解的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金标记物的离心后完全溶解。
其中含蛋白量最低胶体金标记物离心后完全溶解的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量，在此基础上再
加上20%即为稳定所需蛋白质的实际用量。
标记蛋白的量对胶体金的稳定性起决定作用。
为了达到最高的标记率又不致于浪费原材料增加成本，应根据不同的产品选择不同的最佳蛋白标记量。
4 微孔滤膜的选择
微孔滤膜是胶体金免疫层析试验中的一种重要原材料，起载体作用。
微孔滤膜与免疫层析试验中灵敏度、特异性、本底及速度有很大关系。
微孔滤膜根据其实用的基础材料不同而有多种类型。
如硝酸纤维膜（NC），醋酸纤维模，尼龙膜，PVDF膜，硝酸、醋酸混合膜等，其中NC膜和尼龙膜的蛋白结合能力较强，但尼龙膜易产生较重的本底，故一般选择NC膜作为包被载体。
蛋白质的结合能力不仅与微孔滤膜的原材料有关，而且与膜的孔径有关。
一般来讲膜孔径越小，蛋白结合能力越大，但液体的迁移速度越小；膜孔径越大，蛋白结合能力越小而液体的迁移速度越大，所以在筛选NC膜时，不仅要考虑膜吸附蛋白的能力，而且要考虑含有胶体金颗粒的液体在膜上的迁移速度。
我们曾对上海、北京、美国、德国等国内外不同厂家生产的NC膜进行试验。
结果见表4。
从表4可以看出，NC膜与灵敏度、特异性、本底及速度的关系，因此，在实际选择NC膜的过程中，应综合考虑，既要顾及产品的灵敏度，又要顾及其特异性、本底及迁移速度，选择不同的产品最适宜的NC膜。
5 包被浓度的选择
胶体金免疫层析试纸条在NC膜上一般划有两条线，一条检测线，包被有抗体（抗原），用于捕捉样品中的抗原（抗体）；另一条是质控线，用于测试条本身的质控。
将纯化的抗CEA单抗和兔抗鼠IgG分别用0.1、0.5、1、2、4、6mg/ml的浓度划线点样，与同一批冻干金标结合物玻璃纤维装配成试纸条。
结果见表5。
由表5可看出，如果包被浓度太低，其灵敏度不够，质控线不深。
采用抗CEA单抗2mg/ml、兔抗鼠IgG 4mg/ml 的包被量即可满足所需灵敏度的要求，增加包被抗体的浓度不能提高测试灵敏度。
增加兔抗
鼠IgG的浓度反而会影响其特异性，这是因为兔抗鼠IgG的浓度过高，NC膜包被线已达到饱和，多余的兔抗鼠IgG在膜的处理过程中，很容易脱落进入液体内到达检测线位置而与抗CEA单抗结合，从而造成假阳性。
因此，在胶体金免疫层析试验选择抗体或抗原的包被浓度时，为了达到检测的高灵敏度及特异性而又不致于浪费原材料增大成本，应选择一组合适的包被浓度。
在胶体金免疫层析试验中，除上述几点外，与此相关的其他内容如筛选和纯化抗体、胶体金标记物的制备及干燥、抗体包被的温度及时间、封闭液及封闭温度及时间的选择以及选择助溶剂等，也是不容忽视的重要环节。
胶体金免疫层析试验是一个非常复杂的过程，十几种原辅料均集中在一个试纸条上，并且样品在反应过程中没有洗涤，时间很短就完成，这就要求试纸条不仅要有很高的灵敏度，而且要有很好的特异性。
作为科技工作者，必须以严谨的科学态度，对不同产品的每一步骤、每一环节以及每一种原辅材料，进行大量的、科学的试验，才能制备出符合临床要求的高质量的胶体金免疫层析试纸条。
参考文献
1 沈关心，周汝麟主编等.现代免疫学实验技术，第1版，湖北科学技术出版社，1998：131
2 Beggs M,Novotny M,Sampedro S,etal. A self-performing chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophic(HCG) in urine and serum. Clin Chem. 1990; 36:1084.
3 Osikowicz G, Begge M. One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination of choriogonadotropin in urine. Clin Chem.1990,36:1586.
4 马丽丽，王玉金，杨书豪等.快速乙肝表面抗原胶体金免疫层析测定法的建立及应用，标记免疫分析与临床，1997，4（4）：225－227.。