第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成

第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成免疫细胞都属于血细胞，所有血细胞都来源于造血干细胞。

因此在一定意义上讲，免疫细胞的发育分化就是造血干细胞分化成熟的过程。

第一节 造血干细胞的特性和分化一、造血干细胞的起源和表面标记（一）造血干细胞的起源哺乳动物的造血最早发生在卵黄囊，随后转移到胎肝，胚胎发育中期以后以及出生后，骨髓成为主要的造血场所，并为B细胞发育的中枢免疫器官；胸腺是T淋巴细胞的分化成熟的中枢免疫器官。

早期的造血干细胞是多能造血干细胞（pluripotent hematopoietic stem cell），具有自我更新（self−renewing）和分化（differentiation）两种重要的潜能，赋予机体在整个生命过程中始终保持造血能力。

多能造血干细胞最初分化为共同淋巴样祖细胞和共同髓样祖细胞等等。

（二）造血干细胞的表面标记白细胞分化抗原和单克隆抗体技术的应用，为造血干细胞表面标记的研究及其分离纯化提供了重要的理论和实验依据。

人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit （CD117），不表达谱系（lineage）特异性标记。

（1）CD34：CD34是一种高度糖基化跨膜蛋白，有1%~4%骨髓细胞表达CD34，其中包括了造血干细胞，是造血干细胞的一种重要标记，应用CD34单克隆抗体可从骨髓、胎肝或脐血中分离、富集造血干细胞。

随着造血干细胞的分化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞不表达CD34。

（2）CD117：CD117是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体，是原癌基因c−kit的编码产物Kit。

CD117是属于含有酪氨酸激酶结构的生长因子受体，胞膜外区结构属IgSF。

CD117+细胞约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70%CD117+骨髓细胞表达CD34，因此，CD117也是多能造血干细胞的重要标记。

（3）Lin－细胞：应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、巨核细胞、髓系以及红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A等抗体）结合免疫磁珠分离的方法，除去骨髓、胎肝单个核细胞中上述各个谱系发育不同阶段的细胞，所留下的细胞称为谱系阴性（Lin－）细胞，主要为早期造血干细胞。

二、造血干细胞的分化（一）多能造血干细胞的分化应用同系小鼠骨髓细胞输注给经射线照射的小鼠，可在受体小鼠脾脏内形成由单一骨髓干细胞发育分化而来的细胞集落，包括红细胞、粒细胞或巨核细胞等，此称为脾集落形成单位（colony forming unit−spleen，CFU−S）。

随后，用半固体培养技术，在含有造血生长因子存在条件下，干细胞在体外可分化为不同谱系的细胞集落，称为体外培养集落形成单位（colony forming unit−culture，CFU−C）。

CFU−S和CFU−C主要用于髓样干细胞中各谱系的研究。

80年代后，胚胎胸腺器官培养（FTOC）技术的建立，为淋巴样干细胞分化的研究提供了重要的手段。

骨髓、胸腺造血微环境是造血干细胞发育分化的必要条件。

在体外干细胞或祖细胞培养中，骨髓或胸腺基质细胞对于支持干细胞的生长和促进分化起着关键的作用。

目前认为，骨髓、胸腺等造血微环境主要通过以下机制维持造血干细胞的自我更新和分化：①分泌细胞因子或其它介质，如胸腺基质细胞分泌的细胞因子（如IL−7）及肽类分子胸腺激素、胸腺素、促胸腺生成素是胸腺中T细胞成熟的重要条件；骨髓基质细胞分泌的IL−7是诱导祖B细胞（pro−B）向前B细胞（pre−B）分化的关键细胞因子；骨髓及胸腺基质细胞还可产生多种集落刺激因子（CSF），刺激不同谱系发育不同阶段细胞的生长和分化。

②造血微环境基质细胞通过黏附分子以及分泌的细胞外基质与干细胞及其分化的血细胞相互作用，提供必要的刺激信号。

（二）定向干细胞及其分化多能造血干细胞最初分化为定向干细胞，包括淋巴样干细胞（lymphoid stem cell）或称淋巴样祖细胞（lymphoid progenitor），以及髓样干细胞（myeloid stem cell）或称髓样祖细胞（myeloid progenitor）。

淋巴样干细胞继续分化为B细胞、T细胞和NK细胞，髓样干细胞继续分化为具有产生红系、粒细胞系、巨核系和单核/巨噬细胞系潜能的集落形成单位CFU−GEMM，CFU−GEMM可分别分化为中性粒细胞、单核/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，以及红细胞与巨核细胞/血小板。

其中中性粒细胞与单核/巨噬细胞在发育分化过程中共有一种前体细胞。

1．髓样干细胞及其分化（1）红系：红细胞生成素（EPO）是红系分化中最为重要的生长因子。

髓样干细胞体外培养在EPO和SCF存在条件下，可形成由许多细胞组成形如爆发火花样的集落，称为爆式红系前体形成单位（burst formimg unit−erythroid precursor，BFU-E），进一步分化可形成细胞数较少的红细胞集落形成单位（colony forming unit−erythrocyte，CFU−E）。

（2）巨核系：血小板生成素（TPO）是巨核细胞/血小板谱系分化中关键的生长因子。

髓样干细胞在TPO和其他造血生长因子（如IL-6, IL-11）存在条件下，体外可形成巨核细胞集落形成单位（colony forming unit−megakaryocyte，CFU−Meg）。

（3）粒单系：CFU−GEMM在GM−CSF、SCF和IL-3等生长因子的刺激下，可进一步分化为粒细胞单核细胞共同前体集落形成单位（colony forming unit−common precursor of granulocyte and monocyte，CFU−GM），CFU−GM在G−CSF/GM−CSF或M−CSF/GM−CSF诱导下分别分化为中性粒细胞和单核/巨噬细胞两个不同的谱系。

（4）嗜酸性粒细胞：CFU−GEMM在GM−CSF、IL−5和IL−3诱导下，可分化为嗜酸性粒细胞集落形成单位（CFU−Eos），进而分化成熟为嗜酸性粒细胞。

（5）嗜碱性粒细胞：CFU−GEMM在IL−5、TGF−β诱导下分化为嗜碱性粒细胞集落形成单位（CFU−Baso），在IL−3和IL−4存在下可进一步分化成熟为嗜碱性粒细胞。

2．淋巴样干细胞及其分化在免疫系统中，每个T细胞和B细胞克隆通过其抗原受体TCR和BCR特异性识别相应抗原，所有T细胞克隆和B细胞克隆的总和分别组成了T细胞库（repertoire）和B细胞库，赋予了免疫系统可识别周围环境中几乎所有抗原的潜力。

因此，T细胞和B细胞的发育分化过程中首先是功能性TCR和BCR形成的过程。

具有功能性识别抗原的淋巴细胞在发育分化为功能性T及B细胞后，在相应抗原刺激后发生活化和克隆的扩增，并分化为效应细胞，产生效应分子，识别和清除相应的抗原。

成熟T细胞和B细胞的这种特性称为免疫适能（immunological competence）。

（1）T细胞谱系：T细胞在胸腺发育过程中获得功能性TCR的表达、自身MHC限制以及自身免疫耐受（图12−1）。

① TCR α和β链基因重排：αβ T细胞约占T细胞95%~99%，γδ T细胞约占1%~5%。

胸腺细胞在CD4− CD8−双阴性（DN）阶段β链基因开始重排；β链即有表达，并与前T细胞替代α链pTα（pre T cell α）组装成pTα:β，表达于前T 细胞（pre−T）表面，IL−7R的表达对这个时期的分化发育至关重要，在IL-7提供下pre−T后期增殖活跃，并经β选择，向T细胞发育。

进而，分化至CD4+ CD8+（DP）细胞，此阶段pTα: β下调，细胞停止增殖，α链基因重排，并表达有功能性的TCR αβ。

② CD3以及辅助受体CD4和CD8的表达：按照CD4和CD8分子表达的格局可分为双阴性、双阳性和单阳性三个阶段。

1）双阴性阶段：进入胸腺的淋巴样干细胞不表达CD3、CD4及CD8（DN）。

2）双阳性阶段：发育中T细胞开始表达CD4+ CD8+（DP），CD3表达水平较低，随后功能性TCR αβ也开始表达，CD3表达水平逐渐升高。

3）单阳性阶段：在胸腺皮质中，同胸腺上皮细胞表面抗原肽−MHCⅠ类或Ⅱ类分子复合物以适当亲和力发生特异结合的DP细胞可继续分化为单阳性（SP）细胞，其中与Ⅰ类分子结合的DP细胞CD8表达水平升高，CD4表达水平下降直至丢失，而与Ⅱ类分子结合的DP细胞，CD4表达水平升高，CD8表达水平下降最后丢失；不能与抗原肽−MHC发生有效结合或亲和力过高的DP细胞在胸腺皮质中发生凋亡，此类易凋亡细胞占DP细胞的95%以上。

此过程称为胸腺的阳性选择（positive selection）。

经阳性选择的DP细胞存活，并分化为SP细胞，使T细胞获得了在识别过程中自身MHC限制能力。

阴性选择（negative selection）：SP细胞在皮髓质交界处及髓质区，与胸腺树突状细胞、巨噬细胞表面抗原肽−MHCⅠ类或Ⅱ类分子发生高亲和力结合者，则被删除，以保证进入外周淋巴器官的T细胞库中不含有针对自身抗原成份的T细胞，此过程也是T细胞获得中枢免疫耐受的主要机制。

经过胸腺中发育的三个阶段以及阳性选择和阴性选择后，具有单阳性标记的TCR+CD4+CD8-及TCR+CD4-CD8+细胞，迁入胸腺髓质区，经历功能成熟发育，并进一步消除自身应答细胞，产生具有自身MHC限制以及自身免疫耐受的成熟T细胞，迁出胸腺，进入外周T细胞库。

（2）B细胞谱系：哺乳动物的B细胞是在骨髓中发育成熟的，其发育阶段经历了祖B细胞（pro−B cell）、大前B细胞（large pre−B cell）、小前B细胞（small pre−B cell）、未成熟B细胞（immature B cell）和成熟B细胞（mature B cell）或称初始B细胞（naive B cell）等几个阶段。

B细胞发育过程中重要的生化事件几乎都是围绕着功能性BCR的表达和中枢免疫耐受的形成（图12−1）。

① Ig重链、轻链基因重排：祖B细胞重链可变区基因先后发生D−J和V−DJ 重排；到大前B细胞阶段由于VDJ重排的完成，可表达完整的μ链，并作为pre−B 细胞受体的一部分表达于大前B细胞表面；分化到小前B细胞阶段，轻链的V−J 发生重排；未成熟B细胞可表达完整的mIgM，只表达mIgM的未成熟B细胞部分可输出骨髓，进入外周，如受到抗原刺激，则发生免疫耐受，这是B细胞中枢免疫耐受的主要机制；成熟B细胞同时表达mIgM和mIgD，抗原刺激后一般发生免疫正应答，使B细胞活化增殖，进一步分化为分泌Ig的浆细胞。