酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答试验条件的优化
免疫酶斑点试验
应用领域
临床诊断
药物筛选
用于检测感染性疾病、自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的相关抗原或抗体，辅助临床 诊断和制定治疗方案。
用于筛选和鉴定药物的靶点、研究药物的 免疫活性等。
食品安全检测
环境监测
用于检测食品中的病原微生物、毒素等有 害物质。
用于检测环境中的有害物质、污染物等， 保障环境安全。
02
免疫酶斑点试验的原理与技术
肿瘤
免疫酶斑点试验也可用于肿瘤标志物的检测，如癌胚抗原、甲胎蛋白 等，有助于肿瘤的早期发现和监测。
在药物研发中的应用
新药筛选
免疫酶斑点试验可用于筛选和鉴定具有药理活性的小分子 化合物，为新药研发提供有力支持。
药物代谢研究
通过免疫酶斑点试验可以研究药物在体内的代谢过程，了 解药物在体内的分布、代谢和排泄情况，为药物设计和优 化提供依据。
04
免疫酶斑点试验的结果分析
阳性结果的判定
01
02
03
斑点颜色明显
如果斑点颜色深且清晰， 与背景形成明显对比，通 常被认为是阳性结果。
斑点大小
斑点大小超过一定阈值通 常被认为是阳性，具体阈 值可能因试验而异。
周围晕圈
在阳性结果中，有时会出 现围绕斑点的浅色晕圈， 这有助于识别阳性斑点。
阴性结果的判定
药物疗效评估
免疫酶斑点试验可检测药物对靶点的抑制作用，评估药物 的疗效和安全性，为临床用药提供参考。
在生物科学研究中的应用
01
蛋白质组学研究
免疫酶斑点试验可用于蛋白质组学研究，检测蛋白质的表达和修饰情况，
了解蛋白质的功能和作用机制。
02
细胞信号转导研究
通过免疫酶斑点试验可以检测细胞内信号转导通路的活性变化，了解细
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点技术
酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
酶联免疫斑点技术 -回复
酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。
本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。
一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。
ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。
通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。
ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。
1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。
在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。
然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。
2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。
首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。
然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。
这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。
最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。
以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。
二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。
1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。
根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
斑点酶联免疫吸附试验原理
斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。
•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。
2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。
•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。
步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。
2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。
3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。
4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。
5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。
6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。
7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。
3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。
•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。
•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。
4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。
•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
酶标免疫法检测血清中肿瘤标记物的方法优化
酶标免疫法检测血清中肿瘤标记物的方法优化近年来，肿瘤已成为人类健康的大敌之一。
早期的肿瘤发现和治疗非常重要，因为早期的诊断和治疗可以大大提高患者的治愈率和生存率，而且使治疗更加便宜和简单。
肿瘤标记物已经成为常规的检测手段之一，酶标免疫法是目前用于检测血清中肿瘤标记物的一种最常见的技术方法，其优点是简单、快速和精确。
酶标免疫法（ELISA）是一种细胞外酶标记技术（也称为酶免疫共振技术），它利用酶和酶标记抗体或抗原对血清中的标记物进行检测。
然而，酶标免疫法并非完美。
除了独特的条件外，它还需要在实验室中高质量的执行，并建立一个可靠的研究方法。
优化方法可以提高酶标免疫法的灵敏度和特异性。
1. 样本的预处理在进行实验之前，样品的预处理至关重要。
如果样本未被正确处理，就会浪费宝贵的试剂并影响实验结果。
对于样品中可能存在的可能的混合物（如治疗药物），必须事先进行适当的提取，以避免妨碍酶标免疫法的敏感性。
此外，还可以使用蛋白分离技术或免疫富集技术，以分离一部分标准肿瘤标记物以改善酶标免疫法的灵敏度。
2. 条件的优化条件的优化是获得最佳酶标免疫法状态的关键之一，包括温度、时间和 pH 值等。
建议测定温度、时间和 pH 值，并对样品进行香草的测试。
亚硫酸盐和苯甲酰化反应是常见的条件优化方法，通过这些方法可以稳定酶标样本并提高酶标法的精度、灵敏度和特异性。
3. 抗体的筛选用于抗体筛选的方法也对酶标免疫法的效果产生了巨大的影响。
匹配的抗体的复杂性和精确性大大提高了酶标免疫法的准确性、灵敏度和特异性。
而且，选择性高的二抗也能提高检测方法的性能。
对于酶标免疫法而言，检测抗体应具有高度的选择性和特异性，以避免交叉反应。
最近，随着多种索引蛋白的发现，抗体库已建立，这种方法可以使抗体的挑选和应用更加精确和可靠。
4. 相关检测技术的改进目前，获取新的抗体相对困难，因此需要对酶标免疫法进行改进。
很多人把酶标法与荧光标记或生物素标记等无标记检测方法融合使用，如分子杂交技术（LBME）和磁性颗粒。
ELISPOT技术原理及其操作
LDA 能够对特异性 CTL 细胞进行定量,曾在很多年中被认为是 CTL 检测的“金标 准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性 T 淋巴细胞(memorial CTL, mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激, 这会加快效应 CTL(eCTL)凋亡,且不能定量测定 eCTL 细胞数量或测定值偏低。其次,该方法较繁 琐,培养时间可长达 2～3 周，而且很容易造成 T 细胞数量损失。
ELISPOT 技术
在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导 的免疫应答(cell mediated immune response , CMI)也是人们所关注的,而 T 细 胞在 CMI 中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研 究 方 法 可 以 使 用 ， 如 ： ELISA （ 酶 标 记 免 疫 附 测 定 法 ， enzyme-linked immunosorbent assay）、流式细胞分析术（flow cytometry）、定量 RT-PCR 以及这里要介绍的近年使用越来越多的 ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术 ——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ,是从单细 胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学 检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被 广泛用于分泌 CK 细胞检测或 ASC 测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术
与 ELISPOT 法相比较,胞内 CK 染色法(intra-cellular CK staining,ICS) 主要 应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的 FACS 法,是检测循环淋巴细胞中 抗原特异性 T 淋巴细胞的可行方法,而 ELISPOT 法却可以检测所有分泌 CK 的 eCTL 。
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
ELISpot检测技术操作要求及质量控制
ELISpot检测技术操作要求及质量控制作者：刘佳来源：《兽医导刊》 2017年第9期酶联免疫斑点检测技术(enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年来发展起来的检测细胞因子免疫学检测技术，是在酶联免疫吸附技术(ELISA) 基础上与细胞培养技术充分结合而建立起来的一种可以在体外检测单细胞水平培养的特异性抗体分泌细胞的新型检测技术，此技术可以快捷、简便的对细胞因子分泌量进行定量，目前已经成为国际公认的抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。
由此可以预见，该检测方法在动物免疫研究领域将会得到广泛应用，发挥其重要作用。
但是，此项技术尚未形成标准化，对细胞含量、细胞浓度、孵育、显色时间等优化条件还没有形成完整体系。
因此，在检测工作实践中，总结实验操作步骤注意事项，提高检测水平，对提高ELISpot技术检测的准确性以及对各个因素进行优化，建立稳定的检测体系具有重要意义。
一、细胞质量控制1. 采血。
选取45 ～ 50 日龄，没有疫苗接种经历的仔猪，从前腔静脉采集外周静脉血，保证无菌操作，抗凝剂抗凝。
采血后轻摇，使血液与抗凝剂充分混匀，避免出现血凝块，影响分离效果。
震荡过于剧烈或保存不当，会出现溶血现象。
2. 淋巴细胞分离。
6 h 内进行外周血单个核细胞(PBMC) 的分离，时间过长会影响活细胞数，淋巴细胞的活细胞比例直接影响酶联免疫斑点的形成。
将稀释好的细胞悬液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液液面上，2 000 转/ 分钟离心10 min，转速不宜过高，否则会使细胞壁破裂。
离心后，离心管中由上至下细胞分为四层，即血浆或者组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞富集层、透明分离液层、红细胞层。
吸出中间环状乳白色PBMC 富集层，吸取方法可以将组织匀浆层用吸管去掉，将乳白色淋巴细胞吸出，也可以直接将吸管插入淋巴细胞富集层吸出。
吸液要慢、稳，避免吸出红细胞。
洗涤后，如果有红细胞存在，可以使用红细胞裂解液，将红细胞去除。
免疫斑点试验的实验报告
免疫斑点试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过免疫斑点试验（ELISPOT）评估特定抗原刺激下，免疫细胞分泌特定抗体或细胞因子的能力。
免疫斑点试验是一种常用的细胞免疫反应检测方法，广泛应用于疫苗开发、免疫诊断和免疫治疗研究。
实验原理：免疫斑点试验是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理发展而来，通过检测细胞因子或抗体在固相上的沉积形成斑点，从而定量分析免疫细胞的分泌活性。
当免疫细胞被特定抗原激活后，它们会分泌细胞因子或抗体，这些分子可以被特定的捕获抗体固定在固相上，随后通过酶标记的检测抗体和底物显色，形成可见的斑点。
实验材料：1. 96孔多孔板2. 细胞培养基3. 特定抗原4. 捕获抗体5. 酶标记的检测抗体6. 底物溶液7. 细胞计数器8. 免疫细胞（如外周血单核细胞）9. 其他必要的试剂和耗材实验方法：1. 将96孔多孔板预先涂覆捕获抗体，封闭未结合位点。
2. 将免疫细胞以适当浓度接种到多孔板中，并加入特定抗原进行刺激。
3. 细胞培养一定时间，使细胞因子或抗体分泌并固定在固相上。
4. 移除培养上清，用洗涤液清洗多孔板，去除未固定的细胞和抗原。
5. 加入酶标记的检测抗体，孵育后再次洗涤。
6. 加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色反应。
7. 颜色反应达到适宜程度后，终止反应，使用ELISPOT分析系统计数斑点。
实验结果：实验结果显示，不同浓度的抗原刺激下，免疫细胞产生的斑点数量有显著差异。
高浓度的抗原能显著提高斑点的数量，表明免疫细胞对抗原的反应性增强。
通过比较实验组和对照组的斑点数量，可以评估免疫细胞的活性和分泌能力。
实验讨论：本实验结果表明，免疫斑点试验是一种灵敏且特异的方法，能够定量分析免疫细胞对特定抗原的反应。
斑点的数量与免疫细胞的活性成正比，可以用来评估免疫应答的强度。
此外，通过优化实验条件，如细胞浓度、抗原浓度和培养时间，可以进一步提高实验的准确性和重复性。
实验结论：免疫斑点试验成功地评估了免疫细胞对特定抗原的反应性，为进一步研究免疫细胞的功能和免疫应答机制提供了可靠的实验数据。
分子医学技能-免疫：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
非无菌
PBST洗板10次
加入生物素标记 的detector Ab
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,
暗处室温孵育20-30分钟
显微镜下观察至斑点形成， 去离子水清洗培养板 室温干燥后
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
一、ELISPOT检测细胞因子实验技术
❖Байду номын сангаас
基
Coating Ab
本
包被培养孔
并经BSA阻断
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数 量的IFN-γ+的T淋巴细胞 ，经下列方 法检测： ▪ ELISPOT ▪ 细胞内细胞因子染色（FACS） ▪ ELISA
X坐标： 106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量 Y坐标： 各检测方法的检测结果
▪ B细胞杂交瘤的筛选
ELISPOT
▪ 化合物和药物免疫学反应的检测
预先将所检测细胞 孵育24-42小时
40C过夜 0.05%PBS-Tween20(PBST)
洗板5次
每孔加入1%BSA阻断
370C孵育1小时
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育5-24小时
或者
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
酶联免疫斑点试验在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的应用价值
酶联免疫斑点试验在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的应用价值【摘要】目的：探讨酶联免疫斑点检测技术（elispot）（t-spot.tb）在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的临床应用价值。
方法：利用elispot检测对结核菌特异抗原刺激反应，分泌γ-干扰素的效应t淋巴细胞数量方法，对72例结核杆菌感染性疾病组和20例健康体检者组的外周血作能分泌结核特异的γ-干扰素的t 淋巴细胞测定，与结核菌纯蛋白衍生物试验（ ppd）、结核抗体检查结果进行比较分析。
结果：t-spot.tb敏感性为 91.7%，较ppd 试验36.1%、抗结核抗体55.6%和ppd试验+抗结核抗体29.2%均明显增高，p值均0.05），而较之结核抗体的特异性 60.0%，在统计学上也具有显著差异（p 0.05），但是较之抗结核抗体的特异性60.0%（12/20）有显著统计学差异（p 3 讨论t-spot·tb是以 t 细胞免疫应答为基础的γ-干扰素（γ-ifn）释放实验，其原理是结核杆菌感染者外周血单核细胞（ pbmc）中存在的特异性 t 细胞在受到抗原早期分泌性抗原靶蛋白 6（ esat-6）和培养滤过蛋白 10 （ cfp-10）刺激后会分泌γ-ifn，释放的γ-ifn 随即与微孔板底部包被的γ-ifn 抗体结合而形成免疫复合物，该复合物再与随后加入的碱性磷酸酶标记的抗抗体结合，继而分解分解随后加入的显色底物溶液而在反应部位形成不溶性色素沉淀斑点。
每一个斑点代表 1 个γ-ifn 分泌细胞（结核特异的效应 t 细胞）。
根据斑点数推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应 t 细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断[3]。
其中抗原 esat-6 和 cfp-10 为结核分枝杆菌和少数非结核分枝杆菌所特有，而不存在于卡介苗及大多数非结核分枝杆菌中[4]，因而从根本上避免了传统结核菌素皮试中所存在的 bcg 交叉抗原反应，从而确保了 t-spot·tb 的高度特异性。
有关酶联免疫斑点实验（ELISpot）常见疑难问题解答
有关酶联免疫斑点实验（ELISpot）常见疑难问题解答酶联免疫斑点实验 (enzyme linked immunospot assay,ELISpot) 是⼀种在96孔板内的⼀百万个细胞中实现对单个分泌细胞进⾏定量检测的新型的免疫酶技术。
灵敏度⾼，易操作，成本相对流式细胞术较低，已被⼴泛应⽤于癌症研究，疾病探索以及疫苗研发等领域。
ELISpot原理：将细胞置于包被有特异性抗体的96孔板中培养，在有刺激的条件下，细胞分泌的细胞因⼦或免疫球蛋⽩会被包被抗体捕获。
移除细胞后，被捕获的细胞因⼦可进⼀步使⽤⽣物素标记的⼆抗来标识，其后再与酶标记的亲和素作⽤，并加⼊底物使其呈⾊，有反应作⽤的细胞会留下直径⼤⼩不等的染⾊斑点。
1. 加⼊细胞到含有（或不含）刺激物中培养；2. 阳性细胞开始分泌细胞因⼦，细胞因⼦就近被包被抗体捕获；3. 移出细胞，清洗板⼦，加⼊⽣物素标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-抗体”夹⼼结构；4. 为了观察膜上斑点的形成，加⼊酶标记的亲和素；5. 加⼊显⾊底物，在酶的催化分解下，⽣成不可溶的⾊素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；6. 斑点计数（可⼈⼯计数，也可⽤⾃动读板仪计数），数据处理，结果分析。
常见疑难问题解答：1.您推荐哪种ELISpot板⼦？我们建议使⽤PVDF膜的96孔ELISpot板⼦，有效结合⼤量捕获抗体，前提是膜⽤⼄醇预处理（即活化）。
2.板的颜⾊是否重要，我应选择⽩⾊板⼦还是透明板⼦？⽩⾊和透明ELISpot板具有相同类型的PVDF膜。
这两种颜⾊在读板仪中略有不同，但并不重要。
（如果有没有添加液体的漏掉的孔，透明的板⼦很容易看见。
）3.包被前为什么要⽤⼄醇对ELISpot板进⾏预处理？ELISpot板⼦的膜具有多孔疏⽔结构。
为了使⼤量捕获抗体能够结合，应该⽤⼄醇处理膜以使其亲⽔。
这是获得⾼质量斑点所必需的致密抗体包被层。
4.如何清洗和清空ELISpot板？可以使⽤多通道移液器⼿动清洗板⼦。
酶联免疫斑点测定的原理和技术要点
酶联免疫斑点测定的原理和技术要点周志统【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2006(021)006【摘要】近年来随着免疫方法学的迅速进展，各种新的技术种类不断涌现。
20世纪80年代初，国外科研工作者根据酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理，建立了一种体外特异性抗原刺激淋巴细胞后，检测特异性抗体分必细胞数量和功能的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT），后又将该技术发展为评估单细胞水平分泌特定细胞因子的功能和细胞数量。
20多年来，随着对此技术中包被抗体制备、呈色底膜材质、底物品色剂等的不断改进和优化，以及斑点计数仪的诞生，该技术已有了较高的敏感性和特异性，而且因为其实验操作巾的简便与实用，使该技术在肿瘤、感染性疾病和自身免疫病等药物疗效观察、预防性和治疗性疫苗蛋白多肽的筛选及效果考核、了解免疫状况、临床转归及免疫机制等方面具有广阔的发展前景。
【总页数】3页(P703-705)【作者】周志统【作者单位】上海市公共卫生中心,上海,201508【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.T细胞酶联免疫斑点试验检测在综合医院护理人员结核潜伏感染(LTBI)状况调查中的应用 [J], 周家仙; 张伟芬; 周桂娇2.T细胞酶联免疫斑点试验和结核菌素皮肤试验在儿童结核性疾病中诊断价值的Meta分析 [J], 陈巧佩; 丁营3.T细胞酶联免疫斑点法在风湿免疫性疾病患者中筛查结核感染的价值 [J], 罗伟;张岩;邓黎黎;张壮苗;羊章礼4.T细胞酶联免疫斑点法在风湿免疫性疾病患者中筛查结核感染的价值 [J], 罗伟;张岩;邓黎黎;张壮苗;羊章礼5.T细胞酶联免疫斑点法对艾滋病合并结核病患者的诊断价值 [J], 姚正钢;陈勇毅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酶联免疫斑点法技术用于辅助诊断结核病临床病例报道
酶联免疫斑点法技术用于辅助诊断结核病临床病例报道
赵相如;殷清宏
【期刊名称】《亚太传统医药》
【年(卷),期】2009(5)4
【摘要】结核病是由结核杆菌引起的慢性传染病,可累及全身多个器官,但以肺结核最为常见.本病病理特点是结核结节和干酪样坏死,易形成空洞.临床上多呈慢性过程,少数可急起发病.常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现.酶联免疫斑点法是通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特导性的细胞因子IFN-γ来诊断是否存在结核感染.对该法的实际应用进行报道.
【总页数】3页(P50-52)
【作者】赵相如;殷清宏
【作者单位】舞钢市疾病预防控制中心,河南,舞钢,462500;舞钢市疾病预防控制中心,河南,舞钢,462500
【正文语种】中文
【中图分类】R52
【相关文献】
1.不同抗原的酶联免疫斑点检测技术对结核病的辅助诊断价值比较 [J], 刘菲;张宗德;高孟秋;马丽萍;王庆枫;吴晓光;贾红彦;古淑香;马玙
2.不同抗原的酶联免疫斑点检测技术对结核病的辅助诊断价值比较 [J], 刘菲;张宗德;高孟秋;马丽萍;王庆枫;吴晓光;贾红彦;古淑香;马玙
3.酶联免疫斑点技术和分枝杆菌改良罗氏固体培养法在肺结核辅助诊断中的价值
[J], 王新宁;施旭东;刘根焰;赵旺胜
4.酶联免疫斑点技术辅助诊断小儿结核性脑膜炎的临床意义 [J], 韩文;张卫平;何萍;多力坤·木扎帕尔
5.酶联免疫斑点试验对肺外结核病的辅助诊断价值∗ [J], 杜方雄;何敏;廉国利
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酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答试验条件的优
化
商小英;庞学雯;张华刚;陈慰峰
【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》
【年(卷),期】2002(022)006
【摘要】目的探讨影响酶联免疫斑点(ELISPOT)实验特异性及敏感性的因素,优化酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的实验条件.方法HLA-A2阳性正常人的外周血单个核细胞在体外经流感病毒抗原肽诱导1周后,观察不同实验条件对酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的影响.结果CTL诱导时,效应细胞先分离出CD8+T细胞组获得的Flu抗原特异的细胞频数要高于CTL诱导后再分离出CD8+T细胞组(P＜0.05);自体DC(树突状细胞)作APC(抗原提呈细胞)比自体CD8-PBMC作APC,CTL的诱导效率高且特异(P＜0.05);使用细胞因子组合(IL-
7+IL-2+IL-6)优于单纯使用IL-2.CTL行ELISPOT检测时,T2-2细胞较T2-1细胞具有更强抗原提呈功能,增加Flu抗原特异的CD8+T细胞频数(P＜0.05).结论优化了酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的试验条件,优化后的方法在临床肿瘤疫苗的研究中具有应用价值.
【总页数】5页(P677-681)
【作者】商小英;庞学雯;张华刚;陈慰峰
【作者单位】100083,北京大学医学部免疫系,卫生部医学免疫学重点实验
室;100083,北京大学医学部免疫系,卫生部医学免疫学重点实验室;100083,北京大
学医学部免疫系,卫生部医学免疫学重点实验室;100083,北京大学医学部免疫系,卫生部医学免疫学重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R446
【相关文献】
1.酶联免疫斑点法对抗结核治疗期肺结核患者多肽特异性IFN-γ的检测
2.微粒子免疫发光法与酶联免疫法检测血清前列腺特异性抗原比较
3.酶联免疫法与全自动化学发光法检测乙肝表面抗原的特异度及敏感度比较
4.酶联免疫斑点法检测鼻咽癌患者放疗前后T细胞对EB病毒肽段的特异性反应
5.应用四聚体酶联免疫斑点法和细胞内细胞因子染色法检测HIV-1感染者体内特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究
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