第九章 内皮祖细胞

第九章内皮祖细胞

内皮祖细胞（EPC）是一类能循环、增值并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。广义上认为EPC包括从血液血管干细胞分化为成熟内皮细胞的过程中所有一系列细胞。

第一节内皮祖细胞的分类与来源

一分类

从外周血中分离单细胞进行体外培养，3--5天后出现纺锤体形细胞，在2---3周生长达到高峰，在第4周死亡，称为早期EPC；

另一种细胞在第2---4周出现，成鹅卵石形，在4---8周呈指数生长，可存活12周，称为晚期EPC。

早期EPC主要存在于骨髓中，主要表面标记是CD133（AC133）、CD34、VEGFR-2

晚期EPC强表达所有内皮系标记VE-cadherin、FL T-1内皮一氧化氮合酶、CD31等。

二来源

EPC的来源主要有一下几种

1.血液血管干细胞

根据

（1）

造血干细胞（HSC）血细胞成分

血岛（卵黄囊的腹侧）

血管内皮前体细胞血管内皮细胞（原始毛细血管网）

(2)原始的HSC和EPC享有共同的细胞表面标志CD34、AC133、血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2）

(3)HSC存在的部位如骨髓、外周血、新生儿脐带血、胎儿肝、胎儿脾均已证实含有EPC。

2.髓系祖细胞

髓系祖细胞是单核细胞和巨噬细胞定向分化的前体细胞。然而，许多实验表明，在血管生成的培养条件下，髓系CD34-/CD14+单核细胞能够表达许多内皮细胞的特异标志，并可在体外形成网状结构。

成熟的CD34-/CD14+外周血单核细胞在VEGF诱导下也能分化为内皮细胞样细胞，这些细胞同时表达内皮细胞标记。把这些细胞和CD34+细胞一起注入体内时，发现他们能够结合到新生血管的管壁中去。这一实验表明不仅CD34+细胞能分化成内皮细胞，CD34-/CD14+单核细胞能够分化为有生理功能的血管内皮细胞，并可作为EPC的来源。

3.多潜能成体祖细胞

许多成体组织存在少许MAPC。在细胞因子的诱导下，MAPC可在体外分化为内、中、外各胚层，在特定组织中定向分化为相应的干细胞。目前，成体造血组织骨髓中已被证实存在MAPC，体内外研究证实MAPC细胞可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞。心脏组织残留的MAPC也成功分离，研究显示

此类细胞具有向内皮细胞分化的潜能。

第二节内皮祖细胞的分离和鉴定

EPC可以从骨髓、外周血、脐静脉血及胎肝中分离出来。EPC最早是作为CD34+单个核细胞从成人外周血中分离出来的。

一、内皮祖细胞的分离

主要是：

免疫磁珠分选法：用包被CD34单抗的免疫磁珠吸附法从外周血中分离CD34+细胞，分离得到的CD34+细胞较纯，但量少。近来用CD133抗体，得较纯的EPC，单操作复杂、昂贵。

（2）密度梯度离心法

从脐血外周血分离单个核细胞，然后用直接贴壁筛选法来分离内皮祖细胞，并添加VEGF、ECG、bFGF等促内皮生长因子的特殊内皮细胞培养基进行扩增。操作简单，分离不纯。

（3）

CD133+KDR+双荧光细胞分选法，可得纯度较高的EPC。

二、内皮祖细胞的鉴定

（一）EPC的形态

EPC在培养7-10天后，变成纺锤形内皮细胞样的形态特征：典型的EPC 为梭形或多角形，核呈椭圆形。成群细胞呈现“鹅卵石”样排列。

(二) EPC的表面标记

表面标记是指细胞表面具有的一些与众不同的生物大分子，主要是蛋白质，它可以用来区分不同种类的细胞。至今仍未发现能同时将EPC与造血干细胞

及成熟血管内皮细胞完全分开的特意细胞表面标记，且不同时期的EPC的表面标记也不同。

1.CD34和VEGFR-2

（1）CD34（被认为是分离纯化EPC的合适标志物之一，但CD34+细胞所占的比例小，而且不是EPC的唯一标识，如成熟内皮上也表达CD34）

（2）VEGRF-2(作为血管系统最早出现的细胞标记，是EPC高富集性分子标记)

2 .CD133或AC133（可以特异性区分EPC和内皮细胞的表面标志---人AC133干细胞抗原。CD133表达消失的同时出现VWF，可能为EPC分化为成熟内皮的分界）

3.FGFR-1（用CD34和FGFR-1能分离出更多具有特异性内皮细胞抗原的细胞）（三）EPC的功能鉴定

平滑肌细胞为长梭形，细胞核成扁圆形，成群的细胞表现为“峰与谷”样排列。平滑肌细胞标志为平滑肌肌动蛋白、平滑重链和Calponin。只要目标细胞群最终分化出内皮细胞或平滑肌细胞，就可以肯定为EPC。

第三节内皮祖细胞的培养、增值和分化

一、内皮祖细胞的培养

培养方法尚无定论，常规同时用多种生长因子促进细胞的生长分化，但价格昂贵，势必限制EPC的研究和应用。

EPC对培养液的要求高，必须用特殊配方培养液。一般EPC所用的培养液是EGM-2，少数情况下应用IMDM、RPMI1640、长期培养液、Medium199

和条件培养液。EPC的培养需要VEGF、bFGF（碱性纤维生长因子）等多种刺激因子存在，可能还需要许多未知因子。

二、内皮祖细胞的增值

正常情况下，EPC的数量极少，外周血中为每毫升2-3个，脐血中则要高3.5倍，在含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等的培养条件下可以大量增值扩增。

与成熟血管内皮细胞相比，EPC作为血管内皮细胞的前体细胞具有迟发性高增值的潜能。

（例子）

三、内皮祖细胞的分化

（一）诱导分化内皮细胞

胚胎干细胞、成体干细胞分化需要一定的微环境。EPC也同样如此，相同的培养液加不同的刺激因子可产生不同的分化结果，而相同的刺激因子在不同的培养液里造成的分化结果却可能相同。（例子）其中必不可少的关键因素是VEGF。一般认为VEGF通过细胞膜上的VEGFR-2受体，激动蛋白激酶B，再通过三磷酸肌醇激活后续的各种细胞内信号，启动细胞的生长分化。血浆VEGF水平与循环内皮祖细胞数量明显相关。其他促使内皮祖细胞向内皮细胞分化不可缺少的因素有碱性纤维生长因子、上皮生长因子、肝细胞生长因子及胰岛素样生长因子等。

（二）诱导分化平滑肌细胞

诱导分化平滑肌细胞文献极少。一科学家取青年健康人外周血，通过密度梯度离心和CD34VE-cadherin免疫磁珠法分离出CD34+、VE-cadherin+细胞，现