15级 5 微生物原生质体育种

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三.微生物原生质体转化育种
经过多年研究和探索，已发展了整条染色 体DNA或片断DNA转化原生质体和质粒 DNA转化原生质体的技术。
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四．微生物原生质体融合技术
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优势
大幅提高亲本间重组频率：霉菌、放线菌可达 1%；酵母10-4-10-5 扩大重组的亲本范围：种间、属间、门间 亲本整套染色体参与，遗传物质转移和重组性状 多，集中双亲优良性状机会多

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6、直接克隆抗生素产生菌DNA大片段 到非产生菌中 完整的放线紫红素生物合成基因克隆到一个 非产生菌小小链霉菌，结果小小链霉菌产生了放 线紫红素。红霉素，土霉素的生物合成基因也用 此法克隆成功。
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七、利用已克隆的生物合成基因为探针克隆 同源基因
G放线菌 霉菌 酵母菌
肽聚糖和脂多糖
肽聚糖 纤维素和几丁质 葡聚糖和几丁质
溶菌酶+ EDTA
溶菌酶 纤维素酶 蜗牛酶
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影响原生质体制备的因素：
前处理
渗透压 稳定剂
培养时间
原生质体
酶解时间 酶浓度
酶解温度
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渗透压稳定剂
作用
采用
保护原生质体免于 膨胀破坏作用而且有 助于酶和底物的结 合。
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3.5.1微生物工程菌的构建
目的 基因
表达载体的 构建与筛选
基因 重组
转化、筛 选和鉴定
通过表达载体导入
鸟枪法分离基因 隔序列
外源基因不带间
利用原核细胞的 基因文库的建立 强启动子和SD序 和基因分离 列等调控元件 连接后形成正确 的开放阅读框架 基因的化学合成 利用宿主菌的调 PCR或RT-PCR 控系统 非融合型pBV220 融合型pGEX系统 分泌型pinβ系统
将土霉素产生菌Streptomgces rimosces M15883染色体DNA的PstI和BgIII片段分别克隆到 载体质粒pRF212和pRF234的PstI和BgIII位点，转 化OTCS突变株，筛选后获得了2个OTCr基因 （OtrA,OtrB）,以这两个OTCr基因为探针去检测 基因库，分别获得了一个阳性菌落，从中分离的 DNA片段能与几个土霉素阻断突变株互补。该法克 隆到的生物合成基因还包括红霉素，二丙胺磷， 嘌呤霉素等。

对已经克隆到的放线紫红素的生物合成基因研究 表明，生物合成基因成簇并与抗性基因连锁，为人 们提供了这样一种设想：即用敏感菌株（标准菌或 产生菌突变株）为宿主，克隆抗性基因 大片段 小片段 DNA片段。 分析与之连锁的生物合成基因 可利用它为探针来克隆同源的

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克隆土霉素的抗性基因（OTCr）：
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»5、融合子的选择
融合子
异核体
杂合二倍体 或单倍重组体
分离
杂合二倍体 或单倍重组体
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3.5 微生物工程菌的构建及应用
微生物工程菌的构建
基因工程在生产生物小分子中的应用
七十年代末在专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白 （VHb）。对VHb的功能研究表明，它作为一个氧气携带者， 能促进氧气扩散到细胞未端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下 也能很好生长。 人们试图从中克隆血红蛋白基因Vgb并研究它对其它微 生物生长的影响。而后，人们热衷于研究Vgb基因的导入对 重组蛋白表达量和微生物发酵代谢产物产量的影响。但通过 VHb基因的克隆提高抗生素的产量目前可能仅限于那些在发 酵中非常好氧而设备条件不能满足其要求的抗生素产生菌。
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3、利用突变克隆分析生物合成基因族 突变克隆技术是指外源基因借助载体进入抗生素 的产生菌中，如果外源基因与抗生素产生菌的生 物合成基因有同源性，就有可能与产生菌的转录 单位杂交，造成该基因的转录中断而影响其表达， 以此确定克隆基因的性质。
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4、克隆抗性基因并分析连锁的生物合成基因
（二）、原生质体融合技术 1、选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补
的两个亲株。带有可以识别的遗传标记。 2、原生质体制备： 获得有活力、去壁较为完整的原生质体是原生质体 融合育种技术的先决条件。 机械法、非酶法和酶法去壁。
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微生物去壁的酶
微生物 G+ 细胞壁的主要成分 肽聚糖 去壁的方法 溶菌酶
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4、引入抗性基因和调节基因，提高抗 生素产量
抗生素的产生与菌种对自身抗生素的耐性紧密有关。 因此，利用高拷贝质粒的基因量效应，增加菌种对自身抗 生素的抗性，有可能增加抗生素的产量。 这一方法可能对低产菌株有效，而对工业高产菌株改 良意义不大。
调节基因在抗生素的生物合成中也起很重要作用，增

首先应用此策略克隆milbemycin的生物合成
基因，他们用actⅢ基因为探针与milbemycin和 榴菌素产生菌的基因文库杂交，获得了actIII的同 源基因，将这些来自milbemycin和榴菌素产生
菌的同源DNA片段转入天蓝色链霉菌的actIII突 变株，产生了类似或同样的放线紫红素色素。



加调节基因的基因量也能大幅度提高抗生素产量。
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5、用人工合成的寡核苷酸探测基因库
由于链霉菌DNA中G+C的比例很高，因此链霉 菌基因对密码子利用有明显的不随机性，即密码 子第三位有90%以上常为G和C。因此在分析某 一抗生素生物合成酶的部分氨基酸顺序后，就能 设计出较低程度兼并性的寡核苷酸顺序，经人工 合成这段顺序后就可用作探针从基因库中钓出所 需的克隆子。
KCl,NaCl、CaCL2 和甘露醇、 山梨醇、蔗糖、丁二 酸钠等。 0.3~0.8M
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渗透压稳定剂
细菌
酵母菌
霉菌
蔗糖、丁二
酸钠、NaCl等
山梨醇、 甘露醇
KCl NaCl
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此外：破壁pH，培养基成分，培养方式，离子强 度和种类等，对原生质体形成也有一定影响。

20世纪70年代以来，各种原生质体操作技术已成为 工业微生物育种的重要手段，并取得了较大成就。
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再生
导为 提诱 供变 优， 良杂 材交 料， 转 化 ， 转
诱变
原生质 体育种
融合
转化
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一. 微生物原生质体再生育种

不用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的正 变率。
微生物发酵工程
4 工业微生物菌种的选育
原生质体育种
3工业微生物菌种的选育
3.1从自然界选种
3.2诱变育种 3.3 杂交育种 3.4原生质体融合育种
3.5 微生物工程菌的构建及应用
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4 原生质体育种
常规杂交由于受亲和力的影响，双亲本必须具有性的分 化，杂交受到一定的局限性。 原生质体研究始于19 世纪末，直到20世纪五六十年 代才开始采用酶法大量制备植物和微生物原生质体。
DNA连接方式： 粘性末端 平末端 人工接头 同聚物加尾 影响连接的因素： 连接酶的量 作用温度与时间 底物浓度
重组基因导入宿 主细胞：氯化钙 转化法和电穿孔 法 转化子的筛选与 鉴定：抗药性； a-互补；限制性 内切酶酶切图谱； PCR法；核苷酸 序列测定等
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3.5.2基因工程在生产生物小分子中的应用
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制备
SMM（用于芽孢 杆菌，主要成分是 蔗糖0.5M，顺丁烯二 酸0.02M， MgCl2 0.02M）和 DF液（棒杆菌， 主要成分是蔗糖 0.25M，琥珀酸0.25M， EDTA0.001M。 K2HPO4 0.02M， KH2P04 0.11M， MgCl2 0.01M）
维生素、氨基酸 抗生素
维生素C、苏氨酸、 组氨酸、精氨酸、异 亮氨酸
头孢菌素C、新霉素、 卡那霉素、阿维菌素、
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一、抗生素合成基因的克隆 链霉菌的基因组大约8×106bp。第一次成功地 利用链霉菌的载体宿主系统克隆到抗生素生物合 成基因以来，现已成功克隆到至少30个抗生素生 物合成基因。 发现：抗生素的生物合成基因成簇，抗性基因通 常是基因簇的一部分；一些相关生物合成途径的 基因相互杂交，显示出很强的同源性
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二、利用基因工程技术改良微生物 药物生产菌种

1、解除限速步骤，提高抗生素产量 控制这种限速步骤的酶基因克隆出来，然后通过合适 的载体克隆到原产生菌中，获得限速步骤酶水平的增加而 提高产量。 生物合成头霉素C的研究过程中发现，控制从初级代 谢产物赖氨酸转向次级代谢中间产物，即头霉素C的前体 α-氨基己二酸的流通量的赖氨酸ε-氨基转移酶的活力， 则必定能提高α-氨基己二酸合成前体的流通量。基于以 上设想，摇瓶中的抗生素产量为受体株的5倍。
敏感，易变 淘汰弱势种
优势
细胞壁变化
无需标记
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弗氏链霉菌再生后泰乐菌素产量提高3倍；产二素 链霉菌再生后螺旋霉素产量提高2倍。 与质粒脱落有关：13-85%。 解除调节基因对合成的调控；形态变化，便于筛选。
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方
法

出发株
活化和预培养
原生质体制备
原生质体再生
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2、阻断支路代谢，增加有效组份含量


结合诱变育种，原生质体融合和基因工程技 术对已知抗生素产生菌的遗传操作，以提高有效 组份的含量，抑制无效成份的产生，一个最成功 的例子是抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建。
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3、引入血红蛋白基因增加抗生素产量

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1、将目的基因克隆到标准宿主菌中，然后检测个别基因 产物
优：不需要了解抗生素生物合成途径的遗传信息， 但要知道何种酶参与了生物合成以及具有检测这 种酶灵敏的分析方法。
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2、克隆与阻断突变株互补的基因
抗生素生物合成途径通常涉及到10~30个酶反应 骤，如果通过诱变方法使其中的一个酶失活，而使 其不能合成最终产物，这种突变株称为阻断突变 株。 成功条件：①获得抗生素生物合成途径被阻断的一 系列突变株。 ②建立以阻断突变株为宿主的载体宿主 系统。
特性研究
稳定性鉴定
复筛
Leabharlann Baidu
高产株分离
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二.原生质体诱变育种

Kim 等1983年首先采用该法诱变玫瑰色 小单孢菌取得成功，现应用广泛。

已经在抗生素、酶制剂、有机酸和维生素 等高产菌株的选育中起到重要作用。

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避免表型延迟
目 的
敏感
1
2
3
P液（蔗糖0.3M， MgCl2 0.01M， CaCl2 0.25M及少 量磷酸盐和无机离 子）
0.7M NaCl或 0.6M MgSO4溶液
细菌
链霉菌
真菌
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原生质体形成率
=剩余菌数/ 破壁前菌数 ×100%
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3、原生质体的融合

1000~6000的PEG 特别是4000和6000二种。 还加入Ca
2+、Mg 2+等促进剂。
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影响原生质体融合的因素
融合剂的浓度 作用时间
融合
阳离子的浓度
pH
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4、原生质体的再生：
酶解去壁后的原生质体应具有再生能力，即 能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分 裂、这是原生质体融合育种的必要条件。 再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等， 需要在再生培养基中加一定渗透压的基质即渗透 压稳定剂。
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原生质体融合一般包括如下步骤
1
2 3 4 5
标记菌株的筛选 原生质体的制备
原生质体的融合 原生质体的再生 融合子的选择 实用性菌株的筛选
6
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（一）、原生质体融合技术的特点：
远缘
重组率高 原生质 体融合
多倍体
核酸的
好材料
易接受外 来遗传物质
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