原生质体融合育种
《原生质体融合育种》课件
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
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高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
食用菌原生质体融合育种技术简介
食用菌原生质体融合育种技术简介原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein 在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态，变成了圆球体，但它仍然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单位。
食用菌原生质体融合（protoplastfusion）是指通脱壁后的不同遗传类型的食用菌菌株原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或者整套基因组（核基因、线粒体基、胞质基因）的交换和重组，生产出新的食用菌品种和类型，也就是说，食用菌原生质体融合育种技术上是一种不通过有性生活史（sexualcycle）而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。
近日，在佛山科技学院召开的“草菇原生质体融合育种研究”成果鉴定会上获悉，该院农学系利用现代生物工程原生质体融合育种技术，成功地选育出草菇新品种Ｖｐ—２、Ｖｐ—３。
专家们实地考察后认为，该研究成果数据可靠，技术新颖，品种表现良好，种性稳定，菌丝生长健壮，爬料速度快，抗杂能力强，子实体结实，基部紧凑，个体适中，兼备双亲优良性状，生物特性明显优于目前生产使用的当家品种。
鉴定专家一致认为，该研究成果居于国内领先水平。
据项目鉴定委员会主任、省微生物研究所研究员丘元盛介绍，该项目成果具有技术的前瞻性和研究的独创性：采用超声波处理结合溶壁酶酶解，很好地解决了草菇细胞壁裂解的难题，为原生质体融合育种提供了大量原生质体，完善了草菇原生质体制备和融合技术；创造性地利用不同草菇品种间存在拮抗作用进行融合子初筛，利用不同草菇种间分解脱脂牛奶、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸等物质的能力差异性，定量检测融合子与亲本间的酶分解能力，通过ＤＮＡ随机多态性差异检测进而确定融合子，技术操作新颖，为食用菌育种开辟新途径；开创性采用液氮研磨与溶壁酶酶解相结合提取草菇菌丝ＤＮＡ技术，获得高纯度遗传物质，圆满解决草菇等真菌ＤＮＡ提取过程中破壁困难和纯度不高等技术难题，实现现代分子生物学水平格测融合子的技术性飞跃。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用
原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用摘要原生质体融合技术是微生物遗传育种中的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。
文章从原生质体融合的特点以及融合技术应用等方面进行了综述。
关键词原生质体；原生质体融合；遗传育种’原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。
然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。
两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。
一、原生质体融合的特点1.杂交频率较高由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
2.受接合型或致育性的限制较小由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利不同种属间微生物的杂交。
另外，出于原生质体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制就比较小。
3.重组体种类较多由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触.有机会发生多次交换，可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体二、原生质体融合技术的应用在微生物育种中，常根据不同需求通过原生质体融合技术培育出优质、高产、抗逆性强等优点的微生物菌种。
1.标记菌株的筛选用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于重组体的检出。
常用营养缺陷型和抗性作为标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态作为标记。
实际时究竟采用哪种遗传标记，要根据实验目的来确定。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
05-原生质体系列育种技术
杂交频率较高
受结合型或致育型的限制较小
二亲株中任何一株都 可能起受体或供体的 作用，因此有利于不 同种属间微生物的杂 交。 有的学者认为原生质 体融合是和“性”没 有关系的细胞杂交， 但目前有关工业微生 物中原生质体远缘融 合的报道仍然不多见， 因此不能断言任何种 属间原生质体都可实 现融合。 尽管如此，较常规的 接合、转化、转导方 法的应用范围及其杂 交频率都大得很多。
破壁时的pH：制备青霉菌的原生质体 自然pH(6.2～6.4)和pH 4.5对原生质 体产量无明显区别。 制备枯草杆菌原生质体时也观察到pH 5.8~7.7范围内对原生质体的释放无明 显影响。配制缓冲液的离子强度是有 一定影响的，一般原则是酶浓度增加 时，离子浓度应予减少。 渗透压稳定剂： 等渗透压在原生质体 制备中，不仅起到保护原生质体免于 膨裂，而且还有助于酶和底物的结合， 渗透压稳定剂多采用甘露醇、山梨醇、 蔗糖等有机物和KCl、NaCl等无机物。 菌种不同，其最佳稳定剂也有差异。 稳定剂的使用浓度—般均在 0.3~0.8mol／L之间。
原生质体电诱导融合
1.制备受体酿酒酵母（ρ－）和供体糖化酵母（ρ＋，his-）的原 生质体； 2.将两亲株原生质体以1:1比例混合； 3.用PM洗涤原生质体混合物并重悬成108个/ml； 4.将原生质体悬浮液注入融合小罐中； 5.接通电极和电融μ合仪，调定电脉冲强度为11kV/cm，脉冲时间 为10μs，脉冲个数为3,脉冲间隔时间为1s，打开电源进行电诱导 融合； 6.室温放置5-10min，倒出融合混合物，适当稀释后涂布RMM甘； 7.28℃培养7-10天，取出融合子在YNBS培养基上传代15次，测定 淀粉利用能力。
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。
下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。
2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。
3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。
二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。
2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。
3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。
总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。
原生质体融合育种
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• 酶处理温度 • 破壁时的pH值 • 渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保 护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物 的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇， 蔗糖等有机物，KCl、NaCl等无机物。
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4）涂布于再生培养基，再生出菌落。
5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融
合子进一步试验、保藏。
6）生产性能筛选。
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3、原生质体融合育种的要点
（1）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛
选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要 的是标记必须稳定。
采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还 可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功， 可以采用多标记菌种。
2021/4/9
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(2) 原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入 细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下 由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原 细胞的一切活性。
在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用 溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素 酶等。
2021/4/9
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影响原生质体制备的因素
1、原生质体融合育种的特点
(1) 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形
成类似于球形的原生质体。 (2) 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一
株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种 属间微生物的杂交。 (3) 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株 的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。
2021/4/9
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第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
酵母菌诱变育种
酵母菌原生质体融合育种第一部分：酵母菌原生质体融合育种一、基本原理进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。
在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。
应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子二、实验材料（一）菌种：酵母菌（二）培养基：1、完全培养基（液体CM）2、完全培养基（固体CM）在液体培养基加入2%琼脂3、基本培养基（MM）葡萄糖柠檬酸钠培养基或YNB培养基4、再生完全培养基固体完全培养基中加入0.5mol/L的蔗糖(三) 缓冲液(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融剂40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。
(六) 器皿培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
四、试验内容(一) 原生质体的制备1．活化菌体将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。
自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。
《原生质体融合育种》课件
稻米和小麦的基因交换
细胞工程育种的应用
通过原生质体融合育种，实现稻 米和小麦遗传特性的交换， 以提 高两个农作物的产量和适应能力。
利用细胞工程技术和原生质体融 合，可以快速培育出抗性强、高 产优良品种。
植物基因编辑的进展
通过原生质体融合育种的细胞工 程技术，实现植物基因编辑， 能 够更精准地改良植物性状技术，将植物细胞分离并制备出原生质体。
2
随机融合和定向融合的区别
随机融合是将制备好的原生质体混合后融合，而定向融合是特定选择要融合的原生质 体进行融合。
3
影响融合效率的因素
原生质体浓度、温度、融合时间等因素会对融合效率产生重要影响。
应用案例
了解原生质体融合育种在农业和植物科学领域的具体应用案例。
优缺点
了解原生质体融合育种的优势、局限性以及未来发展方向。
原生质体融合育种的优点
快速获取新品种、遗传特性可控、有效提高农作物产量。
原生质体融合育种的缺点
融合效率低、变异性高、对环境的适应能力有限。
未来发展趋势
进一步改进原生质体融合育种技术，提高融合效率和品种稳定性。
结论
通过本课件的学习，我们了解了原生质体融合育种的基本原理、应用案例、优缺点以及未来发展趋势。 原生质体融合育种具有巨大的应用潜力，将助力农作物产量提升和遗传特性的改良。
《原生质体融合育种》PPT课 件
让我们一起了解原生质体融合育种的奥秘与应用。
介绍
原生质体融合育种是一种基因育种技术，通过将不同植物的原生质体融合，实现基因交流和遗传特性的 选择性增强。
什么是原生质体融合育种
原生质体融合育种是通过融合植物细胞的原生质体， 实现不同植物间基因的交流，以达到遗传性状 的改良。
微生物原生质体融合育种技术及其应用分析
微生物原生质体融合育种技术及其应用分析摘要：细胞融合技术具有着操作简便、技术水平高等诸多优势，在现实中得到了越来越广泛的应用。
从应用领域来看，此项技术在农业、工业或者医药等诸多领域均取得了较大的进展。
此外，从应用作用来看，微生物原生质体融合育种技术在遗传互补、基因定位等方面也贡献着不可磨灭的力量。
本文对此项技术应用中的不足与未来应用趋势展开了相应分析。
以供相关工作者参考。
关键词：微生物原生质体；融合育种；应用问题；应用趋势从划分来看，微生物原生质体融合育种技术属于细胞融合的一个重要组成部分。
此项技术最早由上世纪七十年代的基因重组技术发展而来。
此项技术融合优势较为显著。
在实际融合过程中，细胞壁会被去除，使得原生质体的膜具有着较好的融合性，进而为细胞壁与细胞核的高效融合创造了良好条件。
在现实中，此项技术成为改造细胞强有力的技术。
一、微生物原生质体融合途径目前微生物原生质体融合途径可以被划分为化学法、电融合、激光诱导融合等方式方法。
首先，化学法。
自上世纪七十年代开始，化学法被应用到大豆或大麦等植物的原生质体融合后，化学法被广泛应用到微生物原生质体融合中。
从应用成效来看，融合速度快、质量高、且使用范围较为广泛，并在多数的微生物细胞原生质体融合中得到了有效运用。
其次，电融合。
此项技术是对上世纪八十年代的细胞改良技术的进一步发展。
通过将电学与生物学融合应用，出现了高成效的原生质体融合效果。
且随着时代的不断发展，此项技术不仅在动植物细胞融合中得到了应用，也在多类微生物细胞改良中起到了良好的成效。
最后，激光诱导融合。
此项技术是在二十世纪八十年代的激光诱导融合技术基础之上发展而来。
随着技术水平的不断提升，以及时代的不断发展，此项技术多被应用于微生物原生质体融合中。
从应用优势来看，此项技术具有着较小的毒性与损伤性。
然而，由于此项技术设备较为昂贵，且操作起来较为复杂，在现实中未得到较为广泛的引用。
同时，将激光微术技术应用到微生物原生质体融合中，不仅融合效率较低，且不具备较高的选择性。
食用菌生产技术 原生质体融合育种
原生质体在固体再生培养基和液体 再生培养基上均能再生，为了获得再生 单菌落，常采用固体再生培养基。
再生培养通常采用双层培养基培养 法，底层体纯化后，要进行适当的稀释， 用血球计数板准确计数每毫升原生质体 的数，然后根据实际再生菌落数，便可 计算出再生率。
原生质体再生率（％）＝
二、食用菌原生质体的基本特点
食用菌细胞外面包着一层坚硬的细胞 壁。这一道天然的“屏障”阻挡着食用 菌细胞间的彼此融合，并给各种遗传操 作带来极大困难。 游离的原生质体是真正的单细胞，在 同一时间内能得到大量的遗传上同质的 原生质体，为遗传学研究及用原生质体 为材料开展食用菌育种提供可能性。
原生质体具有以下几个特点：
原生质体的再生率与再生培养基成分、培养 方法、酶解时间及离心条件有关，一般随 着酶解时间的延长，原生质体的释放量增 多，但由于酶对原生质体膜的破坏作用， 再生率却有所下降。酶解时应以达到所需 原生质体的数量为宜。 较高的离心力及较长时间的离心，均 可引起原生质体的破裂，一般采用2000～ 5000r/min、5～10min的离心条件。
从菌丝体制备原生质体主要有两个优点：
①培养时间短，菌丝体生长均匀 一致，进而从菌丝体中释放的原生质 体，在生理和遗传特性上比较一致。 ②该材料在液体酶液中易分散， 适宜当前用酶解的方法分离原生质体。
由于不同食用菌菌丝生长速度不同， 获取幼龄菌丝体天数也不同。 选取旺盛生长期的菌丝体： 如草菇、银耳一般需要2～3天，平 菇需要3～4天，香菇需要5～6天，双孢 蘑菇需要7～9天，木耳则需要9～11天， 菌丝体培养一般采用液体静止培养法， 每瓶放十余粒玻璃珠，培养期间每天用 手摇1～3次
②间接检出法： 即将融合液涂布在营养丰富的再生 平板上，使亲本菌株和重组子都能再生， 然后，再施加选择因子检出重组子。 间接法虽然费时，但它可以克服某 些有表型延迟作用的遗传标记因直接选 择而产生的干扰作用。
微生物原生质体融合育种
2、原生质体制备
原生质体的分离
收集
纯化
活性鉴定
保存
制 备 流 程
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制备原生质体，是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。 早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质， 制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等 不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同， 而且所需酶量也存在着差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素， 酶浓度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类( 如过氧化物酶、 核糖核酸酶等) ，随着酶量的增加， 杂酶的浓度也会随之增加， 当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集， 难于原生质体化；而且， 细胞脱壁太彻底， 必然降低原生质体的再生率。
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改良菌种遗传物性
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质粒转移
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提高产量或质量，合成新物质
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优化菌种发酵物性
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原生质体与细胞核融合
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进行遗传分析
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微生物原生质体融合育种
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姓名：付凤根
一、概述
原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。 原生质体：细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。植物细胞即细胞壁内的原生质部分;动物细胞就是原生质体。 原生质体融合：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。
第七章工业微生物原生质体育种和原生质体融合
1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为
H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。
膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
具体步骤
DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们 与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链 紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射 峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm ，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细 胞核的位置。
（二）原生质体融合
1、融合亲本选育 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株
原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和 选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发 生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合 是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原 生质体融合到一起的可能。
特点
融合率高、重复性与可控制性强。 装置精巧、方便简单。 可在显微镜下观察或录像融合过程。 可能会造成不可恢复的细胞损伤。
(2)生物法
各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一 个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从 而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA 与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活 而常采用。
原生质体融合与植物遗传改良的例子
原生质体融合与植物遗传改良的例子
原生质体融合是一种生物技术，可以将两个不同植物的质体（细胞质和细胞核以外的细胞成分）融合在一起，形成一个新的细胞体系。
这种技术可以用于改良植物的性状，如增加植物的抗病性、耐盐性、耐旱性等等。
以下是一些原生质体融合在植物遗传改良中的例子：
1. 水稻的抗病性提高：将拥有良好抗病性的水稻品种的原生质体融合到普通水稻品种上，可以显著提高该水稻品种的抗病能力。
2. 番茄的耐盐性提高：将耐盐性较强的番茄品种的原生质体融合到普通番茄品种上，可以提高该番茄品种的耐盐性，使其能够生长在高盐度的土地上。
3. 油菜的花期延长：将具有较长花期的油菜品种的原生质体融合到其它品种上，可以使其它品种的花期延长，从而延长其生产收获期。
总之，原生质体融合技术可以为植物遗传改良提供新的途径和选择，因此在现代植物育种中得到广泛应用。
微生物原生质体融合
2. 建立最佳融合体系 3. 重组子分离模型
第二节 放线菌原生质体融合育种
一、放线菌细胞壁组成、结构及水解 (一) 细胞壁组成和结构：类似于G＋菌 (二) 细胞壁水解 1. 水解酶 2. 酶解环境条件
二、放线菌原生质体融合育种技术 (一) 培养基与溶液 (二) 菌体培养及预处理 (三) 原生质体制备 (四) 原生质体再生 (五) 原生质体融合与再生 (六) 融合体的检出
1. 利用营养缺陷型标记选择融合体
2. 利用抗药性选择融合体
3. 用灭活原生质体检出融合体
4. 利用荧光染色法选择融合体
5. 双亲对碳源利用不同而检出融合体
6. 融合体的其他选择方法
五、融合重组体检出与遗传特性分析
(一) 重组体的检出和鉴别的方法
1. 直接法
(二) 融合率
第三节 酵母菌原生质体融合育种
一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记 单细胞真核微生物
二、酵母菌原生质体融合育种技术 (一) 出发亲本菌株的筛选及单倍体分离 (二) 酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液 (三) 原生质体制备：蜗牛酶 (四) 原生质体再生 (五) 酵母菌原生质体融合 (六) 融合重组体鉴定与遗传分析
二、培养基及溶液 三、霉菌原生质体融合分关键步骤
(一) 霉菌原生质体制备：多种水解酶 (二) 原生质体再生 (三) 原生质体融合和再生 (四) 融合重组体分析与鉴定
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(2) 原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入 细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下 由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原 细胞的一切活性。
在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用 溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素 酶等。
影响原生质体制备的因素
• 菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 • 菌体的培养时间 为使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期菌体。 • 酶浓度
5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融
合子进一步试验、保藏。 6）生产性能筛选。
3、原生质体融合育种的要点
（1）标记菌种的选择
获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛 选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要 的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还 可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功， 可以采用多标记菌种。
(4) 存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合
子的可能性。
（5）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 (6) 提高菌株产量的潜力较大。种步骤
1）标记菌株的筛选和稳定性验证。 2）原生质体制备。
3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。
4）涂布于再生培养基，再生出菌落。
对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同， 就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不 同的生长期的菌体而变化。
• 酶处理温度
• 破壁时的pH值
• 渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保 护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物 的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇， 蔗糖等有机物，KCl、NaCl等无机物。
1、原生质体融合育种的特点
(1) 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形
成类似于球形的原生质体。
(2) 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一 株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种 属间微生物的杂交。 (3) 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株 的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。