遗传学课件第4章-原生质体培养及融合配色
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《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
遗传学讲义第4章【PPT】
4
第一节 环境的影响和基因的表型效应
❖ 例2. 有一种太阳红玉米，植物体见光部分表现为 红色，不见光部分表现不出红色而呈绿色(表)。
条 件 ： 太 阳 表 型 ： 红 色 结 论 ： 红 色 显 性 ， 绿 色 隐 性
条 件 ： 无 太 阳 表 型 ： 绿 色 结 论 ： 绿 色 显 性 ， 红 色 隐 性
2020/12/7
湖北大学生命科学学院 陈建国
26
2、并显性(codominance)
❖举例：镰刀形贫血症
2020/12/7
湖北大学生命科学学院 陈建国
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❖ 正常人的红血球是碟形
2020/12/7
湖北大学生命科学学院 陈建国
28
❖ 镰形红血球贫血病患者的红血球细胞呈是镰刀形
2020/12/7
12
3、表现度(expressivity)
❖ 另外还有一种现象就是基因的表达在程度上存在一 定的差异，即基因的表型效应会有各种变化，我们 将个体间这种基因表达的变化程度叫表现度。
❖ 表现度的不同等级往往形成一个从极端的表现过渡 到“无外显”的连续系列。因此，外显率是指一个 基因效应的表达或不表达，而不管表达的程度如何； 而表现度则适用于描述基因表达的程度。
湖北大学生命科学学院 陈建国
10
2、外显率(penetrance)
❖ 外显率是指某一基因型个体显示其预期表型的比率， 它是基因表达的另一变异方式。
❖ 譬如说，玉米形成叶绿素的基因型AA或Aa，在有 光的条件下，应该100%形成叶绿体，基因A的外显 率是100%；而在无光的条件下，则不能形成叶绿 体，我们就可以说在无光的条件下，基因A的外显 率为0。
湖北大学生命科学学院 陈建国
植物原生质体培养与体细胞杂交 PPT
常用得 PEG 和高 pH高Ca 相结合诱导融合得 具体操作程序:
混合双亲原生质体悬液,吸一小滴悬液于小 培养皿中,5~15min后原生质体沉到底面形成薄层;
每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG 溶液得组成:2难度ml 溶液(内含0、1 mol 葡萄糖、 10、5 mmol CaCI2、0、7 mol KH2PO4,KOH调节 pH到 5、5)加1g PEG-1560(或4000、6000,其她浓度)
45%,温度为19-21 度条件下生长得叶片可得到理想得原生
质体。
2、酶得种类
植物细胞壁就是由纤维素(25%~50%)、半纤维 素(50%左右)、果胶质(5%)组成。因此常用三种相 应得酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶 酶就是必需得,有些材料要加半纤维素酶。
商品酶制剂常含有杂质,对原生质体有不良影响, 有时要纯化。常用得方法就是将酶液在4 oC下过 Bio-Gel P6 或 Sephadex G-25。
3、渗透压得调控
如果溶液得渗透压和细胞内得渗透压不同,原生 质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和 培养液中渗透压应和原生质体内得相等或略大一些。 广泛使用得渗透压调节剂就是山梨醇和甘露醇,此 外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖,浓度约在0、40~0、 80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质 膜得稳定性,增加完整原生质体得数目和活力。
6、原生质体得活力鉴定
(1)细胞壁染色法:
荧光增白剂——细胞壁染色剂,既可以鉴定细 胞壁就是否除净,也可检查原生质体细胞壁得再生 情况。染色后在荧光显微镜下观察(360~440nm), 染料与细胞壁形成显眼得绿色荧光,无细胞壁处则 无荧光反应,略带红色。
(2) 原生质体活力得测定:
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
第四章原生质体培养及体细胞杂交
第四章原生质体培养及体细胞杂交第四章原生质体培养及体细胞杂交第一节原生质体的分离原生质体:指除去全部细胞壁具有生活力的细胞，或是一个为质膜所包围的“裸露细胞”。
一、原生质体培养的意义1、细胞器的分离与转移用原生质体为材料可以分离制备细胞内的各种细胞器，为研究这些细胞器的结构、功能、生理生化特征以及进行分子生物学分析提供了实验材料。
2、是植物遗传工程的理想受体原生质体由于没有细胞壁的障碍，可以直接吸收外源DNA，为有目的地引入特定的有用基因，来定向地改造现有生物体的性状，包括农作物的产量性状和品质性状提供了理想受体。
3、病毒侵染与复制机理的研究。
通过比较可以看出细胞壁在病毒侵染过程中的作用4、遗传育种：体细胞杂交。
通过原生质体融合后再生的杂种植株，可以克服远源杂交的不亲和性和子代不育等常规远源杂交所难以克服的障碍。
二、原生质体制备在早期人们是通过机械去壁的方法来实现的，由于这种方法只能从那些高度液泡化的细胞中分离得到有限的原生质体，大大限制了植物原生质体培养的发展。
随着商品酶的出现及应用，植物的种类及组织类型已经不是限制原生质体分离的主要因素，但对于原生质体培养而言，要获得活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体，则受许多因素的影响。
就原生质体分离而言，主要应当考虑到取材、酶的种类及纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等。
（一）取材1、叶片分离原生质体最方便和最普通的材料，因为在叶片中可以分离出大量形态、结构和发育阶段比较一致的细胞，而且叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。
多用温室培养植物的生长旺盛幼嫩的叶片，取材前可对植株进行轻度干旱处理，或对离体叶片进行质壁分离处理，使原生质体分离效果好。
2、愈伤组织分离效果不稳定，有无法去壁的老细胞。
3、悬浮培养细胞持续快速分裂的细胞为理想材料。
原始材料前处理：天然材料→灭菌→撕去下表皮（或金钢砂磨下表皮）→酶液。
（二）分离原生质体所用的酶类1、酶制剂1）纤维素酶：Onozuka R-10， Onozuka R-S，EA3-867。
原生质体培养及融合
要是原生质体，可以采用下述两种方法进行进一步的纯化。
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
30
A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
39
五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
40
1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
9
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
10
胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
4
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
5
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
30
A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
39
五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
40
1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
9
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
10
胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
4
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
5
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
植物原生质体培养ppt课件
界面法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无 损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片 等杂质沉于管底。
20
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
20
苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
植物的原生质体培养PPT课件
其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
微生物原生质体融合技术
•1957年 年 1957年，Eddy和Williumson等首次用蜗牛酶酶 年 等首次用蜗牛酶酶 和 等首次用蜗牛酶 解制备了酵母菌的原生质体
•60年代 年代
60年代捷克的 年代捷克的Brno和西班牙的 和西班牙的Salmanca两个研究中心对原 年代捷克的 和西班牙的 两个研究中心对 质体技术做了大量基础性工作 前者主要应用原生质体研 工作， 生质体技术做了大量基础性工作，前者主要应用原生质体研 酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 生活史与细胞分裂 究酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。 丝状真菌细胞壁的溶菌酶 效降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。
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Logo
2 原生质体的融合
微生物原生质体诱导融合方法主要有
电融合 基于微流控芯片 的细胞融合技术
PEG 结合高 ＋ Ca2＋诱 导法
激光诱导融合 高通量细胞融 合芯片
Logo PEG结合高 2＋诱导法 结合高Ca ＋ 结合高
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对 是一种多聚化合物， 聚乙二醇 是一种多聚化合物 PEG分子质量的要求不尽相同。亲本原生质体制备好后， 分子质量的要求不尽相同。 分子质量的要求不尽相同 亲本原生质体制备好后， 即可进行融合。 即可进行融合。
融合（ 融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等） 、离心沉淀、电脉冲等） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 株的筛选
实用性菌 实用性菌
11
Logo
二、原生质体融合技术的步骤与方法
融合重组体筛选
3
主要步骤
1
双亲本原生质 体制备和再生,
遗传学第四章.pptx
•
•
•
第11页/共69页
• 先按一对相对性状杂交的试验结果分析： 黄∶绿=(315+101)∶（108+32）
•
=416∶140=2.97∶1≈3∶1
圆∶皱 =(315+108)∶（101+32）
•
=423∶133=3.18∶1≈3∶1
∴两对基因相互独立地遗传给子代 每对性状的F2分离
均符合3∶1比例；
•
态下能够表现的基因。
• ⒌隐性基因(recesive gene)：在杂 合
•
状态下不表现的基因。
• ⒍基因型(genotype)：生物体或细胞 内
•
所研究基因的组合形式。
• ⒎表现型(phnotype)：也称表型，生
物
第5页/共69页
• ⒏纯合体(homorygote)：所研究的基因
•
等位基因间同质结合。
• 如Mendel试验。
• 2.不完全显性（Incomplete dominonce）: F1表现出双亲的中间性状。
• 如紫茉莉：
•
红1
• 红花×白花→F1粉红花→F2 粉红2 白1
第28页/共69页
• 3.共显性(Codominance)：双亲的性状在F1代同时得到表现。如：大豆A型蛋 白质和B型蛋白质，这是一对基因的差别。为共显性。
杂
合
，
则
F
2代
有
2
7
种
基
因型
，
自
交
后代
•
不分离：纯合
• 自交F3代 •
离
一对杂合出现3：1的分离 分离：杂合 二对杂合出现9:3:3:1的分
Get清风微生物原生质体融合育种 PPT课件
3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁合 成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加 速细胞壁合成的作用。 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营 养供给缺乏再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活 性。
早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质， 制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向 于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等
不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同， 而且所需酶量也存在着 差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素， 酶浓度过大时，酶 中往往含有对原生质体有害的酶类( 如过氧化物酶、 核糖核酸酶等) ，随着 酶量的增加， 杂酶的浓度也会随之增加， 当到达一定浓度时，必然会影响 原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集， 难于原生质体化；而且， 细胞脱壁太彻底， 必然降低原生质体的再生率。
利用荧光染色法选择融合体
荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作 器和荧光显微镜下，挑取现时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接 别离到再生培养基上再生，最后得到融合体。 具体方法：制备原生质体时，在酶解液中参加荧光色素，使双亲分别携带 有不同的荧光标记。它对原生质体活力无影响，携带色素的原生质体能正 常进行融合并具有再生能力。使用这种方法时，两种荧光染料的区分要明 显，并注意染料的浓度和处理时间。
作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便于重组体的检出。 常用的遗传标记有：带隐性性状的营养缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜 色和菌落形态等作为标记。
第四章植物原生质体培养及细胞融合PPT演示课件
10
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
5
液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁
胞间层 初生壁 次生壁
6
（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
4
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
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液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁
胞间层 初生壁 次生壁
6
（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
4
遗传学第4章ppt课件
F1
X+Xw
红眼♀
XwY
白眼 ♂
X+Xw
红眼♀
X+Y
红眼 ♂
1
： 1
1
： 1
正反交的结果不一样
伴性遗传
由性染色体所携带的基因在遗传时与 性别相联系的遗传方式。 绞花遗传（交叉遗传）：外祖父的性状 通过女儿在外孙身上表现；或者说女儿像 父亲，儿子像母亲的现象。
2、人类的伴性遗传
X连锁遗传 Y连锁遗传
♂芦花
ZB W ZbW
F2
ZbZb
♂芦花 ♂非芦花 ♀芦花 ♀非芦花 1 : 1 : 1 : 1
正反交的结果不同；交叉遗传现象
决定性状的基因在Z染色体上的伴性 遗传方式称为Z连锁遗传。 X连锁遗传 伴性遗传 Y连锁遗传 Z连锁遗传
伴性遗传的特点
※决定性状的基因位于性染色体上； ※性状的遗传与性别有关； ※正交与反交F1的结果不同；
通过基因型的改变，玉米可以从雌雄同 株变为雌雄异株，植株的性别是由Tsts这 对等位基因的分离决定。
2）染色体组的数目决定性别： 蜜蜂等膜翅目的昆虫：性别取决于染色体 组的数目，并受到环境影响。
蜂皇 雄蜂 工蜂
2n n 2n
雌雄同株和 雌雄同体的生 物有性别决定 吗？
性别决定指在各种因子的调控下性腺的 形成。 性别分化指在性腺产生的性激素作用下， 某些体细胞分化发育成内、外生殖器以及 第二性征。
红眼 ♂
X+Y
正常子代 (交叉遗传)
初级例外 1/2000
红眼♀ 白眼♂ 红眼♂ 白眼♀
正常子代 (交叉遗传)
(可育的)
4%次级例外
二、果蝇w
卵
Y Xw Xw Y
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3、利用原生质体培养中广泛发生的变异， 选育新品种。
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可 以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、 线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄 取细胞器后进行培养，获得再生植株，根 据再生植株的表现，即可进行遗传分析， 研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细 胞从组织中释放出来。
常用的果胶酶商品制剂：
Pectinase
Sigma
Macerozyme R-10 Japan
Pectolyase Y-2木霉中提取的一种复合酶制剂， 其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质 体释放出来。常用的商品酶制剂：
也可以通过细胞器的转移，使物种获 得相应的性状。
5、 用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结 构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染 机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生 物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒 学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存
A scheme of plant protoplast
据1993统计，已有49个科，146个属的 320多种植物，都可经原生质体培养得到 再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济 作物为主，但已从一年植物生向多年生植 物、从草本植物向木本植物、从高等植物 向低等植物扩展。
二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收 外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等 方法，将基因导入原生质体，实现遗传转 化。
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
2）盐溶液系统 主要使用：KCl、MgSO4•7H2O
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生 质体的稳定性，保持原生质体的活性，促进细胞壁 再生及细胞分裂等。
➢ 小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体 (nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分 细胞质。
➢ 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条 染色体的情况。
➢ 胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。 是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体， 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使 其再生成为杂种植株的技术。
Hemicellulase H-2125 Sigma
Rhozyme HP-150
USA
4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质
各公司生产的酶的效果不尽 相同，使用时应予以注意。必须 控制好浓度、温度和处理时间， 例如：
Cellulase Onzuka R-10 Japan Cellulase Onzuka RS Japan （两种纤维素酶的活性大约差10倍）
➢ 1971年，Takebe 等首次将烟草叶肉原生质体培 养成完整植株。
➢ 1985年，Fujimura 等获得第一例禾谷类作物，即 水稻原生质体的再生植株。
➢ 1986年，Spangenberg 等由甘蓝型油菜的单个 原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型 ）
BACK
随后，其它植物上也逐渐有原生质体再 生植株成功的报道，包括粮食作物、油料 作物、经济作物和一些药用植物。
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
第一节 原生质体培养
一、原生质体培养的发展历史
要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体， 即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。
植物原生质体培养研究中几个重要的成就： ➢ 1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)
近年来，为了提高原生质体再生的频 率，最常用的是以下几类材料：
➢ 无菌试管苗的叶片 ➢ 上胚轴和子叶 ➢ 处于对数生长期的细胞悬浮系
2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的 种类和浓度。
目前主要使用的酶有：
果胶酶类 纤维素酶类 半纤维素酶类和崩溃酶等 有时还会使用蜗牛酶。
1）果胶酶类
EA-867
中科院上海植生所
Cellulase Onzuka R-10 Japan
Cellulase Onzuka RS Japan（价格昂贵）
Meicelase P
Japan
Cellulase
USA
Driselase（崩溃酶，具多种活性） Japan
3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维 素，主要商品制剂有：
Plants
Pre-treatment enzymolysis
Suspension cells
Purification Vigour test
Cuture and regeneration
三、原生质体的分离
1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植 株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原 生质体，但一定要选用幼嫩部分。
22h 3-5h
3、酶液的渗透压
原生质体的一个基本属性是渗透破 损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及 培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。 常用的稳定剂分为两类：
1）糖溶液系统
2）盐溶液系统
1）糖溶液系统 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，
目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因 对原生质体培养不利，很少使用。
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
率极低，无法进行培养和再生。
甜菜 洋葱 萝卜 黄瓜
➢ 1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使 用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量 具有高度活性的原生质体。
➢ 1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场， 使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体 培养也开始成为热门研究领域。
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可 以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、 线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄 取细胞器后进行培养，获得再生植株，根 据再生植株的表现，即可进行遗传分析， 研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细 胞从组织中释放出来。
常用的果胶酶商品制剂：
Pectinase
Sigma
Macerozyme R-10 Japan
Pectolyase Y-2木霉中提取的一种复合酶制剂， 其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质 体释放出来。常用的商品酶制剂：
也可以通过细胞器的转移，使物种获 得相应的性状。
5、 用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结 构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染 机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生 物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒 学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存
A scheme of plant protoplast
据1993统计，已有49个科，146个属的 320多种植物，都可经原生质体培养得到 再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济 作物为主，但已从一年植物生向多年生植 物、从草本植物向木本植物、从高等植物 向低等植物扩展。
二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收 外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等 方法，将基因导入原生质体，实现遗传转 化。
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
2）盐溶液系统 主要使用：KCl、MgSO4•7H2O
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生 质体的稳定性，保持原生质体的活性，促进细胞壁 再生及细胞分裂等。
➢ 小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体 (nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分 细胞质。
➢ 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条 染色体的情况。
➢ 胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。 是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体， 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使 其再生成为杂种植株的技术。
Hemicellulase H-2125 Sigma
Rhozyme HP-150
USA
4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质
各公司生产的酶的效果不尽 相同，使用时应予以注意。必须 控制好浓度、温度和处理时间， 例如：
Cellulase Onzuka R-10 Japan Cellulase Onzuka RS Japan （两种纤维素酶的活性大约差10倍）
➢ 1971年，Takebe 等首次将烟草叶肉原生质体培 养成完整植株。
➢ 1985年，Fujimura 等获得第一例禾谷类作物，即 水稻原生质体的再生植株。
➢ 1986年，Spangenberg 等由甘蓝型油菜的单个 原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型 ）
BACK
随后，其它植物上也逐渐有原生质体再 生植株成功的报道，包括粮食作物、油料 作物、经济作物和一些药用植物。
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
第一节 原生质体培养
一、原生质体培养的发展历史
要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体， 即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。
植物原生质体培养研究中几个重要的成就： ➢ 1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)
近年来，为了提高原生质体再生的频 率，最常用的是以下几类材料：
➢ 无菌试管苗的叶片 ➢ 上胚轴和子叶 ➢ 处于对数生长期的细胞悬浮系
2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的 种类和浓度。
目前主要使用的酶有：
果胶酶类 纤维素酶类 半纤维素酶类和崩溃酶等 有时还会使用蜗牛酶。
1）果胶酶类
EA-867
中科院上海植生所
Cellulase Onzuka R-10 Japan
Cellulase Onzuka RS Japan（价格昂贵）
Meicelase P
Japan
Cellulase
USA
Driselase（崩溃酶，具多种活性） Japan
3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维 素，主要商品制剂有：
Plants
Pre-treatment enzymolysis
Suspension cells
Purification Vigour test
Cuture and regeneration
三、原生质体的分离
1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植 株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原 生质体，但一定要选用幼嫩部分。
22h 3-5h
3、酶液的渗透压
原生质体的一个基本属性是渗透破 损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及 培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。 常用的稳定剂分为两类：
1）糖溶液系统
2）盐溶液系统
1）糖溶液系统 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，
目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因 对原生质体培养不利，很少使用。
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
率极低，无法进行培养和再生。
甜菜 洋葱 萝卜 黄瓜
➢ 1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使 用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量 具有高度活性的原生质体。
➢ 1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场， 使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体 培养也开始成为热门研究领域。