原生质体培养要求和融合

Plants
Байду номын сангаас
Pre-treatment enzymolysis
Suspension cells
Purification Vigour test
Cuture and regeneration
三、原生质体的分离
1、取材：材料的类别对原生质体培养很重要
可采用离体培养植株、田间或温室植 株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原 生质体，但一定要选用幼嫩部分。
原生质体培养要求和融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细 胞从组织中释放出来。
常用的果胶酶商品制剂：
Pectinase
Sigma
Macerozyme R-10 Japan
Pectolyase Y-23 Japan (价格昂贵)
2）纤维素酶类
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂， 其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质 体释放出来。常用的商品酶制剂：
也可以通过细胞器的转移，使物种获 得相应的性状。
5、 用于理论研究
如细胞壁的生物合成、原生质膜的结 构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染 机理等。
原生质体研究已在细胞生物学、生 物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒 学、育种学等领域得到广泛应用。
6、用于种质资源保存
A scheme of plant protoplast
➢ 1971年，Takebe 等首次将烟草叶肉原生质体培 养成完整植株。
➢ 1985年，Fujimura 等获得第一例禾谷类作物，即 水稻原生质体的再生植株。
➢ 1986年，Spangenberg 等由甘蓝型油菜的单个 原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型 ）
BACK
随后，其它植物上也逐渐有原生质体再 生植株成功的报道，包括粮食作物、油料 作物、经济作物和一些药用植物。
近年来，为了提高原生质体再生的频 率，最常用的是以下几类材料：
➢ 无菌试管苗的叶片 ➢ 上胚轴和子叶 ➢ 处于对数生长期的细胞悬浮系
2、酶的种类和作用
原生质体分离的效果主要取决于酶的 种类和浓度。
目前主要使用的酶有：
果胶酶类 纤维素酶类 半纤维素酶类和崩溃酶等 有时还会使用蜗牛酶。
1）果胶酶类
22h 3-5h
3、酶液的渗透压
原生质体的一个基本属性是渗透破 损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及 培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。 常用的稳定剂分为两类：
1）糖溶液系统
2）盐溶液系统
1）糖溶液系统 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，
目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因 对原生质体培养不利，很少使用。
2）盐溶液系统 主要使用：KCl、MgSO4•7H2O
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生 质体的稳定性，保持原生质体的活性，促进细胞壁 再生及细胞分裂等。
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
率极低，无法进行培养和再生。
甜菜 洋葱 萝卜 黄瓜
➢ 1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使 用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量 具有高度活性的原生质体。
➢ 1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场， 使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体 培养也开始成为热门研究领域。
EA-867
中科院上海植生所
Cellulase Onzuka R-10 Japan
Cellulase Onzuka RS Japan（价格昂贵）
Meicelase P
Japan
Cellulase
USA
Driselase（崩溃酶，具多种活性） Japan
3）半纤维素酶
用于降解细胞壁中的半纤维 素，主要商品制剂有：
3、利用原生质体培养中广泛发生的变异， 选育新品种。
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可 以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、 线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄 取细胞器后进行培养，获得再生植株，根 据再生植株的表现，即可进行遗传分析， 研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
第一节 原生质体培养
一、原生质体培养的发展历史
要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体， 即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。
植物原生质体培养研究中几个重要的成就： ➢ 1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)
据1993统计，已有49个科，146个属的 320多种植物，都可经原生质体培养得到 再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济 作物为主，但已从一年植物生向多年生植 物、从草本植物向木本植物、从高等植物 向低等植物扩展。
二、原生质体培养的意义
1、为细胞融合提供直接方法
2、为遗传转化提供新的途径
原生质体没有细胞壁，可以直接吸收 外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等 方法，将基因导入原生质体，实现遗传转 化。
➢ 小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体 (nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分 细胞质。
➢ 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条 染色体的情况。
➢ 胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。 是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体， 通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使 其再生成为杂种植株的技术。
Hemicellulase H-2125 Sigma
Rhozyme HP-150
USA
4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质
各公司生产的酶的效果不尽 相同，使用时应予以注意。必须 控制好浓度、温度和处理时间， 例如：
Cellulase Onzuka R-10 Japan Cellulase Onzuka RS Japan （两种纤维素酶的活性大约差10倍）