窖泥微生物特性及其培养

• 无机窖泥由于主要培养己酸菌，所含的微生物菌群较少， 生成香味成分单一。
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五、人工窖泥的培养
• 有机窖泥多以豆类、酯化液、窖内黄水、酒糟等有机氮、 磷、钾为微生物的营养源； • 无机窖泥主要以纯种培养己酸菌为主，多以无机盐类如磷 酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵等无机氮、磷、钾为微生物的 营养源
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二、窖泥中的微生物
己酸菌 甲烷菌
丁酸菌
醋酸菌
窖泥微生物
乳酸菌
硝酸盐还原菌
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酵母菌
硫酸盐还原菌
二、窖泥中的微生物
（1）呼吸作用 • 呼吸是指在生物体中进行氧化作用的化学反应过程中，最 终把氢传递给分子氧形成水或传递给其它氧化型化合物的 过程。呼吸可产生较多的能量。如果氢传递给分子氧就叫 做有氧呼吸，传递给其它氧化型化合物，例如硝酸盐、硫 酸盐、碳酸盐等，则称之为无氧呼吸。 • • 进行无氧呼吸的是厌氧微生物和兼性厌氧微生物。根据接 受传递来的氢的化合物的不同，可分为硫酸盐呼吸、硝酸 盐呼吸和碳酸盐呼吸等。
（1）400余年泸州老窖
糟醅中功能菌数量从窖面到窖底越来越多；从窖中到窖壁越来越多。 老窖池糟醅中数量最多的窖泥功能菌是己酸菌，其次是醋酸菌、乳酸菌、 丁酸菌，甲烷菌最少。窖位间数量差异最大的己酸菌，其次是醋酸菌、乳 酸菌、丁酸菌，甲烷菌最少。
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四、主要功能菌群分布及化学生态环境 （1）400余年泸州老窖
（2）兼性厌氧菌（facultative anaerobe ） • 己酸菌：该菌系对厌氧条件的要求并不严格，属于耐氧性厌 氧细。菌，在一般条件下液体深层培养就能满足其生长，空 气系数对芽孢和产酸的影响较小，适合于工业化生产。 • 己酸菌将乙醇及丁酸转化为己酸时, 必须先有丁酸发酵。 • 从泸香型白酒厂中分离出的己酸菌，耐气厌氧， 发酵乙醇和 乙酸盐, 产生己酸、丁酸及少量的乙酸。发酵葡萄糖产微量 的己酸,与巴克氏己酸菌不同。但是, 不管哪一类己酸菌, 窖泥 中的多种有机酸代谢过程中产生氢，存在着微生物代谢控制 的底物抑制现象。 1/56
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一、关于窖泥
窖泥（Cellar mud ）： —“微生物黄金”。 2005年4月26日开始的中华世纪坛“世纪国 宝展”,在第一号展柜上，一块灰褐色泥巴与 秦始皇陵的划船陶俑、中国最早的人造铁器 等文物一起，戴上国宝桂冠--来自五粮液古窖 池，至今已有637年的历史 。
窖泥中有机酸比例（己酸＞乙酸＞丁酸）是衡量窖泥是否优质的关键； 防止窖泥中乳酸积累, 减缓乳酸亚铁及乳酸钙的产生，防止窖泥老化； 浓香型大曲酒的主体香是己酸乙酯。
二、窖泥中的微生物
（2）兼性厌氧菌（facultative anaerobe ） • 硝酸盐还原菌：兼性厌氧菌。 • 如大肠杆菌, 只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；如地衣芽抱杆 菌（Bacillus Lichenformis） 还能进一步将亚硝酸盐还原为 一氧化氮、一氧化二氮和氮。 • 有机物氧化时产生的NADH2 和FADH2中的氢, 通过硝酸盐还 原菌电子传递链将电子传递给NO3-、NO2-、NO和N2O，最 后均还原成氮。
菌利用生物酶促进了上述反应的发生, 使己酸能够得以大量生成。
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三、窖泥中微生物代谢
（2）己酸乙酯的代谢途径 • CH3( CH2 ) 4COOH + ATP+ CoA~SH → CH3 ( CH2 ) 4CO▪SCoA+ AMP+ Ppi • CH3( CH2) 4CO ▪ ScoA+ CH3CH2OH → CH3 ( CH2 ) 4COOC2H5+ CoA~ SH
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四、主要功能菌群分布及化学生态环境
（1）400余年泸州老窖
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• 随着窖龄的增加，窖泥中己酸菌、丁酸菌、甲烷菌数量不 断增加，同时，窖泥中微量化学成分含量和种类也不断增 加，尤其是酯类化合物和酸类化合物。 • 己酸菌、 丁酸菌、 甲烷菌是浓香型酒主体生香功能菌， 揭示了中国浓香型白酒老窖发酵机理。 • 泥窖内壁的窖泥，是酿酒主体生香功能菌(己酸菌、丁酸 菌、甲烷杆菌行等)繁衍栖息的场所，是多种微生物固定 化的培养基， 是没有半衰期且效果越来越好的生物反应 器。窖龄越长，窖泥中繁衍的功能微生物及其产生的香味 物质也就越多，产出的酒也就越好。
（4）乳酸的代谢 • 窖泥在老化过程中出现白色晶体状物质, 经分析为乳酸亚 铁及乳酸钙。
• 硫酸盐还原菌能减少窖泥中微生物产生的乳酸及营养物 （黄桨水）中的乳酸, 防止乳酸积累, 减缓乳酸亚铁及乳酸 钙的产生。故窖泥中硫酸盐还原菌的种类及数量, 是衡量 窖泥是否趋于老化的重要指标。
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四、主要功能菌群分布及化学生态环境
• 酒精和乙酸先生成丁酸，丁酸再和酒精生成己酸
CH3CH2OH+ CH3COOH → CH3( CH2) 2COOH+ H2O
CH3( CH2 ) 2COOH + CH3CH2OH → CH3 ( CH2 ) COOH +H2O
• 淀粉糖化后, 先生成丙酮酸, 丙酮酸再生成丁酸, 丁酸再与乙酸合成己酸
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三、窖泥中微生物代谢
（4）乳酸的代谢 硫酸盐还原菌，如脱硫弧菌（Desnlforibrio vulgaris） 能以硫 酸盐作为最终电子受体而将硫酸盐还原为H2S 。 乳酸被脱硫弧菌最后氧化为乙酸, 在这个过程中脱下8个氢, 这 8个氢最后使硫酸盐还原为硫化氢。
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三、窖泥中微生物代谢
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五、人工窖泥的培养
• 有机人工老窖的培养 • 要培养好窖泥，窖泥配方是关键，应严格遵循“尽量使用 酿酒的下脚料，少添加其他原料”的原则。事实上，酿酒 用的下脚料，如黄水、酒尾、封窖泥、粮糟、丟糟等都是 酿酒微生物的良好栖息载体， 是驯化了的天然微生物培 养基。
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五、人工窖泥的培养
• 两步法窖泥培养操作 • 第一步熟土阶段 • 选好泥土后应进行处理，先过筛，去除土壤中的石块或杂质，将选定 合格的黄泥晾晒3～5 d，使土壤中的水分达到8 %以下，再粉碎成细 粉状，拢堆备用。其目的有三：一是阳光照射自然杀菌； 二是去除水 分， 增加土壤对酒尾、黄水液体的接收量；三是排除土壤中杂味。、 黄水液体的接收量；三是排除土壤中杂味。 • 测量黄土体积，计算所需材料（豆粕、大曲粉、丢糟），当天所计划 的土方和配好的料用完，拌和均匀。整个土堆拌和完毕后，将土堆划 分成若干区，一个区为30～50 m3，打好土堆，把处理好的黄水、酯 化液、酵母自溶液、酒尾等倒入土堆进行浸泡，盖上塑料布，不得有 跑漏现象。浸泡过程中，黄水添加量以泥的含水量分次添加，不得过 多，使pH 值偏低。浸泡期间要保证基质泥的湿润，定期添加黄水， 浸泡时间20～30 d。
C6H12O6 → 2CH3COCOOH+ 2H2 2CH3COCOOH+ 2H2O → CH3( CH2) 2COOH+ CH3COOH+2O2
CH3 ( CH2 ) 2COOH + 2CH3COOH + 2H2 → CH3( CH2) 4COOH+ CH3COOH+ H2O
•
醅子在窖池内发酵时, 上述反应均有可能发生。在发酵的过程中, 主要是己酸
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五、人工窖泥的培养
• 把黄水、母糟、酒尾按比例要求加入缸中搅匀。 此时，缸的容量基本达到90 %，缸内温度一般控 制在39～42℃。 • 封缸发酵 • 以塑料布封好缸口，插入温度计，测量缸内温度， 测定封缸温度，保温发酵，发酵全期7～8 d。封 缸温度控制在38～42 ℃之间，正常情况下，在20 h 内，缸内绝大部分都要发酵。发酵开始时，缸 内液面上升，1～2 h 后，开始有气泡，发酵旺盛； 30～60 min 后液面下降，正常发酵的母液是淡黄 色，带悬丝，气味与老窖泥相似。
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四、主要功能菌群分布及化学生态环境
（1）枝江大曲
• 枝江大曲选用优质红高粱、糯米、大米、小麦、玉米为原 料, 以自然接种培养的麦曲为糖化发酵剂, 采用传统的泥窖 固态发酵、混蒸混烧、续糟配料法进行生产。
• 窖泥和大曲中参与发酵的微生物：霉菌、酵母和细菌。大 曲中霉菌主要为曲霉、犁头霉、毛霉、根霉、白地霉； 酵母菌以酵母属为主， 细菌中有大量菌为芽孢杆菌。
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五、人工窖泥的培养
酯化液的培养:先将晾干的黄泥粉碎， 然后加入85 ℃以上的热水20 %， 搅拌均匀，立即封坛，保温杀菌。第2 天，继续加热水到半缸左右 （30 %），调节缸内温度在42～45℃之间。以小提桶盛少量热水（不 低于45 ℃）加入老窖泥，捣细成浆，加曲4 kg 拌匀。混匀后，桶内 保持40℃左右，将培养成熟的菌液缓慢倒入缸内搅匀。
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三、窖泥中微生物代谢
（3）有机酸代谢的调节 丁酸菌在代谢过程中产生的氢被甲烷菌和硝酸盐还原菌 利用，解除氢的抑制现象 丁酸的积累有利于己酸菌将丁酸转化为己酸 甲烷菌、硝酸盐还原菌和产酸、产气菌相互偶联，实现 “种间氢转移”关系，甲烷有刺激产酸效应；
黄浆水中含有大量乳酸，被硫酸盐还原菌利用，消除黄 浆水中营养物质不平衡。
五、人工窖泥的培养
• 酵母液自溶液 • 麸皮和水以1∶6 的比例混匀， 加热至60 ℃保温3～4 h， 加入5 万单位的糖化酶0.2 %，使其糖化2 h。干酵母在使 用前需复水活化制成酵母乳液， 以便恢复酵母细胞的正 常功能。 • 将干酵母按1∶10～1∶20 的比例投放于36～38 ℃的温水 中复水15～20 min，或在2 %～4 %的糖水复水中活化 30～90 min，制成酵母乳液。将糖化好的麸皮冷却到35 ℃后加入2 %复水活化后的酵母液发酵24 h。将发酵好的 酵母液的pH 值调整到5.0，加热至50℃，保温40～50 h 即得到较为理想的酵母自溶液.
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二、窖泥中的微生物
（2）严格厌氧菌（strict anaerobic bacteria ） • 甲烷菌：严格厌氧菌，唯有厌氧滚管技术能够保证从头至 尾隔绝氧气，不管厌氧袋、厌氧箱、还是厌氧罐，都不可 避免会在接种或者存取过程中接触一定量的氧气，这对于 “严格厌氧”微生物来说就是致命的 。甲烷菌能源和碳 源物质主要有5种，即H2/CO2、甲烷、甲醇、乙酸和乙胺。 • 硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）：严格厌 氧菌，是一类能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、单硫 还原为硫化物的微生物。硫酸盐呼吸是自然界中硫素循环 中一个不可缺少的环节，当然，硫酸盐还原形成的主要产 物之一硫化氢，不仅会污染大气和水环境，而且还会造成 埋藏的金属管道与建筑构件的腐蚀。
窖泥微生物特性及其培养 Characteristics and culturing methods of microbes in cellar mud
李 啸
2013年5月28日
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内容
一、关于窖泥 二、窖泥中的微生物 三、窖泥中微生物代谢 四、主要功能菌群分布及化学生态环境 五、人工窖泥的培养 六、窖泥培养中常用的酵母浸出物 七、酵母浸出物在种子扩培中的应用
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四、主要功能菌群分布及化学生态环境
（2）枝江大曲
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五、人工窖泥的培养
• 人工窖泥的制作按其培养物的不同，一般分为有机窖泥和 无机窖泥两种 • 有机窖泥采用酯化泥、窖泥母液和窖池内的一些物质等， 使窖泥能快速适应窖池环境，同时窖泥中各类微生物菌群 丰富，生成产生的香味成分复杂，各类成分协调；
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二、窖泥中的微生物
（2）兼性厌氧菌（facultative anaerobe ） • 硝酸盐还原菌的电子传递链的组成和一般细菌的呼吸链 不一样，电子通过电子链的传递只能产生2个ATP。
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三、窖泥中微生物代谢
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三、窖泥中微生物代谢
（1）己酸的代谢途径
• 酒精和乙酸合成己酸
2CH3CH2OH+ CH3COOH → CH3( CH2 ) 4COOH+ 2H2O
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二、窖泥中的微生物
（2）严格厌氧菌（strict anaerobic bacteria ） • 丁酸菌：又称酪酸梭菌，丁酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌 （Clostridium butyricum）。丁酸梭状芽孢杆菌属于严格厌 氧菌。 • 将乙醇和乙酸合成丁酸，即先有丁酸发酵。
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二、窖泥中的微生物