链霉菌基因转移的方法

合集下载

链霉菌的分子育种策略

链霉菌的分子育种策略摘要：现在链霉菌的选育已经进入分子育种阶段。

其过程包括利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控，进而进行抗生素的修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系统中，引入抗性基因、调节基因和引入血红蛋白基因；利用基因筛选程序，筛选含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物；利用基因组重排技术对出发菌株进行处理等。

链霉菌接合转移体系研究的提出为分子育种打开了一个新的方向。

系统改变基因结构可产生一个完整的突变株文库，从而构建大规模生产不同抗生素的工程菌。

关键词：链霉菌，分子育种，基因Method of Streptomyces’s molecular breeding Abstract:Now The breeding of Streptomyces has entered the stage of molecular breeding. The process includes: Using genedisruption, knockout, replacement mutation technology tounderstand gene function, expression, regulation and control and then have the, modification of antibiotics. The secondarymetabolite biosynthesis gene cluster is transferred to the easy industrial operation of the host system, introducing theresistance gene, gene regulation and introducing the hemoglobin gene;Use of genetic screening programs, screening of specific types of compounds containing the gene producing strain, and obtained the corresponding secondary metabolites;Use of genome shuffling on the starting strain processing and so on . the conjugative transfer system research of Streptomyces has openeda new direction for molecular breeding System changes in genestructure can produce a complete mutant library, so as toconstruct the mass production of different antibioticengineering bacteria.Key words: Streptomyces；molecular breeding,；DNA链霉菌是一类细胞壁类型为I型、革兰氏阳性、好气的最高等的放线菌。

利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因

利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因链霉菌(Streptomyces)是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。

近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。

但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。

本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。

在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S 突变是激活效果较为明显的两种突变。

CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。

建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。

本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。

测试了质粒含有的热敏元件pSG5 rep、筛选标记阿布拉霉素抗性基因(acc)和硫链丝菌素抗性基因(trs),结果显示均能正常工作,并对各培养、筛选、质粒清除等条件进行了优化。

利用该质粒定点突变链霉菌rpsL基因没有获得阳性结果。

然后由pCas9-1质粒衍生出两种不同的质粒,分别命名为pCas9-2和pCas9-3。

这三种质粒含有相同的sgRNA(用于靶向同一位点)和相同的同源重组(HR)模板,区别在于sgRNA和Cas9元件的启动子不同。

利用这两种质粒再次对海绵共附生链霉菌开展操作,依然没有阳性结果。

之后针对陆生链霉菌S.coelicolorAS4.242操作,pCas9-2质粒成功实现了定点突变,阳性率在50%以上,且多次重复显示该系统能稳定工作。

基因位于染色体上的方法

基因位于染色体上的方法基因是指生物体内控制遗传特征的一段DNA序列。

它们位于染色体上，并通过遗传方式传递给后代。

在本文中，将介绍一些基因位于染色体上的方法。

1. 人类基因组计划：人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）是一个国际合作的科学研究项目，旨在确定人类遗传组成中的所有基因，并了解这些基因的功能。

该计划使用了基因座标系（Genome Coordinate System），通过对许多人的基因进行测序和比较，确定了每个基因位于染色体上的具体位置。

2. 链霉菌发酵法：链霉菌发酵法（Streptomyces fermentation）通过将链霉菌培养在适当的培养基中产生链霉菌素，然后通过组织培养和染色体置换等方法，将链霉菌素与目标基因染色体连接起来。

这样，就可以通过链霉菌的发酵产物来确定目标基因位于染色体上的位置。

4. 荧光原位杂交（FISH）：荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是一种常用的染色体检测方法，可以用来确定基因位于染色体上的位置。

该方法通过标记具有特定序列的探针，并将其与染色体样品进行杂交，然后使用荧光染料进行可视化。

通过观察标记染色体的荧光信号，可以确定目标基因位于染色体上的位置。

5. 倒位杂交：倒位杂交（Inversion Hybridization）是一种通过杂交实验确定基因位于染色体上的方法。

该方法使用带有特定标记的DNA探针与染色体进行杂交，并通过测试两者之间的杂交信号来确定基因位于染色体上的位置。

6.基因测序：基因测序是一种直接测定DNA序列的方法，也可用于确定基因位于染色体上的位置。

通过对染色体样本进行测序，可以得到基因序列信息，并通过与参考序列进行比对，确定基因位于染色体上的位置。

总结来说，基因位于染色体上的方法有很多种，包括人类基因组计划、链霉菌发酵法、阵列比较基因组杂交、荧光原位杂交、倒位杂交和基因测序等。

链霉菌基因实验操作

链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。

*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。

*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。

＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。

链霉菌(Streptomyces TE66 ) MalQ基因克隆与原核融合表达

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):1024~1028*基金项目：江西省教育厅项目(赣财教[2004]18号 18)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.博士，副教授，主要从事食品生物技术研究。

Tel:07918329081;Email ：<shuixingw@>. 收稿日期:2007618 接受日期:2007719·研究论文· 链霉菌( ST66) 基因克隆与原核融合表达 *王水兴 1 **，付金衡 1 ，龚珩 2 ，郭勇 3 ，夏慧玲 1，韩林强 1(1. 南昌大学中德联合研究院，南昌 330047； 2.九江学院医学院，九江 332005；3. 华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510641) 摘要：利用PCR 方法获得 ST66基因，将该基因插入原核表达载体 pTrcCKS 中，对质粒所含外源片段双向测序，并经 BLAST 比较分析，发现其与GenBank 中报道的基因的同源性高达97%。

重组质粒 pTrc 转化大肠杆菌（）Top 10F'，经IPTG 诱导后以融合蛋白形式表达，SDSPAGE 电泳显示基因与(CTP:CMP3deoxyDmannooctulosonate cytidylyltransferase or CMPKDO synthetase)基因表达的融合蛋白在目标位置约 106kD 处有明显条带。

经薄层层析分析粗酶液处理的麦芽三糖溶液，证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。

关键词：麦芽糖转糖基酶；基因克隆；融合表达；大环糊精；基因中图分类号:S188 文献标识码: A 文章编号:10061304(2007)06102405Cloning and Fusion Expression of the Gene fromWANG Shuixing 1 **， FU Jinheng 1 ， GONG Heng ２， GUO Yong 3 ， XIA Huiling 1 ，HAN Linqiang1The gene was amplified fromby PCR,cloned into pTrcCKS and sequenced. sequence was analyzed by BLAST and displayed high similarity (97%)to gene ofreported in GenBank.Therecombined plasmid pTrcwas transformed intoTop 10F'and induced by IPTG.gene and(CTP:CMP3deoxyDmannooctulosonate cytidylyltransferase or CMPKDO synthetase)gene fusion protein (molecular weight ： about 106 kD)could be detected by SDSPAGE gel electrophoresis.The crude enzyme was demonstrated having 4glucanotransferase activity with thin layerchromatography.amylomaltase;gene clone;fusion expression;cycloamylose;gene环状糊精是淀粉经酶降解而产生的，可以与疏水客体分子形成包合物，极大的改变了客体分子的物理化学特性，包括改变客体分子的水溶性、稳定性、挥发性以及药物分子的药效和口感等（Siegal ，1997； Sata ， 2001），甚至用于包埋去除一些有害物质（Rao ， 2000），在化学上用作催化剂（Granados and Rossi ， 2001）。

接合转移

链霉菌与大肠杆菌的属间接合转移
实验原理：质粒的转移性
• 细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程。 • 质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶的 tra 基因，质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体 DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大肠杆菌的 F 质粒。 • 有些质粒不含 tra 基因，但含有质粒转移起始位点oriT，虽不能自主转移，但能被其他一些含完整 tra 基因的质粒所诱动，这类质粒又被叫做可诱动质粒。
Hale Waihona Puke 实验产物 • 接合转移子: Streptomyces lividans ZX1 /pSET152
实验准备工作
菌株准备（教师做）： 1. 供体准备
a) 培养E. coli S17-1/pSET152：接种到液体LB培养基5ml + Apr 50μg/ml, 37℃震荡培养过夜。第二天扩大培养至 50ml LB+Apr 50μg/ml。 b) 浓缩：每 50ml 的培养物浓缩到 5ml ，每 1.5ml 的离心管分装1ml。
2. 准备链霉菌S. lividans ZX1的孢子
将链霉菌孢子用 TSB 清洗两遍，再用 TSB 悬浮，每 1.5ml 的离心管分装100ul。（需要现做现用）
操作步骤（第一天）
1. 清洗E. coli S17-1(pSET152），以除去残留的抗生素。每组同学取 1支装有 1ml 浓缩的 E. coli S17-1(pSET152 ），用无菌水清洗。先将1ml的菌液用12000 rpm/min，离心1 min，然后迅速到超净工作台倒去上清液。加入 1ml 的无菌水，在振荡器上将菌体打散混匀后，同样用12000 rpm/min，离心1 min。重复以上操作三次，最后将菌体用1ml的无菌水悬浮。 2. 孢子每组同学拿一支准备好的孢子放入 50℃水浴锅进行热激处理 10min 。然后转入 37℃水浴温浴培养 0.5-1 小时（预萌发）。将预萌发好的孢子用LB培养基清洗三次，最后用100ul LB悬浮。预萌发过程每四组找一个同学倒平板。第一、三、五、七组的第一个同学融化 1瓶250ml的培养基，倒平板10-11皿，供8个同学使用。

阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立

阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立马艳玲;刘富来;张敏;孙宇辉;洪葵【摘要】The objective of this study is to establish the gene transfer system of strain Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F,which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign genes. Intergeneric genetic transfer system of Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F was constructed by conjugating integrative plasmid pSET152 with pIB139. Results showed that 25 mg/mL apramycin may be used to efficiently screen conjugants. PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of Streptomyces sp. 211726. The continuous passage culture experiment demonstrated that transformed pSET152 and pIB139 of conjugants were stably inherited.%旨在建立阿扎霉素F产生菌链霉菌211726的基因转移系统，以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。

金色链霉菌接合转移体系的构建_方志锴

1
1． 1
材料与方法
材料
1．1．1
菌株与质粒大肠杆菌 Top10 为基因克隆受体菌，大肠杆菌 ET12567 （ pUZ8002 ）为接合转移供体菌，金色链霉菌（ Streptomyces aureofaciens ） J13 为接合转移受体菌，以上菌株均由本实验室保存．质粒
金色链霉菌对抗生素的敏感性试验
表1
Table 1 抗生素卡那霉素大观霉素安普霉素
1）
为确定接合转移系统的筛选标记以选择合适的载体，考察了金色链霉菌对链霉菌筛选常用的 3 种氨基糖苷类抗生素的敏感性（表 1 ）．从表 1 可见，金色链霉菌对所试抗生素均敏感，其中卡那霉素对其最小抑制浓度为 25 μg · mL ，安普霉素的最小抑－1 制浓度为 12． 5 μg · mL ．故本研究确定以卡那霉素抗性基因 neo 为筛选标记．该结果也证明了 pSET152 载体上安普霉素抗性基因 aac（ 3 ） Ⅳ的可用性． 2．2 接合转移质粒 pNEO152 的构建
相应的酶切位点：
）； JH4： 5'-GATATC GTCGACAGATCTAACGCGACCTCCCGTCTCG3' （ EcoRV， Bgl Ⅱ）； N1： 5'GAT 3' （ XhoⅠ GGTACC ACGTAGAAAGCCAGTCCG3' （ Kpn ）； N2： 5'GCA CTCGAG AGAACTCCAGCATGAGATC3' （ Xho ）． Ⅰ Ⅰ 1．2．3 金色链霉菌的接合转移
福建农林大学学报（自然科学版） Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （ Natural Science Edition）

微生物菌株产生链霉素抗性基因的扩散分析研究

微生物菌株产生链霉素抗性基因的扩散分析研究链霉素是一种广谱抗生素，广泛用于人畜兽医领域，但随着其广泛使用，链霉素抗性菌株也逐渐出现，给人畜兽医的治疗带来了一定难度。

链霉素抗性基因的扩散使得治疗链霉素感染的药物选择更加有限，因此对其扩散进行研究对抗击其扩散具有重要意义。

1.微生物菌株产生链霉素抗性的原因链霉素抗性通常是由链霉素合成酶（MLS）类基因造成的，该类基因能够破坏链霉素的生物活性。

通常情况下，链霉素抗性菌株可通过两种途径产生，一种是通过内源性基因突变而形成，常见于肺炎链球菌；另一种是通过水平基因转移，常见于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等。

水平基因转移是指不同菌株间以及不同物种间的基因交换。

在这个过程中，基因可通过转移元件如整合子、质粒和转座子等，在不同菌株间传播，并且快速演化。

由于这些转移元件广泛存在于不同的细菌中，使链霉素抗性基因极易扩散。

2.链霉素抗性基因扩散的机制链霉素抗性基因在不同细菌中的扩散主要有三种机制：水平基因转移，基因突变和基因扩增。

（1）水平基因转移水平基因转移是链霉素抗性基因在细菌间的主要扩散途径。

其中质粒是常见的转移元件之一。

许多链霉素抗性基因经常被编码在质粒中，包括ermB、ermC、ermF 和 msrA等。

质粒在不同菌株间的传输速度极快，因此很容易导致链霉素抗性基因发生水平转移。

此外，整合子和转座子也是途径之一。

（2）基因突变基因突变是指链霉素抗性基因在细胞内的变异引起生物学性质的变化。

在细胞的多代历程中，由于DNA复制发生错误，有极小的几率导致颠倒突变或单核苷酸多态性（SNPs）。

这种突变机制也可导致同时感染的细菌群中的基因互相抵消。

（3）基因扩增基因扩增是指在一些细菌中，通过复制、插入、重组等机制使得链霉素抗性基因增加并向后传递。

例如，啤酒酵母菌在链霉素抗性中，通常以反平行方向复制，进一步扩大链霉素抗性。

3.扩散的影响链霉素抗性基因在微生物群落中的扩散不仅导致临床表现上链霉素抗性的出现，还会影响到微生物系统本身。

螺旋链霉菌遗传操作系统-接合转移体系的建立

中国生物工程杂志China Biotechn〇l〇gy，2021，41 (2/3) :45-52D O I：10. 13523/j.c b.2010009螺旋链霉菌遗传操作系统-接合转移体系的建立王优蓓1郭思妤1常碧博2叶蕊芳1花强&(1华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室上海200237)(2河南天方药业股份有限公司驻马店463000)摘要背景：螺旋链霉菌（Sfreptomyces spiraTnyceiiciM)为国内螺旋每素（s p i ram y cin，S P M)的生产菌，但目前工业生产中螺旋链霉菌利用遗传操作进行基因改造还没有成功报道。

目的：建立螺旋链霉菌遗传操作系统，利用遗传改造的方法改变S P M的组分比例，降低S P M的分离成本。

方法：以大肠杆菌（Esc/ieric/iia c o h E T12567/p U Z8002)为供体，螺旋链霉菌为受体进行接合转移实验，建立螺旋链霉菌接合转移的遗传操作系统，并对影响接合转移效率的培养基种类、抗生素覆盖时间、供受体比例等条件进行优化。

结果：螺旋链霉菌不适合利用孢子进行接合转移，利用菌体进行接合转移时ISP4培养基为接合转移的最适培养基，供受体比例为103: 1得到的接合子数量最多，接合转移效率为丨.93 x l O—4，S P M中三种组分百分含量变化显著。

结论：实验首次建立了螺旋链霉菌接合转移的方法，利用菌体进行接合转移操作，简化了实验操作过程，并且利用C R I S R P/C a s9基因编辑系统成功阻断3-0-酰基转移酶基因，并在该位置导入cpC31整合位点a«B,为后续螺旋链霉菌的基因改造奠定了基础。

关键词螺旋链霉菌菌体接合转移螺旋霉竞中图分类号Q815螺旋霉素（spiramycin，S P M)是一种大环内酯类抗生素,对革兰氏阳性菌具有明显抑制作用，并对某些革兰氏阴性菌以及较难治疗的衣原体、支原体、弓形虫、隐孢子虫在某种程度上也具有抑制效果[1]。

链霉菌基因转移的方法

链霉菌基因转移的方法链霉菌基因转移是一种将DNA从一个链霉菌转移到另一个链霉菌的技术。

这种技术可用于研究链霉菌的遗传学和生物学特性，并有潜力用于开发新的抗生素和其他医疗用途。

下面是一篇介绍链霉菌基因转移方法的600字的文章。

链霉菌是一类广泛存在于土壤中的细菌，其在医学和工业领域中具有广泛应用。

然而，由于抗生素的广泛使用，链霉菌已经出现了许多抗药性品系。

因此，研究链霉菌的遗传学和生物学特性及开发新的抗生素就显得非常重要。

链霉菌基因转移技术是一种通过垂直传递DNA(水平基因转移除外),实现链霉菌之间互相转移DNA片段而创造出来的技术。

这种技术的本质是将源链霉菌中的目标DNA片段转移到宿主链霉菌中，从而使宿主链霉菌获得新的遗传信息和功能。

目前，有两种主要的链霉菌基因转移方法：穿孔体介导转移和转租介导的转移。

穿孔体介导转移是一种直接将目标DNA大量移植到受体链霉菌细胞内的方法，该过程通过细胞壁上的穿孔体完成。

转租介导的转移则依赖于质粒或噬菌体粒子的传递，这些粒子在源链霉菌细胞与宿主链霉菌细胞之间进行介导。

穿孔体介导转移：穿孔体介导转移需要以下步骤:1.构建包含目标DNA的质粒:在将DNA转移到宿主链霉菌之前，需要将目标DNA插入质粒中。

质粒是圆形双链DNA分子，在链霉菌基因转移中使用的质粒通常具有链霉菌和其他已知类型的细菌共同拥有的特殊序列。

2.培养链霉菌:源菌株和宿主菌株都需要进行培养，以确保细胞生长和适宜的质量准备。

3.接种源菌:将源菌株接种到一定数量的培养液中，以使链霉菌细胞增殖并产生目标DNA。

4.收集表达目标DNA的源菌细胞:通过离心等方法将源菌细胞收集到单独一盘中，以便进行下一步处理。

5.处理源菌细胞:源菌细胞需要被置于一个样品中，两边有电极，在通过一定电压传导下，细胞壁上的穿孔体会在细胞膜的通道中向宿主链霉菌传输目标DNA。

6.培养和筛选宿主链霉菌:转移到宿主细胞的DNA可能会获得宿主细胞的新功能，因此，宿主细胞需要被筛选出来，以确认是否达到预期的结果。

加纳链霉菌接合转移体系的建立与优化

加纳链霉菌接合转移体系的建立与优化王露;朱世扬;赵春田;裘娟萍【摘要】加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)是动物饲料添加剂黄霉素的主要生产菌.建立高效稳定的遗传操作系统是对该菌进行分子生物学研究和构建高产黄霉素基因工程菌的基础.以含有基因整合型重组质粒pIJ8630-nsdA的Escherichia coli ET12567/pUZ8002为供体、加纳链霉菌ATCC 14672为受体进行接合转移,通过单因素试验与正交试验对接合转移过程中的关键影响因素进行优化.结果表明,WL50培养基为接合转移最适培养基,当受体加纳链霉菌ATCC 14672孢子在50℃条件下热激10 min、37℃预培养3 h后,与供体按细胞数比例1:15混合后涂布于接合转移平板上,30℃培养14 h后覆盖50μg·mL-1安普霉素和500μｇ·ｍL－1 萘啶酸时，接合频率最高，比优化前提高20.3 倍.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2018(030)011【总页数】7页(P1965-1971)【关键词】黄霉素;遗传操作;接合转移【作者】王露;朱世扬;赵春田;裘娟萍【作者单位】浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州 310014;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州 310014;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州 310014;浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州 310014【正文语种】中文【中图分类】S816.7;Q78黄霉素，又称黄磷脂醇、默诺霉素、班堡霉素，是一种磷酸糖脂类抗生素，是目前唯一已知的能直接抑制肽聚糖糖基转移酶的抗生素［1］。

黄霉素具有促进动物生长、在动物体内和农畜产品中无残留、对环境无污染、不易产生耐药性等优点。

2001年，原农业部颁布的《饲料药物添加剂使用规范》中允许黄霉素预混剂作为饲料药物添加剂使用。

黄霉素杀菌作用较强，不与其他常用抗生素产生交叉抗性，能够抑制动物肠道中革兰氏阳性病原菌。

链霉菌基因实验操作

LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。

配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖103gK2SO4 0.25gMgCl2·6H2O 10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES 5.73g加蒸馏水至1000ml称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。

使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH2PO4(0.5%) 2.5mlCaCl2·2H2O(5M) 1mlL-脯氨酸(20%) 3.75mlNaOH(1M)调pH至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）Oxoid酵母提取物3gOxoid蛋白胨Tryptone 5g麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g葡萄糖10g蔗糖＊340g蒸馏水至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。

）MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L制备原生质体时，还要加入：甘氨酸（20%）＊25ml/L＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。

＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。

链霉菌基因转移的方法

5生物工程进展62002,Vol.22,No.1技术与方法链霉菌基因转移的方法吴胜夏焕章(沈阳药科大学生物制药系,沈阳110016)摘要本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法,涉及原生质体转化、电穿孔、接合转移和噬菌体转导,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。

关键词链霉菌原生质体转化电穿孔接合转移噬菌体转导链霉菌是一类重要的工业微生物,它可以产生各种各样的生物活性物质,越来越受到重视,链霉菌基因工程技术的发展,使得克隆次级代谢产物生物合成基因、有目的地定向改造基因、提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物成为可能。

在对一个链霉菌进行基因改造时,首要的问题就是建立所研究菌株的基因转移系统,这是实现对其基因功能分析、生物合成基因簇定位、基因改造等一系列工作的基础。

然而,有许多链霉菌,尤其是有实用价值的链霉菌在进行DNA转化时,均遇到很大困难。

为克服这一困难,科研人员进行许多研究。

通过分离内源性质粒、筛选噬菌体并通过改造其结构而构建了许多有用的克隆载体。

在方法学上也进行了许多有益的探索,建立了几种基因转移方法如转化、转导和接合转移等。

下面对这些方法在链霉菌中应用逐一进行介绍。

1转化包括PE G-介导的质粒转化原生质体(polyeth-ylene glycol-induced plasmid transformation of proto-plasts)和电穿孔(electroporation)。

前者是链霉菌基因操作中最常用的方法,后者主要用于植物和动物细胞,在链霉菌中也有成功的报道。

1.1PEG-介导的质粒转化原生质体转化大肠杆菌的关键是用冷刺激和CaCl2处理诱导感受态细胞,由此形成通过质粒中介的克隆操作,但这在链霉菌中尚无成功的报道。

在Okanishi 和他的合作者有关链霉菌原生质体形成、再生和转染工作的基础上,Bibb等发现当有PEG存在时,质粒DNA能以很高的频率转化变铅青链霉菌原生质体[1]。

链霉菌质粒复制与接合转移的研究的开题报告

链霉菌质粒复制与接合转移的研究的开题报告
1. 研究目的
链霉菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，其具有产生多种抗生素的能力，在医学和农业领域有着重要的应用价值。

本研究旨在探究链霉菌质粒的复制机制和接合转移过程，为深入理解链霉菌的遗传机理及其应用提供理论基础。

2. 研究方法
（1）构建质粒复制系统：利用分子克隆技术构建链霉菌质粒复制系统，包括复制起始位点、起始蛋白、DNA复制酶等元件。

（2）检测质粒复制效率：构建不同复制系统的链霉菌菌株，通过菌落计数和质粒DNA含量测定等方法检测质粒复制效率，并比较不同元件对复制效率的影响。

（3）研究质粒接合转移：通过共培养实验等方法研究链霉菌质粒接合转移的条件和机制，探究接合转移的启动因子及对遗传信息的影响。

3. 预期结果
通过构建质粒复制系统和研究接合转移过程，本研究预期可以深入了解链霉菌质粒的复制和传播机制，掌握对其进行基因工程改造的技术要点，提高链霉菌的生物学研究和利用水平。

4. 研究意义
本研究可为进一步发掘和利用链霉菌的遗传资源提供理论依据和技术支持，推动链霉菌在医学和农业领域的应用。

同时，本研究还可为其他细菌质粒复制和接合转移的研究提供借鉴和参考。

链霉菌基因转移的方法

ＤＡ的限制修饰作用可由以下几个因素中的一个Ｎ或几个共同决定：质粒的不相容性、Ｎｓ力、Ｄａｅ活限
制性内切酶。
１１１质粒的不相容性．．质粒的不相容性主要由两个方面的因素引起
改造其结构而构建了许多有用的克隆载体。在方法学上也进行了许多有益的掇索，建立了几种基因转
饰作用外，它的链霉菌都表现出程度不同的限制其修饰作用。如除虫链霉菌（ａｅｕ／ｓ中存在一Ｓ．ｖｎｔ／）ｒ／
体转导，影响链霉茼基因转移的各种因素进行了分析。对
链霉菌是一类重要的工业微生物，它可以产生各种各样的生物活性物质，越来越受到重视，霉菌链基因工程技术的发展，得克隆次级代谢产物生物使合成基因、目的地定向改造基因、高基因的表达有提水平以改造菌种的生产能力、因重组产生新化合基物成为可能。在对一个链霉菌进行基因改造时，首要的问题就是建立所研究菌株的基因转移系统，这
和再生率。据文献报道不同链霉菌原生质体形成和再生的条件不完全相同，要根据不同菌种的性质需加以改进。另外，链霉菌对外源ＤＡ普遍存在限制Ｎ修饰作用，也是影响转化成败的一个关键性因素。这除少数链霉菌如变铅青链霉菌（．ｉｄｒ和生二Ｓ１ｉ￣）ｖａ紊链霉菌（ｏ州ｎ）对外豫ＤＡ无限制修Ｓ．ｍｓ等Ｎ

冰城链霉菌属间接合转移体系的构建

科技创新实验论文冰城链霉菌属间接合转移体系的构建学生：邢月超、姚萌、白晶芝、丁秀云单位：生命科学学院指导教师：向文胜2012年9月23日冰城链霉菌属间接合转移体系的构建摘要：本次试验采用的冰城链霉菌是从土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，它能代谢产生米尔贝霉素，本次试验对于冰城链霉菌-大肠杆菌属间接合转移体系的构建方法条件进行了初步的摸索和优化，对于后续基因的转移等相关实验内容奠定了基础，便于后续相关操作的进行。

关键词：冰城链霉菌;大肠杆菌;属间接合;异源表达1.前言1.1冰城链霉菌简介冰城链霉菌（Streptomyces bingchenggensis）是由向文胜实验室从中国哈尔滨土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，并对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分及16S rDNA序列（DQ449953）等鉴定（Wang等，2009a；Xiang 等，2007a），通过与其它菌株进行比较，鉴定其是一新种链霉菌。

在高氏培养基表面冰城链霉菌生长紧密，随着时间的推移菌落颜色逐渐变深，有白色最终变成灰色。

油镜下观察基丝分枝，无横隔，不断裂；气丝分枝较多，较基丝粗?；成熟的菌丝直径为0.8-1.2 um，孢子丝为3-8圈紧密螺旋。

通过电镜观察孢子呈卵圆形，表面有明显的疣。

冰城链霉菌的线性染色体长度11936683 bp，菌内没有质粒存在，G+C含量为70.8%，这是迄今为止公布的较大的细菌基因组之一。

染色体上分为三个区域：7.2 Mb的核心区域，1.5 Mb的左臂和3.2 Mb的右臂。

通过分析，其上有10023个预测的蛋白编码序列，其中6 419个具有可知的或者潜在的功能。

83%的基因分布在核心区域，许多与次级代谢有关的基因则分布在两臂上。

初步数据分析，冰城链霉菌基因组上至少含有23个与聚酮化合物、非核糖体多肽和萜生物合成有关的基因簇。

其中的14个基因簇定位在染色体右臂，包括米尔贝霉素和冰城霉素；南昌霉素和其他5中?隐藏的基因簇位于染色体核心区域（Wang等，2010a）。

链霉菌实验操作技术

链霉菌实验操作技术
一、抗生素培养基
常用抗生素及其使用浓度
培养基
二、DNA基本操作
大肠杆菌质粒提取
酶连反应
DNA片段凝胶回收
DNA纯化
DNA片段末端补平
DNA片段去磷酸化处理
碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
碱裂解法提取链霉菌质粒DNA
碱裂解法提取链霉菌基因组DNA
醇沉法回收DNA
三、PCR及相关技术
PCR
引物设计（常规引物设计、重叠PCR引物设计、RT-PCR引物设计）
PCR定点诱变
四、基因片段转移技术
大肠杆菌CaCl2 法制备感受态细胞及DNA 转化
DNA 转化.
大肠杆菌质粒的快速检测
接合转移
Fosmid文库构建
PCR-Targeting 技术中E.coli 电转化感受态的制备及电转化五、RNA 操作技术
链霉菌总RNA 的抽提
链霉菌的RT-PCR
六、蛋白质基本操作技术
SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色
大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG 诱导的表达体系）
链霉菌总蛋白抽提
大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7 表达系统如BL21 菌株中的pET 系列表达体系）
七、其他技术
链霉菌孢子悬液的制备
链霉菌菌种保藏。

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

,期
夏焕章等：黑暗链霉菌 4L5 转移系统的建立
+O$
文献报道 !"#$ 及其衍生质粒在变铅青链霉菌中的拷贝数是 %& ’ $&，属于中等拷贝 !"#$，［(］数质粒，但 !)*+(, 在黑暗链霉菌中的拷贝数很低。同一质粒在不同的宿主中拷贝数不同，有时甚至差别很大，这一现象也曾在其它的链霉菌中发现过。尽管 !)*+(, 在黑暗链霉菌中拷贝数低，但结构稳定，未发现有诸如缺失等结构改变的现象发生。来自恶臭假单孢菌（ !"#$%&’&()" *$+,%) ）的 -./ - 基因编码产生邻苯二酚 ,，该酶可将无色的 (.双加氧酶，邻苯二酚转化成黄色的 ,.羟粘糖酸半醛。 -./ - 作为一种报告基因已被用于多种链霉菌
黑暗链霉菌 !"# 转移系统的建立 "
夏焕章吴胜
（沈阳药科大学生物制药系沈阳 00##01）
摘
要：研究了黑暗链霉菌的基因转移系统，探索了通过 5674介导的原生质体转化、接合转
移向黑暗链霉菌中转入外源 8,( 的可能性。多次尝试用质粒 )9:/#" 转化黑暗链霉菌 ..#! 原生质体均未成功。对原生质体进行 “热处理” 后转化、利用单链 8,( 转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中，表明黑暗链霉菌对外源 8,( 有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有 !"# ; 的大肠杆菌4链霉菌穿梭质粒 )<=0-" 转入大肠杆菌 6;0"21/ （ )>=?##"）中，获得供体菌（ )>=?##"，。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌 ..#! 的孢子进行接合转移，成 6;0"21/ )<=0-"）功地将 )<=0-" 转入黑暗链霉菌 ..#! 中。质粒 )<=0-" 经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌 ..#! 菌株的原生质体中，转化率约为 0#- @! （ )<=0-"）。 A 8,( 关键词：黑暗链霉菌，转化，接合转移中图分类号： B.-文献标识码： ( 文章编号： ###041"#.（"##"）#"4#0?04#2

微生物细胞为宿主的DNA转移方法

微生物细胞为宿主的DNA转移方法将连接有所需目的DNA片段的载体转入宿主细胞的方法因宿主细胞种类和DNA分子大小的不同而不同，常见的以微生物细胞为宿主的DNA转移方法主要有以下几种。

(1)感受态转化法转化是细胞吸收游离DNA的过程。

一般而言，只有感受态细胞才能率地吸收外界的DNA。

转化是用质粒作载体所常用的导入方法。

对大肠杆菌，zui常用的感受态细胞制备方法是CaCl2(或RbCl)法，该方法简便易行，其转化效率虽不很高，但足以满足一般实验的要求，且制备的感受态细胞在一70℃下可保存较长时间，因此使用广泛。

CaCl2法制备感受态细胞的大致流程。

将感受态菌体与重组DNA分子混合物，在42℃水浴中热激处理数分钟，然后放回冰水浴中保持半小时，就可完成转化。

CaCl2法的关键是要处理对数生长期的细胞，并尽量保持低温操作。

CaCl2法外，大肠杆菌感受态的制备方法还有Hanahan法和Inoue法等，这些方法制备的感受态的转化效率均远高于CaCl2法．但由于操作比较麻烦，所用试剂也较不常见，故反而不如CaCl2法使用普遍。

有些细菌可以自然生成感受态，利用转化来转移DNA就比较方便。

酵母也可以采用醋酸锂法实现转化，但须用单链DNA。

对于无法诱导感受态或无法自然生成感受态的细胞，就必须采用其他DNA转移方式。

(2)原生质体转化法通常完整细胞只有在感受态下才能吸收外源DNA。

对于难以得到感受态细胞的微生物，一种替代的方法是采用PEG介导的原生质体转化法。

一些杆菌、链霉菌、酵母和霉菌等的转化经常采用该方法。

(3)高压电穿孔转化法电穿孔是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。

电穿孔的机理仍不清楚，一般认为，受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层接触，并引发吸收过程。

不同的细胞电穿孔的操作条件也不同。

以大肠杆菌为例，一般调节电脉冲为25μF，电压2．5kV，电阻200Ω，作用时间约为4．6ms。