链霉菌总DNA提取

1. 链霉菌总DNA提取
讲义
1。

1 菌丝体
用YEME、TSB、TSBY培养，蔗糖浓度：34% SCO, Slividans，分散菌丝体; 10 % 其他菌种，有的不适于在高糖条件下生长。

是否污染：闻气味；看清汤。

1。

2 DNA提取
NaOH使线形DNA变性
苯酚不能除去多糖，使上清不澄清，此时可用盐析法除多糖和蛋白质。

注意：菌丝体用量不能多。

SDS量：2%SDS与溶菌酶溶液等体积。

乙醇（2X）沉淀：特异性优于异丙醇，然而体积大。

-20︒C，1 hs, 或 4︒C，O/N，时间越长越好，可用于长距离携带。

异丙醇沉淀时间：=< 10 MIN,room temperature,不能置于 4︒C， -20︒C
A 溶菌：菌丝体用量不能多！需溶菌酶，作用时间可长可短，溶菌完全即可，但不能O/N
溶菌酶溶液用缓冲液配，高渗或等渗：原生质体同步裂解，在不需要时不裂解。

菌丝体培养基中加入甘氨酸，使肽聚糖骨架变松，对溶菌酶更敏感。

B
CDEFGHIJ
SDS法
2.9.1 链霉菌总DNA少量快速提取
收集链霉菌菌丝体并用10.3%蔗糖洗涤1次，将100ul菌丝体在eppendorf离心管中用TE洗涤1次, 于菌体沉淀块中加入500ul溶菌酶溶液, 用自动移液器吸管头快速、强烈抽吸以悬浮和裂解细胞直到溶液变粘稠。

加入50ul 20% SDS,（或100ul 10% SDS）混匀, 37℃保温10分钟后, 加入0.5倍体积的中性苯酚/氯仿, 混匀后离心, 向上清液加入0.1倍体积NaAC(pH4.8)和等体积异丙醇, 颠倒混匀, 将白色絮状沉淀挑出到70%乙醇中洗涤, 离心, DNA沉淀块再分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤后溶解在适量TE缓冲液中。

2.9.2 大片段链霉菌总DNA提取(用于构建基因文库)
适量的菌丝体(50ml液体培养物), 溶于10ml含2mg/ml溶菌酶的LRTE溶液(2mg/ml溶菌酶, 25mM Tris-HCl pH8.0), 100mM EDTA (pH8.07, RNase 50ug/ml)中, 37℃溶菌至溶液清澈透亮。

加入蛋白酶E至终浓度为0.2mg/ml, 小心轻轻混匀, 30℃, 30分钟, 加入20%SDS 至终浓度为1%, 立即轻轻倾斜混匀, 37℃水浴2小时。

冷却至室温, 加入等体积中性苯酚, 轻轻混匀(约需10分钟), 使液体均一相形成乳浊液, 5000g离心15分钟, 用大口径移液管转移上清液, 根据中间蛋白质的多少, 重复使用中性苯酚抽提。

经中性苯酚抽提了的上清液, 再用氯仿抽提两次。

最后向上清液中加入0.4倍体积的7.5M NH4AC和两倍体积的无水乙醇, 小心转动离心管以充分混匀, DNA立即形成白色絮状沉淀。

小心挑出絮状沉淀团到5ml 70%乙醇中洗涤两次, 再用无水乙醇洗涤1次, 自然风干(勿使沉淀完全干燥, 否则极其难溶), 加入适量TE缓冲液, 4℃过夜溶解DNA。

经脉冲电场凝胶电泳检测发现用这种方法提取的总DNA片段在90-160kb之间。

DNA溶液中蛋白质及RNA的去除
一般是用Tris饱和的苯酚或苯酚/氯仿抽提DNA溶液以除去溶液中的蛋白质。

向DNA 溶液中加入等体积的Tris饱和的苯酚或苯酚/氯仿(pH7.8-8.0), 若DNA分子小于10kb, 可采用剧烈振荡的方式充分混合有机相与水相, 若DNA分子在10-30kb之间, 可通过轻轻摇动进行混合, 若DNA分子大于30kb, 则需要轻轻转动和颠倒进行混合, 以免DNA被剪切。

离心分离两相, 取上层的水相(DNA分子大于30kb时, 应使用大口径吸管), 重复抽提数次直至有机相与水相之间看不到白色物为止。

最后用等体积氯仿抽提两次以除去可能残留在溶液中的苯酚。

对于DNA样品中存留的的RNA, 可以通过加入0.1倍体积的8M LiCl, 混合后置冰浴中30分钟, 15000g离心10分钟, 取上清液而弃去沉淀物(大分子RNA), 再向上清液中加入RNase至终浓度为20ug/ml, 37℃, 30分钟, 即可沉淀DNA。

有时在提取质粒和总DNA时, 向粗提液中加入RNase到终浓度为10ug/ml, 37℃水浴30分钟后, 用上述方法去除蛋白质。