分子生物学研究策略-基因表达技术共107页
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基因表达技术
识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA 序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA 序列可转录翻译成多肽 链而特意设计的载体称为表达载体。
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物 酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
1.化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
Eco RⅠ
Eco RⅠ
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection)
感染 (infection)
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体
2.从基因组DN带的所 有基因组DNA的集合
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
限制酶切位点
cos L
R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA 序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA 序列可转录翻译成多肽 链而特意设计的载体称为表达载体。
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物 酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
1.化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
Eco RⅠ
Eco RⅠ
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection)
感染 (infection)
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体
2.从基因组DN带的所 有基因组DNA的集合
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
限制酶切位点
cos L
R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
分子生物学第九讲核生物基因表达调控
大类：
第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于 原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底 物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓 度的调节。
第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因 调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发 育的全部进程。
3
研究基因调控主要应回答3个问题： ① 什么是诱发基因转录的信号？ ② 基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转
列通常成串出现在随时准备好转录或转译的脱氧核 糖核酸中，这段序列称为CG岛。
29
30
▲ 甲基化酶
①日常型 （mainteance） 有模板
②从头合成型 （ denovo synthesis）
31
▲ 在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度 很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较 低.
▲ 去甲基化又可使基因恢复活性。
包括转录起始位点和TATA盒。 核心启动子单独起作用时，只能确定转
录起始位点并产生基础水平的转录。
43
b 上游启动子元件（upstream promoter element， UPE）
包括CAAT盒和GC盒等，能通过TFⅡD符合 物调节转录起始的频率，提高转录效率。
44
45
B 增强子(enhancer) 能使和它连锁的基因转录频率明显增加的
26
27
5) DNA的甲基化与去甲基化 A 甲基化 ◆ DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,可 能存在于所有高等生物中，DNA甲基化能关 闭某些基因的活性，去甲基化诱导了基因的 重新活化和表达 ◆ DNA甲基化的主要形式：CpG、CpXpG、 CCA/TGG和GATC
28
▲ CG islands 高等真核生物中包含未甲基化CpG双核甘酸序
第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于 原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底 物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓 度的调节。
第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因 调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发 育的全部进程。
3
研究基因调控主要应回答3个问题： ① 什么是诱发基因转录的信号？ ② 基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转
列通常成串出现在随时准备好转录或转译的脱氧核 糖核酸中，这段序列称为CG岛。
29
30
▲ 甲基化酶
①日常型 （mainteance） 有模板
②从头合成型 （ denovo synthesis）
31
▲ 在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度 很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较 低.
▲ 去甲基化又可使基因恢复活性。
包括转录起始位点和TATA盒。 核心启动子单独起作用时，只能确定转
录起始位点并产生基础水平的转录。
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b 上游启动子元件（upstream promoter element， UPE）
包括CAAT盒和GC盒等，能通过TFⅡD符合 物调节转录起始的频率，提高转录效率。
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B 增强子(enhancer) 能使和它连锁的基因转录频率明显增加的
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5) DNA的甲基化与去甲基化 A 甲基化 ◆ DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,可 能存在于所有高等生物中，DNA甲基化能关 闭某些基因的活性，去甲基化诱导了基因的 重新活化和表达 ◆ DNA甲基化的主要形式：CpG、CpXpG、 CCA/TGG和GATC
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▲ CG islands 高等真核生物中包含未甲基化CpG双核甘酸序
新编文档分子生物学原理--基因表达调控精品文档PPT课件
• 操纵子： 几个相关基因排列在一起，转录出一个 mRNA，翻译出多种具相关功能的蛋白 质，完成一个功能 。
• 有一个调控成分。 • 是原核生物的转录单位。
2020/11/9
分子生物学原理
4
第一节、原核生物的操纵子调控模式
一、酶的诱导（enzyme induction） 二、操纵子（operon）的结构与功能 三、乳糖操纵子（Lac operon）与色氨
分子生物学原理
24
四、cAMP对转录的调控
• 培养基中有葡萄糖时：葡萄糖代谢引起 细胞内cAMP水平下降，乳糖操纵子基因 关闭。
• 培养基中葡萄糖不足时： cAMP水平升 高， cAMP-CAP复合物生成， cAMP使 CAP变构，而与CAP位点结合，促进乳 糖操纵子基因的转录，以便细胞利用乳 糖。
17
DDRP
(1kb)
(155000)
DDRP
2020/11/9
分子生物学原理
18
色氨酸操纵子
• 色氨酸操纵子有5个结构基因 D、E基因：共产生邻氨基苯甲酸合成酶 C基因：产物是吲哚甘油磷酸合成酶 B、A基因：共同产物是色氨酸成。
• 色氨酸合成仅限细菌。
2020/11/9
分子生物学原理
19
色氨酸操纵子调控方式
（-）
（+）
2020/11/9
分子生物学原理
20
乳糖和色氨酸操纵子的共同点
• 以负调控方式为主：蛋白质分子（阻遏 物）对受调控的区域起抑制作用。
• 由低分子物质（底物或产物）影响蛋白 质对DNA的结合。
• 结果： 既满足细胞生长需求，又不无谓浪费。
无
葡萄糖
乳糖
2020/11/9
• 有一个调控成分。 • 是原核生物的转录单位。
2020/11/9
分子生物学原理
4
第一节、原核生物的操纵子调控模式
一、酶的诱导（enzyme induction） 二、操纵子（operon）的结构与功能 三、乳糖操纵子（Lac operon）与色氨
分子生物学原理
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四、cAMP对转录的调控
• 培养基中有葡萄糖时：葡萄糖代谢引起 细胞内cAMP水平下降，乳糖操纵子基因 关闭。
• 培养基中葡萄糖不足时： cAMP水平升 高， cAMP-CAP复合物生成， cAMP使 CAP变构，而与CAP位点结合，促进乳 糖操纵子基因的转录，以便细胞利用乳 糖。
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分子生物学原理
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色氨酸操纵子
• 色氨酸操纵子有5个结构基因 D、E基因：共产生邻氨基苯甲酸合成酶 C基因：产物是吲哚甘油磷酸合成酶 B、A基因：共同产物是色氨酸成。
• 色氨酸合成仅限细菌。
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分子生物学原理
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色氨酸操纵子调控方式
（-）
（+）
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分子生物学原理
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乳糖和色氨酸操纵子的共同点
• 以负调控方式为主：蛋白质分子（阻遏 物）对受调控的区域起抑制作用。
• 由低分子物质（底物或产物）影响蛋白 质对DNA的结合。
• 结果： 既满足细胞生长需求，又不无谓浪费。
无
葡萄糖
乳糖
2020/11/9
医学分子生物学上用基因功能研究的基本策略PPT课件
1. 外源目的基因分离； 2. 转基因与表达载体重组； 3. 重组的转基因导入受精卵或胚胎干细胞； 4. 转基因胚胎的培养和移植； 5. 胚胎发育和生长的鉴定及转基因动物品系的筛选； 6. 外源目的基因的整合率和表达效率检测。
（一）基本原理
供体基因 受体的受精卵
（一）基本原理
转基因的受精卵
（一）基本原理
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验：金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。
转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
二、动物转基因技术的基本原理
染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
蛋白水平方法
PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot
转基因动物
（二）基本过程
上游—基因改造和载体构建 中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位，由顺式作用元件、
结构基因和转录终止信号组成。
报告基因 : 在表达载体中引入易于检测的报告基
因。GFP、 LacZ’、Apr。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报
告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接 成完整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
（一）基本原理
供体基因 受体的受精卵
（一）基本原理
转基因的受精卵
（一）基本原理
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验：金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。
转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
二、动物转基因技术的基本原理
染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
蛋白水平方法
PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot
转基因动物
（二）基本过程
上游—基因改造和载体构建 中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位，由顺式作用元件、
结构基因和转录终止信号组成。
报告基因 : 在表达载体中引入易于检测的报告基
因。GFP、 LacZ’、Apr。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报
告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接 成完整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
分子生物学技术讲座基因表达调控的研究方法
分子生物学技术讲座基因表达调控的研究方法的分子生物学技术讲座——基因表达调控的研究方法基因表达调控的研究已成为当代分子生物学的一个研究热点。
所谓的基因表达就是指生物体内基因组中特定的结构基因在特定的条件下通过转录、翻译等一系列的复杂过程，合成具有特定氨基酸序列并具有特定生物学功能的蛋白质分子。
但是基因组上的所有结构基因并非在所有的细胞中同时都表达，每一个特定的结构基因的表达都是在生物体发育的特定阶段，在特定的组织中或细胞中才得以进行，即生物体内基因的表达具有选择性和程序性，而且表达的数量也是特定的，这就是基因表达的调控。
由于基因表达的调控是一个多水平(即基因组、转录、转录后、翻译和翻译后)的复杂过程，所以研究基因表达调控的方法种类繁多，新方法、新技术层出不穷。
目前常用的方法有：DNase Ⅰ超敏感分析法、DNA甲基化分析、蛋白-核酸紫外交联法、体外转录分析法、氯霉素乙酰转移酶分析、足纹法、凝胶滞留法、Northern印迹法、转录起始点分析法、二相杂交法、三相杂交法和Western印迹法等。
在此仅择其最常用的或最新的方法加以详细介绍。
1 Northern印迹法Northern印迹法又称RNA印迹法，它的工作原理和操作过程与Southern印迹法基本相同。
所不同之处是Northern印迹法是将电泳分离的RNA从凝胶中转移至固相的支持物上。
其基本操作过程是从细胞或组织中提取的总体RNA，经变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜上或尼龙膜上，然后用特异性放射性探针去检测目的基因的表达状况，见图(1)。
如果对Northern印迹法的放射自显影结果进行密度扫描或计算机技术分析，就可定量分析被检测的目的基因在不同的组织中或细胞中的表达状况。
目前此方法广泛地应用于基因表达水平的研究。
2 足纹法足纹法是测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点的实验方法。
它可以分成二大类，即保护法和干扰法。
保护法的原理是DNA结合蛋白与其特异的DNA序列结合，可保护其结合序列免受某些DNA断裂试剂(DNase Ⅰ、核酸外切酶Ⅱ、羟自由基等)的作用。
最新原核基因表达调控1分子生物学_图文PPT课件
•
活化子以其一个表面结合到启动子附近的某一DNA位点
；同时以另一表面与RNA聚合酶相互作用，将聚合酶带
到启动子（图16-1c）。
•
活化子与RNA聚合酶的相互作用，以及活化子与DNA的
相互作用，只起到黏合作用：活化子只是将酶带到启动子
附近。
某些活化子通过变构和调控RNA聚合酶或DNA的 构象改变而起作用
即使室内环境保持稳定的高等哺乳类，也经常 要变动基因的表达来适应环境。例如与适宜温 度下生活相比较，在冷或热环境下适应生活的 动物，其肝脏合成的蛋白质图谱就有明显的不 同。
长期摄取不同的食物，体内合成代谢酶类的情 况也会有所不同。
基因表达调控是生物适应环境生存所必需的。
•
基因表达调控主要表现在以下几个方面：
终止子(terminator T)是给予RNA聚合酶转录 终止信号的DNA序列。
操纵子中结构基因群最后一个基因的末端 存在一个终止子。
终止子按其作用可分为不依赖ρ因子的强终 止子和依赖ρ因子的弱终止子。
⑤ 调控基因
调控基因(regulatory gene)是编码能与操作子 结合的调控蛋白的基因。
• 在有些情况下，RNA聚合酶不需要协助就可 以结合在DNA上并形成稳定的闭合复合体， 但是这一闭合复合体却不能自动转变为开放复 合体（图16-2a）。在这种启动子上，必须由 活化子刺激闭合复合体转变为开放复合体，因 此，这一转变就是限速步骤。
活化子与稳定的闭合复合体相互 作用诱导构象发生改变，引起闭 合复合体向开发复合体的转变。
参与调控基因转录效率的蛋白质因子，可以直接或间 接识别或者结合顺式作用元件核心序列，可对基因表 达产生激活或阻遏的作用。
结构基因与调控基因
分子生物学分子生物学研究方法ppt课件
ppt课件.
蛋白质芯片39的制备
ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
等离子表面共振技术
将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于 纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合 物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋 白发生相互作用，那么两者的结合将使 金属膜表面的折射率上升，导致共振角 度的改变。
该技术不需要标志物和染料，安全灵敏快速， 还可定量分析。缺点是需要专门的仪器。
34
ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
Far Western印迹技术
用 32P 标 记 的 体 外 表达蛋白作探针,直 接检测与该蛋白发 生相互作用的蛋白 或表达该蛋白的 cDNA。
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6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
GST融合蛋白沉降技术
利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球 珠的亲和性，从混合蛋白质样品中 纯化得到相互作用蛋白。
26
ppt课件.
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
酵母单杂交的基本原理：
①将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启 动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin 下游。
②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激 活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞， 该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合， 就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。
17
ppt课件.
6.2 基因敲除技术
基因敲除分两种：
完全基因敲除、条件型基因敲除（又称不完全基 因敲除）。
完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细 胞或者动物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除。
噬菌体Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞 的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种 定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
基因表达教学课件ppt
翻译是将基因中的遗传信息转变成蛋白质的过程，是基因表达的重要环节之 一。
翻译的场所
翻译主要在细胞质的核糖体上进行，核糖体是由RNA和蛋白质组成的复合体 。
翻译的起始
起始密码子
翻译的起始信号是mRNA上的起始密码子，它与核糖体上的起始因子结合，起始 翻译过程。
起始因子的作用
起始因子与起始密码子结合后，可以促进核糖体与mRNA的结合，并启动翻译过 程。
02
基因表达研究在农业领域也得到了广泛应用，通过对植物和动物基因表达的研 究，可以更好地了解生长发育和适应环境的机制，提高生产效率。
03
基因表达研究在环境科学领域也扮演着重要的角色，通过对不同生物在相同环 境下的基因表达比较，可以更好地了解生物对环境的适应性，为环境保护提供 科学依据。
基因表达研究的发展趋势
02
基因表达的转录
转录的概述
01
02
03
定义
转录是指将DNA序列转 化为RNA序列的过程。
转录的酶
转录需要RNA聚合酶的 参与。
转录的场所
转录主要发生在细胞核内 。
转录的启动
启动子
转录的启动子是RNA聚合酶识别和结合DNA序列的位点。
转录起始复合物
启动子与RNA聚合酶结合形成转录起始复合物。
转录起始复合物的形成过程
基因表达谱
通过基因表达谱可以了解疾病状态下哪些基因在发生变化，从而 为疾病的诊断提供依据。
生物标志物
一些基因表达产物可以作为疾病的生物标志物，例如：前列腺癌 中的PSA基因。
疾病分型
基因表达数据可以用于疾病的分型，例如：肺癌可以分为鳞状细 胞癌、腺癌和小细胞肺癌。
基因表达异常与疾病的治疗
靶向治疗
翻译的场所
翻译主要在细胞质的核糖体上进行，核糖体是由RNA和蛋白质组成的复合体 。
翻译的起始
起始密码子
翻译的起始信号是mRNA上的起始密码子，它与核糖体上的起始因子结合，起始 翻译过程。
起始因子的作用
起始因子与起始密码子结合后，可以促进核糖体与mRNA的结合，并启动翻译过 程。
02
基因表达研究在农业领域也得到了广泛应用，通过对植物和动物基因表达的研 究，可以更好地了解生长发育和适应环境的机制，提高生产效率。
03
基因表达研究在环境科学领域也扮演着重要的角色，通过对不同生物在相同环 境下的基因表达比较，可以更好地了解生物对环境的适应性，为环境保护提供 科学依据。
基因表达研究的发展趋势
02
基因表达的转录
转录的概述
01
02
03
定义
转录是指将DNA序列转 化为RNA序列的过程。
转录的酶
转录需要RNA聚合酶的 参与。
转录的场所
转录主要发生在细胞核内 。
转录的启动
启动子
转录的启动子是RNA聚合酶识别和结合DNA序列的位点。
转录起始复合物
启动子与RNA聚合酶结合形成转录起始复合物。
转录起始复合物的形成过程
基因表达谱
通过基因表达谱可以了解疾病状态下哪些基因在发生变化，从而 为疾病的诊断提供依据。
生物标志物
一些基因表达产物可以作为疾病的生物标志物，例如：前列腺癌 中的PSA基因。
疾病分型
基因表达数据可以用于疾病的分型，例如：肺癌可以分为鳞状细 胞癌、腺癌和小细胞肺癌。
基因表达异常与疾病的治疗
靶向治疗
基因表达研究技术
基因表达系列分析技术—SAGE
(p193)
定义：一种以DNA序列测定为基础定量分析 全基因组表达模式的技术。能直接读出任何 一种细胞类型或组织的基因表达信息 原理：mRNA3‘末端部位存在可标识其特异 性的标签，长度在9-14个bp，检测标签可 获得该mRNA的表达信息。标签通过串联连 接于克隆载体上，便于测序，同时根据同一 标签重复次数，可计算其对应基因表达频率
基因芯片的应用
基因表达分析 基因型、基因突变和多态性分析 （SNP） 疾病的诊断与治疗 药物研究中的应用
凝胶阻滞试验 (p223)
原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将 增加，在电泳中移动的速率减小，没有结 合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这 一原理可分离纯化细胞提取物中特定 DNA结合蛋白
转基因和同源的内 源基因的表达都被 抑 –共抑制
基因芯片(p214)
原理：将一系列的核酸片段固定在芯片载体 上作为固相靶片段，待测的核酸片段人工标 记上不同的荧光、或同位素等作为探针，一 定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号 即可获得靶片段的信息，进行计算机分析 过程：芯片制备、样品制备、杂交反应和信 号检测和结果分析
标签通过串联连接于克隆载体上便于测序同时根据同一标签重复次数可计算其对应基因表达频率双链cdna合成ae酶消化ab连接子分离标签酶消化klenow酶连接形成双标签片段pcr扩增锚定酶切割连接克隆至载体肿瘤分子机制rnap195rna选择性剪接
基因表达研究技术
SAGE RNA选择性剪切 原位杂交 基因定点突变 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
2 聚合酶链式反应（PCR）可以在体外快速扩 增特异基因，其特异性主要取决于（） A 反应体系中模板DNA的量 B 反应体系中DNA聚合酶的种类 C 引物序列的结构和长度 D 反应体系中四种dNTP的浓度
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有微好氧菌和专性厌氧菌。
Lactic Acid Bacteria
Genera:
– Streptococcus – Leuconostoc – Pediococcus – Lactobacillus – Enterococcus – Lactococcus
All the above genera grow in chains. Many are used for the food industry.
淀粉酶，抗真菌肽 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium
淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus
蛋白酶
球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 灭蚊毒素蛋白
嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温-淀粉酶
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 杀虫晶体蛋白
枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和 质粒适合用作克隆载体。
芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如-淀粉酶， 蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵 技术发达。
具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。 易于分离纯化分泌蛋白
2）枯草杆菌宿主菌株 由菌于无大效肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆
（1）选择可转化的菌株 *168菌株及突变体： 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、 重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插 入
（7）益生菌（PROBIOTICS）
Lactobacillus and Bifidobacterium
食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公 认的安全的食品级微生物的基因，因此具有 某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。
1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全 的食品级微生物；
SDS-PAGE
（3）抗微生物和食品腐败
（4）细胞表面层和外多糖
利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭 亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反 共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA 小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管 电泳鉴定技术。
转基因植物） 3.6 微阵列分析
**基因表达系统
1、大肠杆菌表达系统 2、芽孢杆菌表达系统 3、乳酸菌基因表达系统 4、链霉菌基因表达系统 5、酵母菌表达系统 6、丝状真菌表达系统 7、昆虫表达系统 8、哺乳动物细胞表达系统 9、植物生物反应器
1、大肠杆菌表达系统（Gene Expression
2）理想乳酸菌表达载体的特征： 1、稳定的遗传、传代能力（复制子） 2、具有显性的转化筛选标记（Emr ） 3、启动子的转录是可以调控 4、具有多克隆酶切位点
3）研究进展 （1）食品发酵方面的应用
（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis） 16S rRNA （PCR ）
（5）蛋白质降解、多肽降解和脂降解
（6）分子遗传学 基因克隆 表达调控 染色体分析
Insulin Gene inserted into Plasmid
Recombinant DNA Absorbed by Bacteria
Bacteria Produces Insulin
Insulin Ready to be Administered to Diabetic Patients
真核基因在不同表达系统的表达
表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)
大肠杆菌表达系统
20-30u
地衣芽孢杆菌表达系统 250-300u
酵母菌表达系统
20u
哺如动物细胞
2u
2、芽胞杆菌表达系统（Gene
Expression system in Bacillus）
1）特点
枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生 长在有氧条件下。
（2）选择转化的方法 感受态转化： 原生质体转化： 电转化：甘氨酸添加培养感受态 其它方法，如转导、结合转移
3）、可作为宿主的其它菌种： 嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus
蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus
-淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis
3、乳酸菌基因表达系统（Gene
Expression system in Lactic Acid Bacteria）
1）特点： 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽
孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
大多数不运动，少数以周毛运动。 菌体常排列成链。
在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵， 而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO ２等物质的称为异型乳酸发酵。
耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶
炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis
4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势
1、表达真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂
2、表达商业用酶 克隆基因的整合
3、表达杀虫晶体蛋白 提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱
4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加 强在医药领域多个方面的应用
分子生物学研究策略-基因表达技术
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
分子生物学研究策略
3、基因分子生物学的基本技术 3.1 基因的分子杂交技术 3.2 基因的扩增技术（PCR） 3.3 基因的突变技术（转座技术） 3.4 基因的表达技术 （表达系统） 3.5 转基因技术 （转基因动物、
system in E.coli）
1）大肠杆菌表达系统 的特点： （1）遗传背景清楚 （2）目的基因表达水
平高 （3）培养周期短 （4）抗感染能力强
2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
完善现有的表达系统； 重组蛋白质的正确折叠Байду номын сангаас 构象形成； 蛋白质的分泌； 菌体表面表达技术及其应用； 重组蛋白质修饰加工。
Lactic Acid Bacteria
Genera:
– Streptococcus – Leuconostoc – Pediococcus – Lactobacillus – Enterococcus – Lactococcus
All the above genera grow in chains. Many are used for the food industry.
淀粉酶，抗真菌肽 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium
淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus
蛋白酶
球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 灭蚊毒素蛋白
嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温-淀粉酶
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 杀虫晶体蛋白
枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和 质粒适合用作克隆载体。
芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如-淀粉酶， 蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵 技术发达。
具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。 易于分离纯化分泌蛋白
2）枯草杆菌宿主菌株 由菌于无大效肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆
（1）选择可转化的菌株 *168菌株及突变体： 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、 重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插 入
（7）益生菌（PROBIOTICS）
Lactobacillus and Bifidobacterium
食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公 认的安全的食品级微生物的基因，因此具有 某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。
1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全 的食品级微生物；
SDS-PAGE
（3）抗微生物和食品腐败
（4）细胞表面层和外多糖
利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭 亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反 共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA 小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管 电泳鉴定技术。
转基因植物） 3.6 微阵列分析
**基因表达系统
1、大肠杆菌表达系统 2、芽孢杆菌表达系统 3、乳酸菌基因表达系统 4、链霉菌基因表达系统 5、酵母菌表达系统 6、丝状真菌表达系统 7、昆虫表达系统 8、哺乳动物细胞表达系统 9、植物生物反应器
1、大肠杆菌表达系统（Gene Expression
2）理想乳酸菌表达载体的特征： 1、稳定的遗传、传代能力（复制子） 2、具有显性的转化筛选标记（Emr ） 3、启动子的转录是可以调控 4、具有多克隆酶切位点
3）研究进展 （1）食品发酵方面的应用
（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis） 16S rRNA （PCR ）
（5）蛋白质降解、多肽降解和脂降解
（6）分子遗传学 基因克隆 表达调控 染色体分析
Insulin Gene inserted into Plasmid
Recombinant DNA Absorbed by Bacteria
Bacteria Produces Insulin
Insulin Ready to be Administered to Diabetic Patients
真核基因在不同表达系统的表达
表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)
大肠杆菌表达系统
20-30u
地衣芽孢杆菌表达系统 250-300u
酵母菌表达系统
20u
哺如动物细胞
2u
2、芽胞杆菌表达系统（Gene
Expression system in Bacillus）
1）特点
枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生 长在有氧条件下。
（2）选择转化的方法 感受态转化： 原生质体转化： 电转化：甘氨酸添加培养感受态 其它方法，如转导、结合转移
3）、可作为宿主的其它菌种： 嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus
蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus
-淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis
3、乳酸菌基因表达系统（Gene
Expression system in Lactic Acid Bacteria）
1）特点： 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽
孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
大多数不运动，少数以周毛运动。 菌体常排列成链。
在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵， 而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO ２等物质的称为异型乳酸发酵。
耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶
炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis
4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势
1、表达真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂
2、表达商业用酶 克隆基因的整合
3、表达杀虫晶体蛋白 提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱
4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加 强在医药领域多个方面的应用
分子生物学研究策略-基因表达技术
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
分子生物学研究策略
3、基因分子生物学的基本技术 3.1 基因的分子杂交技术 3.2 基因的扩增技术（PCR） 3.3 基因的突变技术（转座技术） 3.4 基因的表达技术 （表达系统） 3.5 转基因技术 （转基因动物、
system in E.coli）
1）大肠杆菌表达系统 的特点： （1）遗传背景清楚 （2）目的基因表达水
平高 （3）培养周期短 （4）抗感染能力强
2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
完善现有的表达系统； 重组蛋白质的正确折叠Байду номын сангаас 构象形成； 蛋白质的分泌； 菌体表面表达技术及其应用； 重组蛋白质修饰加工。