第七章DNA体外重组与基因转移总结
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T4-DNA ligase Pst I
5' 5'
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
GGATC CCTAG 5'
5'
5'
5' GATCC CTAGG
T4-DNA ligase 5' 5' CGATCC GCTAGG GGATCG CCTAGC
5' 5'
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
4.人工粘性末端的连接 （1）5′突出末端
5' G CTTAA 5' 5' AATTC G EcoR I 5' 5' GATCC G Klenow 5' GATCC CTAGG TdT GATCC CCCCCCCTAGG T4-DNA ligase BamH I BamH I G CCTAG 5'
5' 5'
4.人工粘性末端的连接 （3）平头末端
5' G 3' C TdT C 3' G dTTP 5' G 3' C TdT C 3' G dATP
GTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTG
G 3' AAAAAAAAAAC
CAAAAAAAAAA 3' G
退火
5' 5'
T4-DNA ligase
TG AC
CA GT
5.粘性末端的更换
5' BamHI 5' GGATCC CCTAGG 5'
G CCTAG 5'
Klenow
5' GATCC G
5'
补平
5' GATCC CTAGG
5'
GGATC CCTAG 5'
T4-DNA ligase
5'
GGAATTCC CCTTAAGG
EcoR I
EcoR I linker
退火
5' 5' T GATCC ACTAG G T GATCC ACTAG G T4-DNA ligase 5' 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T
5'
5'
5' 5'
TGATCC ACTAGG
GGATCA CCTAGT
5'
GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG
BamHI的位点已被 破坏
5'
6.重组率
重组率的定义
重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以
大大简化DNA重组的后续操作。
4.人工粘性末端的连接
5.粘性末端的更换 6.重组率
1.同种内切酶生产的粘性末端的连接
5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' G CTTAA 5' 5' AATTC G G CTTAA 5' 5' AATTC G GAATTC CTTAAG 5'
5'
退火
5' 5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G T4-DNA ligase 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
5' 5'
4.人工粘性末端的连接 （2）3′突出末端
5' GCATG 3' C TdT C 3' GTACG dCTP Sph I 5' G 3' ACGTC TdT CTGCA 3' Pst I G dGTP
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
退火
5' 5'
Baidu Nhomakorabea
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Klenow Pst I
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
3.不同粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC PstI 5' CTGCA 3' G G 3' ACGTC 5' 5' GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G G CCTAG 5' GGATCC CCTAGG
5'
5'
T4-DNA pol
切平
C G G C
Klenow
补平
Klenow
5' GAATT CTTAA 5' TdT
补平
5' AATTC TTAAG dGTP
补平
GGATC CCTAG 5' dCTP GGATCCCCCCC CCTAG
5'
GAATTGGGGGG AATTC GGGGGGTTAAG CTTAA
退火
BamH I 5' 5'
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG
第七章 DNA体外重组与基因转移
一、 DNA的体外重组（切、接） 二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
第八章 重组子的筛选与鉴定（检） 第九章 外源基因的表达
切
接
转
增 检
一、 DNA的体外重组（切与接）
1.同种内切酶生产的粘性末端的连接 2.同尾酶生产的粘性末端的连接 3.不同粘性末端的连接
5'
5'
5' 5'
GAATTC CTTAAG
GAATTC CTTAAG
2.同尾酶生产的粘性末端的连接
5' BclI 5' T ACTAG 5' 5' GATCA T TGATCA ACTAGT 5'
5'
GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G
GGATCC CCTAGG
5'
5'
G CCTAG 5'
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC
加热
CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG
S1
5' 5'
TTTTTTT T GT TG CAA AC AAAAAAA
AAAAAAA A CA AC GTT TG TTTTTTT
5' 5'
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
GGATC CCTAG 5'
5'
5'
5' GATCC CTAGG
T4-DNA ligase 5' 5' CGATCC GCTAGG GGATCG CCTAGC
5' 5'
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
4.人工粘性末端的连接 （1）5′突出末端
5' G CTTAA 5' 5' AATTC G EcoR I 5' 5' GATCC G Klenow 5' GATCC CTAGG TdT GATCC CCCCCCCTAGG T4-DNA ligase BamH I BamH I G CCTAG 5'
5' 5'
4.人工粘性末端的连接 （3）平头末端
5' G 3' C TdT C 3' G dTTP 5' G 3' C TdT C 3' G dATP
GTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTG
G 3' AAAAAAAAAAC
CAAAAAAAAAA 3' G
退火
5' 5'
T4-DNA ligase
TG AC
CA GT
5.粘性末端的更换
5' BamHI 5' GGATCC CCTAGG 5'
G CCTAG 5'
Klenow
5' GATCC G
5'
补平
5' GATCC CTAGG
5'
GGATC CCTAG 5'
T4-DNA ligase
5'
GGAATTCC CCTTAAGG
EcoR I
EcoR I linker
退火
5' 5' T GATCC ACTAG G T GATCC ACTAG G T4-DNA ligase 5' 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T
5'
5'
5' 5'
TGATCC ACTAGG
GGATCA CCTAGT
5'
GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG
BamHI的位点已被 破坏
5'
6.重组率
重组率的定义
重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以
大大简化DNA重组的后续操作。
4.人工粘性末端的连接
5.粘性末端的更换 6.重组率
1.同种内切酶生产的粘性末端的连接
5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' G CTTAA 5' 5' AATTC G G CTTAA 5' 5' AATTC G GAATTC CTTAAG 5'
5'
退火
5' 5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G T4-DNA ligase 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
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4.人工粘性末端的连接 （2）3′突出末端
5' GCATG 3' C TdT C 3' GTACG dCTP Sph I 5' G 3' ACGTC TdT CTGCA 3' Pst I G dGTP
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
退火
5' 5'
Baidu Nhomakorabea
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Klenow Pst I
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
3.不同粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC PstI 5' CTGCA 3' G G 3' ACGTC 5' 5' GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G G CCTAG 5' GGATCC CCTAGG
5'
5'
T4-DNA pol
切平
C G G C
Klenow
补平
Klenow
5' GAATT CTTAA 5' TdT
补平
5' AATTC TTAAG dGTP
补平
GGATC CCTAG 5' dCTP GGATCCCCCCC CCTAG
5'
GAATTGGGGGG AATTC GGGGGGTTAAG CTTAA
退火
BamH I 5' 5'
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG
第七章 DNA体外重组与基因转移
一、 DNA的体外重组（切、接） 二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
第八章 重组子的筛选与鉴定（检） 第九章 外源基因的表达
切
接
转
增 检
一、 DNA的体外重组（切与接）
1.同种内切酶生产的粘性末端的连接 2.同尾酶生产的粘性末端的连接 3.不同粘性末端的连接
5'
5'
5' 5'
GAATTC CTTAAG
GAATTC CTTAAG
2.同尾酶生产的粘性末端的连接
5' BclI 5' T ACTAG 5' 5' GATCA T TGATCA ACTAGT 5'
5'
GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G
GGATCC CCTAGG
5'
5'
G CCTAG 5'
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC
加热
CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG
S1
5' 5'
TTTTTTT T GT TG CAA AC AAAAAAA
AAAAAAA A CA AC GTT TG TTTTTTT