《基因的重组与转移》PPT课件
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高中基因重组ppt课件
原因 这种重组通常是由于DNA链之间 的错误配对和修复机制引起的。
过程 非同源重组通常发生在两条DNA 链的特定区域，这些区域由不同 的DNA序列定义。在重组过程中 ，这些区域会相互交换，以产生 新的DNA组合。
转座因子引起的重组
定义
转座因子引起的重组是指由于转座因子的存在而 引起的DNA序列之间的交换。
过程
当转座因子在DNA链上移动时，它们可以引起 DNA序列的重新排列和复制，从而产生新的DNA 组合。
原因
转座因子是一种可以在DNA链上移动的基因，它 们可以引起DNA序列的重新排列和复制。
重要性
转座因子引起的重组在生物进化中起重要作用， 因为它们可以产生新的基因组合和功能。同时， 它们也是导致基因组不稳定和疾病发生的重要因 素之一。
Western印记杂交
总结词
一种用于检测特定蛋白质的技术。
详细描述
将蛋白质样本与特定的抗体进行杂交，然后通过曝光底片显示结果，从而判断是 否存在目标蛋白质。
06
基因重组的未来展望
基因重组技术的改进
技术优化
不断优化重组技术，提高重组效率、准确性和稳定性。
新的应用领域
拓展基因重组技术在生物医药、农业、环保等领域的应用。
基因重组技术的伦理和社会问题
安全性问题
重组技术可能产生不可预 测的后果，对人类健康和 生态环境造成潜在风险。
人类尊严问题
基因重组技术可能对人类 生命系统产生深远影响， 需要谨慎考虑其伦理和道 德问题。
社会接受度
公众对基因重组技术的接 受程度和态度需要关注和 引导。
THANKS。
解决伦理和社会问题
积极参与伦理和社会问题的讨论，推动合理、规范地应用基因重 组技术。基因重组技术的商业化前景源自010203
基因的转移 PPT课件
25
二、转化的方法
转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容 易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打 “洞”，让外源DNA进入细胞内。
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三 感受态细胞的制备
（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能 自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的 通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸 收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的 通透性改变，允许外源DNA 进入。
６.符合重组DNA操作的安全标准。
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三、 E.coli受体细胞
1. 特性 用于转化的E.coli 细胞的特点
（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株 （Rˉ，Mˉ），
（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗 传给后代 。
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2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它
8
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌， 使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每 g DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及重组。
9
图 转导作用
10
（3）体外包装的噬菌体的转导
① 体外包装 in vitro ing 定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid 质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗 粒。
基因重组方法=全PPT课件
.
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外源DNA被降解，转导失败。
(2)局限性转导（specialized transduction）
温和噬菌体感染
整合到细菌染色体的特定位点上
宿主细胞发生溶源化
溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上
部分缺陷的温和噬菌体
把供体菌的少数特定基因转移到受. 体菌中
的转化现象
目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
建立了感受态的受体细胞
外源. 游离DNA分子
30
枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）
分泌感受态因子
与细胞表面受 体M相互作用
使细胞表面的 DNA结合蛋白 及核酸酶裸露出 来，使其具有与 DNA结合的活 性
b）决定因素也各有不同；
.
34
(2)人工转化
在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。
不是由细菌自身的基因所控制；
用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。
用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。
质粒的转化效率高；
含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株. （F-），细胞表面没有性菌毛7
F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存. 在，也可插入（整合）到染色8 体上
F因子的四种细胞形式
a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；
.
高中生物基因突变和基因重组最全最新ppt课件
1、在生物界普遍存在
短腿安康羊（中） 玉米白化苗 人类多指
基因突变发生在生物个体发育的什么时期？ 任何时期
基因突变发生的时期与突变性状在生物体的表现部位及范围大小有什么关系？
突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部 分越少。
总之，基因突变可以发生在个体发育的任何时期，可以发生在细胞不同的DNA 分子上，可以在同一DNA分子的不同部位
2 类型:
①基因的自由组合: 非同源染色体上的非等位基因的组合.
②基因的互换: 同源染色体上的非姐妹染色单体之间发生局部互换. ③重组DNA技术：通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取 出来，在生物体外重组，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的性状。
转基因抗虫棉花 转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物。
37
;.
3、意义:
通过有性生殖实现基因重组为生物变异提供了极其 丰富的来源,是生物多样性的重要原因之一.
基因重组能否产生新的基因？
38
;.
对比基因突变与基因重组：
基因突变
基因重组
本质
基因分子结构变化，产生新基因（碱 基替换|增添|缺失）
并不产生新基因，产生新的基因型，使 不同性状发生组合
发生 时间
长折
短折
中国黄牛
ⅹ
荷斯坦牛 中 国 荷 斯 坦 牛
46
;.
课堂巩固
1、生物变异的根本来源是
D
A．基因重组 B．染色体数目变异
C．染色体结构变异 D．基因突变
2、基因重组发生在
A．减数分裂形成配子的过程中
B．受精作用形成受精卵的过程中
C．有丝分裂形成子细胞的过程中
基因突变和基因重组ppt课件
思 考 基因重组能否产生新的基因？
基因重组是原有基因的重新组合，只产生新的基因型 和重组性状，不能产生新基因与新性状。
总结基因突变与基因重组
结果 类型 时间
基因突变
产生新基因 碱基的
替换、增添、缺失
细胞分裂间期(主要)
基因重组
产生新基因型 基因的交叉互换 基因的自由组合
MⅠ前期、MⅠ后期
意义
变异的根本来源 进化的原始材料
杂交水稻之父 ·袁隆平
从1964年起，袁隆平就开始研究杂交水稻， 到1975年，他研究出来的新品种就已经在全 国推广，并取得了非同凡响的成果。此后十年 内中国杂交水稻累计增产超亿吨，每年增产的 大米可以多养活6000万人。
概 念 在生物进行 有性生殖 的过程中，控制不同性
状的基因的 重新组合 。
思考
为什么这种变异性状不能遗传给子代？
分析：是环境因素引起的 ，自身的遗传物质没有 改变。
什么是生物变异？ 亲代与子代、子代与子代个体之间的性状的差异性
表现型 = 基因型 + 环境
生物变异
不可遗传的变异
（环境引起，不改变遗传物质）
基因突变 可遗传的变异 基因重组 （改变遗传物质） 染色体变异
▲注意：基因中碱基序列不发生改变，有时候也可通过表观遗传影响下一代。
① 在适宜条件下，能够无限增殖。 ② 形态结构发生显著变化。
癌细胞的扫描电镜照片
③ 细胞膜上的糖蛋白等物质减少，细 胞之间的黏着性显著降低，容易在机 体内分散和转移。
人和动物细胞中的 DNA 上本来就存在与癌变相关的基因：
原癌基因
抑癌基因
表达的蛋白质是细胞正常 的生长和增殖所必需的。
表达的蛋白质能抑制细胞的生长 和增殖，或者促进细胞凋亡。
基因重组PPT课件
B
D、无基因突变,此人无病,其后代患病
6、若一对夫妇所生育子女中，性状差异甚多，这种变 异主要来自 B A.基因突变 B.基因重组 C.环境影响 D.染色体变异
7、生物界是千姿百态，多种多样的，这都要建立在生 物丰富变异的基础上。生物丰富的变异主要来源于 A.基因重组 B.基因突变
ALeabharlann C.染色体变异D.环境变化
基因重组能否产生新的基因？
基因突变和重组引起的变异有什么区别? 1．基因突变： 内部结构 能产生 新的基因 基因_________ 改变，它________ 细胞分裂间期（DNA复制时） 发生时期：________________________ 特点：①普遍性、②随机性、③___________ 突变率低 、 ④多数有害、⑤不定向性。 2．基因重组： 控制不同性状的_____________ ，_______ 基因重新组合 不产生 新基因，可 基因型 。 形成新的________ 发生时期：___________________ 有性生殖过程中(减数分裂) 特点：__________ 非常丰富
4、上眼睑下垂是一种显性遗传病,某一男性患 者,其父母正常，请判断这人性状最可能是 C A.伴性遗传 B.常染色体遗传 C.基因突变 D.基因重组
5.如果将一个镰刀型细胞贫血症的患者血液, 输给一个血型相同的正常人,将使正常人
A、 基因产生突变,使此人患病 B、无基因突变,性状不遗传给此人 C、基因重组,将病遗传给此人
一种具有20对等位基因（这20对等位基因分别位于 20对同源染色体上）的生物进行杂交时，F2可能出 现的表现型就有 220=1048576 种。
上一页
同源染色体的非姐妹染色单体 之间的局部交换
b
基因重组-精品PPT
轻链的基因片段：
L
V
J
C
重链的基因片段：
L
V
D
J
C
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC
TGTTTTTGG
基因片段
重组信号序列
重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的 下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保 守 的 重 组 信 号 序 列 (recombination signal sequence, RSS) 。 此 重 排 的 重 组 酶 基 因 rag (recombination activating gene)共有两个， 分别产生蛋白质RAG1和RAG2。
免
间插DNA
疫 球
V片段
RSS
RSS J片段
蛋
单链切开 RAG1 RAG2
白
OH
基
OH
因
分子内转酯反应
重
排
过
单链切开
程
转移核苷酸 修复、连接
V
J
目录
四、转座重组
由插入序列和转座子介导的基因移位或重 排称为转座(transposition)。
由 McClintock （ 1956 ） 在 玉 米 上 首 先 发 现 遗传学发展史上的重要里程碑之一。
IR Transposase Gene IR
发生形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)
插 入 序 列 的 复 制 性 转 座
目录
（二）转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位 点转移到另一位点的分散重复序列。
分子生物学原理--基因工程ppt课件
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色 体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。
第十四章 基因重组与基因工程
10/28/2024
分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
10/28/2024
分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
10/28/2024
分子生物学原理
转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
10/28/2024
分子生物学原理
转 位
10/28/2024
分子生物学原理
第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目 的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。
10/28/2024
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
•灭 活法筛 选重组 体。
《基因重组》课件
生物学意义
转座重组有助于基因组的 多样性和进化，但也可能 导致基因表达的异常和疾 病的发生。
03 基因重组的机制
重组酶的作用
识别DNA序列
重组酶能够识别DNA上的 特定位点，为重组过程提 供起始点。
催化DNA链断裂
重组酶能够催化DNA链断 裂，形成单链缺口，为重 组提供必要的结构基础。
催化碱基配对
同源重组是生物进化的重要机制之一 ，有助于维持基因组的稳定性，同时 也可以修复DNA损伤。
机制
同源重组依赖于RecA蛋白等分子伴侣 的参与，通过寻找同源序列，形成异 源二聚体，再通过DNA链的断裂、交 换和重连完成重组。
非同源重组
定义
非同源重组是指两条没有同源 序列的DNA分子之间发生的
重组过程。
些罕见病。
基因克隆
03
通过基因重组技术将目的基因克隆到载体中，实现基因的高效
表达和纯化。
克隆技术
动物克隆
利用基因重组技术复制动物个体，实现快速繁殖和拯救濒危物种 。
植物克隆
通过基因重组技术繁殖植物，实现植物的快速繁殖和品种改良。
细胞克隆
通过基因重组技术培养特定细胞系，用于药物筛选、疾病研究等 。
疾病治疗与预防
伦理考量
在编辑人类基因时，需要权衡潜在的 健康益处与潜在的风险和副作用，以 及涉及的伦理问题，如潜在的基因歧 视和人类进化干预。
基因重组与生物多样性
生物多样性影响
基因重组可能导致生物多样性减少，因为重组可能导致物种的基因库减少，降低 物种适应环境变化的能力。
伦理考量
需要关注基因重组对生物多样性的影响，并采取措施确保生物多样性的保护和维 持。
疫苗研发
利用基因重组技术生产疫苗，预防和控制传染病。
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1
第六章 基因的重组与转移
外源DNA
转化或转导
载体DNA
连接
重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
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2
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3
第一节 重组DNA分子的构建
一、基因重组概念
利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰 载体DNA和目的基因，将两者连接起来，再转入 受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细 胞内得到正确表达。
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
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23
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
酶切，形成一个人工粘性末端。
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17
③优点：
1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点：
如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完
整的插入片段
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18
（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
2. 酶切位点之前要有一个较强的启动子 高效表达
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6
Hale Waihona Puke 四、 载体DNA与外源基因片段的连接
（一）粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起
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7
1. 两段DNA的连接
依靠粘性末端
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8
2. DNA片段与载体的连接
依靠粘性末端
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10
⑤防止自我连接
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解 掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
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P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位
点序列）。 BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4－DNA连接酶连到DNA分子的两端， 直接成为人工粘性末端。
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19
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
（2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
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25
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC EcoRI位点
互补序列 复性
-3’ 引物1
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-P5’
GGCC-
接头自我连接
CCGGGATCCCGG-OH
GGCCCT精A选ppGt GGCC-P5’
20
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21
③优点： 连上后就能用。
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
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2. 与T载体直接连接 （1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加 上一个多余的核苷酸（优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时， 被迫在平端载体上添加T！
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
ligase nick
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(二)平齐末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连
接酶连接。
T4－DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，
只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
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12
2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 ①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
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13
③优点： 能把任何片 段连接起来
④缺点： 不能把插 入片段再 切下来。
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非酶切位点
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（2）连接子(linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内 切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用
用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
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模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 精选ppt
GCTAGCCGG -5’ 27
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4
二、基因重组的考虑因素
1. 实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重 组子筛选
2. 能够回收插入的外源基因 3. 外源基因必须在表达载体DNA的控制下，并置 于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达
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5
三、表达载体DNA理想的酶切位点 应该符合下面几个条件
1. 载体上特定的酶切位点尽可能少 最好是单一酶切位点
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC 缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。
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(三)PCR产物的连接 1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。
1
第六章 基因的重组与转移
外源DNA
转化或转导
载体DNA
连接
重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
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2
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3
第一节 重组DNA分子的构建
一、基因重组概念
利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰 载体DNA和目的基因，将两者连接起来，再转入 受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细 胞内得到正确表达。
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
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BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
酶切，形成一个人工粘性末端。
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17
③优点：
1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点：
如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完
整的插入片段
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（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
2. 酶切位点之前要有一个较强的启动子 高效表达
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Hale Waihona Puke 四、 载体DNA与外源基因片段的连接
（一）粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起
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1. 两段DNA的连接
依靠粘性末端
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2. DNA片段与载体的连接
依靠粘性末端
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⑤防止自我连接
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解 掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
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P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位
点序列）。 BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4－DNA连接酶连到DNA分子的两端， 直接成为人工粘性末端。
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P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
（2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
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模板
3’
3’
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5’- GCAGAATTC EcoRI位点
互补序列 复性
-3’ 引物1
3’
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5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-P5’
GGCC-
接头自我连接
CCGGGATCCCGG-OH
GGCCCT精A选ppGt GGCC-P5’
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21
③优点： 连上后就能用。
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
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2. 与T载体直接连接 （1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加 上一个多余的核苷酸（优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时， 被迫在平端载体上添加T！
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
ligase nick
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(二)平齐末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连
接酶连接。
T4－DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，
只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
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2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 ①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
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③优点： 能把任何片 段连接起来
④缺点： 不能把插 入片段再 切下来。
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非酶切位点
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（2）连接子(linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内 切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用
用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
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模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 精选ppt
GCTAGCCGG -5’ 27
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二、基因重组的考虑因素
1. 实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重 组子筛选
2. 能够回收插入的外源基因 3. 外源基因必须在表达载体DNA的控制下，并置 于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达
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三、表达载体DNA理想的酶切位点 应该符合下面几个条件
1. 载体上特定的酶切位点尽可能少 最好是单一酶切位点
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC 缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。
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(三)PCR产物的连接 1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。