《基因的重组与转移》PPT课件
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（2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
精选ppt
25
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC EcoRI位点
互补序列 复性
-3’ 引物1
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
精选ppt
1
第六章 基因的重组与转移
外源DNA
转化或转导
载体DNA
连接
重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
精选ppt
2
精选ppt
3
第一节 重组DNA分子的构建
一、基因重组概念
利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰 载体DNA和目的基因，将两者连接起来，再转入 受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细 胞内得到正确表达。
⑤防止自我连接
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解 掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
精选ppt
22
P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
精选ppt
26
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 精选ppt
GCTAGCCGG -5’ 27
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
精选ppt
12
2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 ①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
精选ppt
13
③优点： 能把任何片 段连接起来
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC 缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。
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24
(三)PCR产物的连接 1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。
2. 酶切位点之前要有一个较强的启动子 高效表达
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6
四、 载体DNA与外源基因片段的连接
（一）粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起
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7
1. 两段DNA的连接
依靠粘性末端
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8
2. DNA片段与载体的连接
依靠粘性末端
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9
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10
酶切，形成一个人工粘性末端。
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15
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16
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17
③优点：
1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点：
如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完
整的插入片段
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18
（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位
点序列）。 BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4－DNA连接酶连到DNA分子的两端， 直接成为人工粘性末端。
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19
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
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4
二、基因重组的考虑因素
1. 实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重 组子筛选
2. 能够回收插入的外源基因 3. 外源基因必须在表达载体DNA的控制下，并置 于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达
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5
三、表达载体DNA理想的酶切位点 应该符合下面几个条件
1. 载体上特定的酶切位点尽可能少 最好是单一酶切位点
ligase nick
精选ppt
11
(二)平齐末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连
接酶连接。
T4－DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，
只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
④缺点： 不能把插 入片段再 切下来。
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非酶切位点
14
（2）连接子(linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内 切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用
用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用
BamHI adapter
Baidu Nhomakorabea
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-P5’
GGCC-
接头自我连接
CCGGGATCCCGG-OH
GGCCCT精A选ppGt GGCC-P5’
20
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21
③优点： 连上后就能用。
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
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2. 与T载体直接连接 （1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加 上一个多余的核苷酸（优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时， 被迫在平端载体上添加T！
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
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BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
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模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC EcoRI位点
互补序列 复性
-3’ 引物1
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
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1
第六章 基因的重组与转移
外源DNA
转化或转导
载体DNA
连接
重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
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2
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3
第一节 重组DNA分子的构建
一、基因重组概念
利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰 载体DNA和目的基因，将两者连接起来，再转入 受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细 胞内得到正确表达。
⑤防止自我连接
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解 掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
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P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
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模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 精选ppt
GCTAGCCGG -5’ 27
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
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12
2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 ①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
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13
③优点： 能把任何片 段连接起来
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC 缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。
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(三)PCR产物的连接 1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。
2. 酶切位点之前要有一个较强的启动子 高效表达
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6
四、 载体DNA与外源基因片段的连接
（一）粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起
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1. 两段DNA的连接
依靠粘性末端
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8
2. DNA片段与载体的连接
依靠粘性末端
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酶切，形成一个人工粘性末端。
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17
③优点：
1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点：
如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完
整的插入片段
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（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位
点序列）。 BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4－DNA连接酶连到DNA分子的两端， 直接成为人工粘性末端。
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P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
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二、基因重组的考虑因素
1. 实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重 组子筛选
2. 能够回收插入的外源基因 3. 外源基因必须在表达载体DNA的控制下，并置 于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达
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三、表达载体DNA理想的酶切位点 应该符合下面几个条件
1. 载体上特定的酶切位点尽可能少 最好是单一酶切位点
ligase nick
精选ppt
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(二)平齐末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连
接酶连接。
T4－DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，
只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
④缺点： 不能把插 入片段再 切下来。
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非酶切位点
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（2）连接子(linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内 切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用
用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用
BamHI adapter
Baidu Nhomakorabea
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-P5’
GGCC-
接头自我连接
CCGGGATCCCGG-OH
GGCCCT精A选ppGt GGCC-P5’
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21
③优点： 连上后就能用。
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
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2. 与T载体直接连接 （1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加 上一个多余的核苷酸（优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时， 被迫在平端载体上添加T！
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
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BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P