第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移-文档资料
37℃过夜
5. 影响转化率的因素
(1)分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量 较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于15kb的重组 质粒则很难进行转化。
(2)组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和 性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而 处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构、成线性结 构的质粒载体有更高的转化率。
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用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
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二、重组DNA导入大肠杆菌 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation)
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG GGCCCTAG-P5’
接头自我连接
5‘p-GATCCCGGGGCC-
CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’
（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 ① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。
BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
第六章遗传重组
1
主要内容
概述 6.1 6.2 6.3 6.4
同源重组 位点专一性重组 转座重组 异常重组 （了解）
2
概述：
遗传重组是生物界普遍存在的遗传现象。 进行有性生殖的物种在减数分裂过程中发生重组。 若发生了物理交换，则遗传物质产生新的排列组合。 生存→变异→突变，重组 适应环境、加速进化；损伤修复等。
链上，因而出现很低的转化频率。
敲除校正基因可使受体菌变为高转化效率菌。
45
P125
必须掌握
同源重组的功能和基本条件
同源重组的生物学功能： （1）对维持种群的遗传多样性有重要意义 （2）在真核生物中，同源重组使染色体产生瞬间物理连接， 保证了减数分裂中染色体的正确分离； （3）有助于损伤DNA的修复。 同源重组的发生应具有以下基本条件： （1）在交换区具有相同或相似的序列；
33
A A a a
粪壳菌的子囊孢子因在减数 分裂中或减数分裂后8孢子 中发生不同的修复作用，而 产生多种不同的分离比。
A A
a a
野生型：突变型 分离比有6：2；
4：4；
2：2：2：2等
34
（6）双链断裂修复模型
目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链 断裂引发重组是个常见的机制。 该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的 两条链被核酸内切酶切断，然后在核酸外切 酶作用下产生3’单链黏性末端。 两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋的 同源区，臵换“供体”双螺旋的一个单链而 形成一段异源双链DNA，并同时产生一个D 环（D-loop）。
5´ 3´
3´
5´
5´ 3´
5´ 片
5´
3´
高中生物 第六章基因重组与基因工程
第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。
教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。
基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。
1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。
2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。
(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。
3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。
故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。
转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。
可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。
4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。
基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。
二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。
DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。
生物进化中的基因重组与基因转移
生物进化中的基因重组与基因转移生物进化是指物种逐渐演化和适应环境的过程，其中基因重组与基因转移发挥着重要的作用。
基因重组是指在生物体内，染色体上的DNA序列发生重新组合的过程，而基因转移则是指基因从一种生物体转移到另一种生物体的过程。
这两个过程为生物进化中的遗传变异提供了重要的机制。
基因重组是生物进化中的常见现象，它是通过染色体的互换、交叉和重组来实现的。
在有性生殖的生物中，基因重组是通过配子形成的过程中发生的。
在这个过程中，父母个体的染色体对交换和重组，产生新的染色体组合，从而产生具有不同遗传信息的后代。
基因重组的发生使得后代个体具有更大的遗传多样性，为适应环境变化提供了基础。
例如，在自然选择的过程中，某一基因座上的有利等位基因可能会在基因重组过程中与其他基因进行重组，产生新的基因组合，并在后代中得到更好的传递。
与基因重组不同，基因转移是指基因从一种生物体转移到另一种生物体的过程。
这种过程可以是水平基因转移，即发生在不同个体之间，或是垂直基因转移，即发生在不同物种的后代之间。
水平基因转移通常通过质粒传递基因进行，其中质粒是一种小型DNA分子，可以在细菌、真菌和植物等生物体之间进行传递。
质粒中的基因可以通过细菌共享机制，被接收到其他细菌的染色体上，从而实现基因的转移。
对于垂直基因转移而言，它通常发生在不同物种的后代之间，具体机制包括共享祖先基因和基因转座等。
基因转移的发生可以使得物种之间的基因组发生改变，也为新的遗传特征的产生提供了机会。
基因重组与基因转移在生物进化中扮演着重要的角色，它们为生物从简单到复杂、从适应不同环境到新物种的形成提供了机制。
通过基因重组，新的基因组合产生了更多的遗传多样性，从而使物种更具生存优势。
而基因转移则进一步增加了遗传信息的交流和变异的机会，有助于形成新的遗传特征和促进物种的适应性进化。
然而，基因重组与基因转移也可能带来负面影响，例如在基因转移中出现的基因污染和抗生素耐药基因的传播问题。
第六章 重组DNA导入受体细胞
第二节 转化
一、几个概念 1、转化：一般指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载 体DNA分子的过程； 2、转染：指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA 分子的过程； 3、转导：指病毒转移真核细胞DNA的过程或噬菌体介导的 细菌细胞之间的基因转移；
例如：对大肠杆菌而言，转化是以质粒为载体，将携 带外源基因的载体DNA导入受体细胞的过程；转染是以噬菌 体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转 化方式导入受体菌；转导（或感染）：是以噬菌体为载体， 在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，时期感染受体菌。
30℃时，具有活性；45℃丧失活性。 3、以λ噬菌体作为载体进行基因克隆具有以下优点 ①、具有很大的外源DNA包容力，对外源基因的克隆效率高； ②、有非大小的外源DNA的重 组λDNA才能进行包装和转染。
第四节 共转化
常用用于共转化的报告基因：
1、胸腺激酶基因（tk基因）：它是细胞内合成脱氧三磷
酸胸苷（dTTP）的催化酶的基因，影响dTTP的合成。可利 用tk-表型对转化子进行筛选。 tk+细胞由于tk酶可使溴化脱氧尿苷（BrUdr）变成细胞毒 性物质，所以tk+细胞不能在含有BrUdr的培养基内生长； tk-细胞不能合成tk酶，因而可以在BrUdr的培养基上生长。 用HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）可以筛 选出tk+细胞。 2、抗药基因的共转染：DNA导入的效率很低，共同导入看 要基因，可通过抗生素培养基去除大量未被感染的细胞， 筛选出阳性转化细胞。
五、枯草芽孢杆菌的转化反应 （一）、枯草杆菌作为受体菌的优点 1、枯草杆菌具有芽孢形成能力，易于培养和保存； 2、枯草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因，能使基因表达产 物分泌到胞外，简化表达产物的提取和加工处理； 3、枯草杆菌不产生内毒素。 （二）、枯草芽孢杆菌的自然转化模型 1、枯草芽孢杆菌在葡萄糖基本培养基中培养到对数生长末 期到稳定期，细胞向胞外分泌一种小分子的蛋白质，称为 感受态因子； 2、当培养液中感受态因子积累到一定浓度后，与细胞表面 相互作用，通过一系列信号传递诱导一些感受态特异蛋白 质表达，其中一种成为自溶素，它的表达使细胞表面的DNA 结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性；
204.4基因的转移和重组
转导
✓ 普遍性转导
λ
λ
λ
正常脱离
断裂和再接
细菌染色体
λ
λ
gal λdg
偏差脱离 gal
断裂和再接
✓ 局限性转导
普遍性转导与局限性转导的区别
区别要点 基因转导发生
的时期
转导的遗传 物质
转导的后果
➢ 接触：F+菌和F-菌混合培养，F+性菌毛与F-菌表面
受体接合形成通道，细胞质沟通，F质粒自orit位
点开始传递；
➢ 转移：在orit切割形成单链缺口，单链DNA经性菌
毛接合桥进入F－菌，1分钟完成；
➢ 复制：两个菌内的单链DNA以滚环方式复制，F－ 菌转变为F＋菌，可形成性菌毛。
F质粒与染色体整合,导致宿主菌染色体转移频率高， 称为高频重组株(high frequency recombinant, Hfr)。 ➢ 受体菌获得供体菌性状； ➢ F质粒转移频率低； ➢ F质粒的整合可逆，自染色体脱离时如携带整合
基因转移与重组
基因转移（gene transfer）：外源性的遗传物质 由供体菌进入某受体菌的过程。
起，使受体菌获得供体菌的某些 特性。
细菌的基因转移和重组方式： 转化、接合、转导、溶源性转换、原生质体融合
转化(transformation)
普遍性转导
裂解期
供体菌染色体 DNA任何部位
或质粒
完全转导或流 产转导
局限性转导
溶原期
噬菌体DNA及供 体菌DNA的特定
部位
受体菌获得供体菌 DNA特定部位的遗
传特性
自然界的基因转移和重组-PPT文档资料
插入序列转座：
1. 保守性转座
从原位迁至新位 2. 复制性转座
插入序列复制后，一个复制本迁到
新位，另一个保留在原位。
（二）转座子转座
转座子（transposons）：可从一个染色体 位点转移到另一位点的分散重复序列。 反向重复序列 组成 转座酶基因
特殊基因：如抗生素抗性基因等
DNA 和宿主染色体的特异靶位点，而 后发生的选择性整合。
（二）同源重组
发生在同源序列间的重组。同源
重组不依赖特异DNA序列，而依赖
同源性。
同源重组需要一些重组蛋白和酶。 如Rec A、B、C、D及DNA连接酶等。
H o l l i d a y 中 间 体
SH 型 肺 炎 双 球 菌
三、转导作用（transduction)
当病毒从被感染的细胞（供体）
释放出来，再次感染另一细胞（受体） 时，发生在供体细胞与受体细胞之间 的DNA转移及基因重组。
四、转座（transposition)
大多数基因在基因组内的位置是固 定的，但有些基因可以从一个位置移动
一、接合作用（conjugation)
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接
触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。
二、转化作用（transformation)
通过自动获取或人为地供给外源DNA，
使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
分离
DNA
R H型 肺 炎 双 ecombination and Genetic Engineering
第一节
自然界的 基因转移和重组
自然界的基因转移和重组是基因变
异和物种进化的基础。也在繁殖、病毒 感染、基因表达以及癌基因激活等过程
细菌基因转移和基因重组
• F小环与主染色体大环之间发生一 次交换就可以插入到宿主染色体中。 • F因子整合到E.coli染色体上以后， 该菌株就成为高频重组株（High frequence recombination ），以Hfr 表示。
Mechanism of DNA transfer during conjugation in Gram-negative bacteria
细菌遗传重组的自然机制包括
细菌的接合（conjugation）
转化（transformation）
转导 （transduction） 性导（sexduction ）
第一节 接合（Conjugation）
概念：
F+ conjugation
Hfr (high frequency recombinant) conjugation
U型管试验(见图） 说明：两个菌株间的直接接触是原养型 细菌出现的必要条件，这就排除了转化的 可能。 1952年，Hages通过实验证明，在结合过 程中，遗传物质的转移是单向的。 在结合过程中，到底是什么东西由雄体输 入了雌体呢？
• Gram-positive:
sticky surface molecules
• Gram-negative（阴性菌）: （性菌毛）
sex pilus
F因子的特征
• 携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示。 没有F因子的菌体称为受体菌，又称雌性，用F－表 示。 • F因子是双链环状DNA，分子量大约是3.5×106， 是染色体外遗传物质，是质粒的一种，在分类学上 属于附加体（episome）。 • 它既能以自主状态存在于细胞质中，又能整合到细 菌的染色体内。
品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析 受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中 用来测定基因位置的一种方法。
6基因的重组与转移
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
(5) 体 外 包 装 过 程
（6） 转导
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使 受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。
第三节 外源基因导入真核细胞
一、导入酵母细胞 1. 菌株选择
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二、重组DNA导入大肠杆菌 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation)
大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection)
大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 （3）转导（transduction)
cI857
DNA 其它基因
阻遏 蛋白
溶源状态（DNA不转录、不翻译）
32℃
阻遏 蛋白
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
44℃—45℃
（4） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。
噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
基因转移与重组概述
染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就 越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。
Hfr ×F-杂交
3.F′×F-杂交——性导
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游 离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。
3.性导——F′×F-杂交
初
生
F′
F′×F-与F+×F-的不同点：
F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细 胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上
（三）接合
F因子的四种细胞形式（掌握）
①F-菌株(“雌性”菌株)：不含F因子，无性菌毛，但可以 通过接合作用接收F因子而变成F+菌株。 ②F+菌株(“雄性”菌株)：F因子独立存在，细胞表面有性
菌毛。 ③Hfr菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性 菌
溶源转变特点
1. 噬菌体不携带任何供体菌的基因； 2. 噬菌体是完整的，而不是缺陷的； 3. 噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿 主获得新性状，未通过基因重组而形成的稳 定转导子； 4. 宿主获得新性状具有不稳定性。
（三）接合(conjugation)
通过细胞与细胞的直 接接触而产生的遗传信 息的转移和重组过程。
（一）转化
供体菌
DNA片段
受体菌
转化子（transformant）：转化后的受体
感受态
来自Trp+细胞的DNA
色氨酸缺陷型 没有色氨酸野生型生长
在缺乏色氨 酸培养基上 有菌落产生 （野生型）
自然转化的必要条件
1、建立感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞。 自然感受态：细胞一定生长阶段的生理特性，受自 身的基因控制（感受态因子）。 人工感受态：通过人为诱导，使细胞具有摄取DNA 的能力，或将DNA导入细胞内。
微生物学理论：基因转移及重组
细菌基因转移和重组的⽅式有转化、接合、转导、溶原性转换和原⽣质体融合。
1.转化受体菌直接摄取供体菌DNA，从⽽获得新的遗传性状的过程称为转化。
2.接合细菌通过性菌⽑相互连接沟通，将质粒或染⾊体的DNA从供体菌转移给受体菌的过程称为接合。
3.转导以噬菌体为媒介，将供体菌DNA⽚段转移到受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状的⽅式称转导。
根据转导DNA ⽚段的范围，可分为普遍性转导和局限性转导：①普遍性转导是因供体菌染⾊体或质粒的任何DNA⽚段都有可能被转导，故称为普遍性转导；②局限性转导是前噬菌体从宿主菌染⾊体切离时发⽣偏差，将前噬菌体两旁的基因转移到受体菌，使后者的遗传性状发⽣改变的过程。
4.溶原性转换溶原性细菌因染⾊体上整合有前噬菌体⽽获得新的遗传性状称为溶原性转换。
溶原性转换可使某些细菌发⽣毒⼒变异或抗原性变异。
5.原⽣质体融合是分别将两种细菌经处理失去细胞壁悬于⾼渗培养基中保持原⽣质体状态，然后将两种细菌的原⽣质体混合，滴加聚⼄⼆醇促使原⽣质体融合。
融合后的双倍体细胞可以短期⽣存，在此期间染⾊体之间可以发⽣基因的交换和重组，获得多种不同表型的重组融合体。
融合体经培养重新形成细胞壁，再按其遗传标志选择重组菌。
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③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
第六章基因的重组与转移
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
第六章基因的重组与转移
二、齐平末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。
T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
第六章基因的重组与转移
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
两头各有一个粘性末端！
第六章基因的重组与转移
2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
第六章基因的重组与转移
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG GGCCCTAG-P5’
接头自我连接
5‘p-GATCCCGGGGCC-
CCGGGATCCCGG-OH GGC第C六C章基T因A的重G组与G转移GCC-P5’
第六章基因的重组与转移
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
第六章基因的重组与转移
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
第六章基因的重组与转移
（1）用相同的酶切
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段
第六章基因的重组与转移
（3）DNA接头 (adapter)连接法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ ② adapter的作用 用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
第六章基因的重组与转移
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
第六章基因的重组与转移
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
第六章基因的重组与转移
③优点： 连上后就能用。
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
⑤防止自我连接 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头， 水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
第六章基因的重组与转移
P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
第六章 基因的重组与转移
外源DNA
载体DNA
重组分子
转化或转导
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接
（一）同一种酶产生的黏性末端的连接
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
（二）不同种酶产生的黏性末端的连接
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC
缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。
第六章基因的重组与转移
三、PCR产物的连接
1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
第六章基因的重组与转移
2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。 ①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
第六章基因的重组与转移
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG -5’ 第六章基因的重组与转移
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
Hale Waihona Puke BamHI位点EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’