6基因的重组与转移

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微生物 10-4、5、6第十章微生物的遗传变异和育种

工程菌的稳定性问题

由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细胞生成素、重组链激酶等都已先后供应市场，不仅保证了这些药物的来源，而且使成本大大降低。但工程菌在发酵生产和保存过程中表现出不稳定性，具体表现为：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片断脱落；表达产物不稳定。工程菌的稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性以及环境条件等因素有关。
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染； c ）死亡。
一、菌种的衰退与复壮
衰退：菌种出现或表现出负变性状
菌种衰退的原因： ①大量群体中的自发突变
自发突变
纯菌种
不纯菌种
传代增殖
衰退菌种
原始个体
突变个体菌种衰退的原因： ②分离现象。菌种衰退的原因： ③培养条件与传代。
准性杂交育种
第五节分子育种（基因工程育种）
一、基因工程定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。
特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性
二、基因工程的基本操作获得目的基因
选择基因载体
体外重组外源基因导入筛选和鉴定
应用

通过基因工程改变后的菌株被称为“工程菌”，工程菌已逐渐应用于药物的微生物发酵生产中，主要有以下几个方面：①增加生物合成基因量而增加抗生素产量；②导入强启动子或抗性基因而增加抗生素产量；③把两种不同的生物合成基因在体外重组后再导入受体而产生杂交抗生素；④ 激活沉默基因，以其产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；⑤把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。

分子生物学 6 DNA 损伤、修复和重组

吖啶橙、原黄素、吖黄素等吖啶类染料嵌合到DNA碱基对之间 base addition /deletion / frameshift mutation
DNA损伤（DNA damage）
自发损伤: 脱氨基/ 脱嘌呤外源损伤: 1. 氧化损伤 (需氧细胞) 活性氧：超氧化物，过氧化氢和羟自由基（· OH） 8-氧鸟嘌呤，2-氧腺嘌呤，5-甲酰尿嘧啶 2. 烷基化损伤影响DNA复制和转录时的解旋多数是间接诱变 3. 加成损伤嘧啶二聚体苯并芘（肝脏细胞色素P-450）双环氧物-G 芳基化试剂黄曲霉毒素B1（肝致癌剂）
DNA损伤、修复和重组
突变和突变发生
（mutation and mutagenesis) DNA损伤（DNA damage） DNA修复（DNA repair）重组（recombination）
突变概念
突变（mutation） DNA分子碱基序列的可遗传改变突变体（mutant）与野生型（+）相对突变剂（mutagen）突变发生（mutagenesis）自发突变（spontaneous mutation）诱发突变（induced mutation）
突变类型 1. DNA碱基序列改变的多少单点突变（point mutation）碱基替换（base substitution）转换（transition） A-T G-C 颠换（transversion）A-T T-A 碱基增加（base addition）碱基删除（base deletion）多点突变（multiple mutation）
BER
5' 3' UvrABC 3' 5' 3' 5' Pol I (或δ和ε） 5' 3' DNA glycosylase 5' 3' AP内切核酸酶 5' 3' 进一步酶切

第六章重组DNA导入受体细胞

根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染

遗传学6基因突变.pptx

段例如：切除一小段含胸腺嘧啶二聚体的寡核苷酸链，并修补之 –大肠杆菌UvrABC 系统修复
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3、复制后修复
发生在DNA复制失败，产生缺口之后的修复，称为复制后修复。由于所用的许多酶与重组相同，过程也与重组相似，也被称为重组修复
显性突变表现的早而纯合的慢，隐性突变
表现的晚而纯合的快
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三、体细胞突变和性细胞突变
突变可以发生在生物个体发育的任何时期，即体细胞和性细胞都能发生突变性细胞发生的突变可通过受精过程直接传递给后代体细胞则不能，要保留体细胞的突变，需将它从母体上及时地分割下来加以无性繁殖，或者设法让它产生性细胞，再通过有性繁殖传递给后代，“芽变”
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为什么有害的基因突变多？
为什么基因突变的有利或有害是相对的？
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五、基因突变的平行性
亲缘关系相近的物种因遗传基础比较近似，往往发生相似的基因突变。这种现象称为突变的平行性
根据一个物种或属内具有的变异类型，就能预见到近缘的其他物种或属也同样存在相似的变异类型
第一节基因突变的概念与意义
一、基因突变的概念
基因突变:染色体上某一基因位点内部发生了化学性质的变化，与原来基因形成对性关系
例如，高秆基因D → 矮秆基因d
突变体(型):由于基因突变而表现突变性状的细胞或个体
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突变频率：突变体出现的频率突变率：基因发生突变的频率自发突变: 在自然条件下发生的突变
四、基因突变的有害性和有利性
大多数基因的突变，对生物
的生长和发育往往是有害的。
致死突变：导致个体死亡的突变伴性致死：致死突变发生在性染色体上中性突变：有些基因仅控制一些次要性

第六章遗传重组

第六章遗传重组1．简述同源重组的Meselson-Radding模型根据Meselson-Radding模型，基因的重组以及转换与异源DNA链的形成有密切关系，具体过程分步论述如下：（1）Holliday中间体的形成：①切断:同源联会的两个DNA分子中任意的一个出现单链切口，切口可能由某些内切酶产生，也可能由使同源DNA接近并发生联会的蛋白质因子作用导致切口的产生。

②链置换:切口处形成的5'端局部解链，酶系统利用切口处的3'-OH合成新链，填补解链后形成的单链空缺。

原有的链被逐步排挤置换出来。

③单链侵入:由链置换产生的单链区段侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生的单链泡中。

局部解链可能是由于某种DNA结合蛋白的作用产生，也可能由DNA的呼吸作用产生。

④环状DNA单链切除:侵入的单链DNA与参与联会的另一条DNA分子中的互补链形成碱基配对，同时把与侵入单链的同源链置换出来，由此产生D形环状结构。

D形环状结构的单链区随后被5'→3'外切酶切除降解掉。

⑤链同化:D形环状结构切除中产生的3'-OH断头与侵入单链的5'-P在DNA连接酶的作用下共价连接，形成非对称性异源双链区。

异源双链区内往往含有错配碱基，这些错配碱基对面临着细胞内修复系统的修复作用，而修复的结果就有可能造成基因的转换。

⑥异构化:链同化进行过程中，DNA经过一定的扭曲旋转，形成Holliday中间体。

⑦分支迁移:两条DNA分子之间形成的交叉点可以沿 DNA移动，这一过程叫分支迁移。

迁移实际上是两条DNA分子之间交叉的同源单链互相置换的结果，迁移的方向可以朝向DNA 分子的任意一端。

分支迁移使两条DNA分子中都出现异源双链区，此时称之为对称性异源双链区。

异源双链区的修复时间和方式与基因转换的发生与否有密切关系。

Holliday中间体的形成（2）Holliday中间体的拆分及异源双链区的修复①Holliday中间体的拆分Holliday中间体的形成只完成了重组的一半，由它联系在一起的两条DNA分子必须经过拆分回复到彼此分开的双螺旋分子状态。

DNA重组技术

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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀；是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶；限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。

鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定

鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定郭霄峰;廖明;辛朝安【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2002(033)006【摘要】依据文献报道的鸭瘟病毒(DPV)的核苷酸序列,设计和合成了二对引物,分别为SP1和SP2,LP1和LP2.北京株鸭瘟病毒于鸭胚中增殖,差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化,按酚-氯仿法抽提DNA.然后以DPV DNA为模板进行PCR,分别扩散增出与理论相符的421bp和1209bp的二个DNA片段,并将它们克隆于质粒pGEM-T Easy中.经酶切和质粒PCR,筛选含有目的基因的重组质粒.重组质粒以步移法从双方向测序,获1586bp的核苷酸序列.研究发现这1586bp的核苷酸序列与文献报道的UL6和UL7基因序列的同源性为99%,仅有一个碱基的差异.进一步作氨基酸分析,发现这个碱基所引起的变异为无意义突变(CCT→CCC).结果表明,鸭瘟病毒的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守.【总页数】4页(P615-618)【作者】郭霄峰;廖明;辛朝安【作者单位】华南农业大学动物医学系,广州,510642;华南农业大学动物医学系,广州,510642;华南农业大学动物医学系,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 吴双;马丽丽;朱善元;陆辉2.鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与序列测定 [J], 谢秀兰;杨发龙;李阳友;岳华3.伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达 [J], 薛念波;肖少波;江云波;梅小伟;刘曼莉;赵骞;罗锐;陈焕春;方六荣4.传染性喉气管炎病毒北京E2株gC基因的克隆及其部分序列测定 [J], 吴红专; 陈义为5.猪瘟病毒(HCV)石门株部分p23和p14基因的克隆、序列测定及与其他HCV株的比较 [J], 李红卫;涂长春;吕宗吉;孙明;金扩世;余兴龙;殷震因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

六种育种方式的操作流程及关键步骤原理

六种育种方式的操作流程及关键步骤原理育种是指通过选择和培育具有特定性状的植株或动物，以期获得更好的品种。

在育种中，有多种育种方式可以选择，每种方式都有其独特的操作流程和关键步骤原理。

下面将介绍六种常见的育种方式的操作流程和关键步骤原理。

1.选择育种选择育种是根据植株或动物本身的自然变异，选择具有优良性状的个体作为育种材料，并将其繁殖后代。

操作流程一般包括以下几个步骤：(1)选择优良性状：根据遗传性状特点和育种目标，选择具有优良性状的个体。

(2)个体筛选：通过对育种材料进行观察和测试，筛选出具有目标性状的个体。

(3)后代选择：选择所得后代中的最优个体，并进行进一步繁殖。

关键步骤原理：选择育种的关键在于选择合适的育种材料和筛选方法。

根据遗传学原理，良好的性状在后代中具有较高的遗传率，通过持续的选择和繁殖，可以逐步积累并固定这些优良性状，从而获得更好的品种。

2.杂交育种杂交育种是利用不同亲本之间的亲和性和互补性进行交配，以获得一代的杂种。

操作流程一般包括以下几个步骤：(1)亲本选择：选择具有较好性状的亲本，确保其具有不同的遗传基础。

(2)交配：将选定的亲本进行人工或自然授粉交配，获得杂交后代。

(3)杂种优胜劣汰：评价杂交后代的性状，并选择优秀的杂交种植株或幼苗，在后续繁殖中进行淘汰和筛选。

关键步骤原理：杂交育种通过将不同亲本的优点结合起来，实现杂种优势的发挥。

杂交后代表现出了杂种优势，表现在生长速度、产量、抗病性等方面。

通过选择杂交后代中具有较好性状的个体进行繁殖，可以逐步固定这些优良性状。

3.突变育种突变育种是利用植物或动物自然突变或诱发突变，筛选出具有新性状的突变体，将其进行繁殖和选育。

操作流程一般包括以下几个步骤：(1)突变体筛选：通过收集植物或动物种群，筛选出具有突变性状的个体。

(2)突变体鉴定：对筛选出的突变体进行性状鉴定，并与野生型或普通品种进行比较。

(3)后代选择和繁殖：选择突变体中具有良好性状的个体，并进行后代繁殖。

病原微生物第6章细菌的耐药性习题与答案

第6章细菌的耐药性一、选择题A型题1、编码细菌对抗菌药物耐药性的质粒是：A.F质粒B.R质粒C.Vi质粒D.Col质粒E.K质粒2、固有耐药性的产生是由于：A.染色体突变B.接合性R质粒介导C.非接合性R质粒介导D.转座因子介导E.细菌种属特异性所决定3、获得耐药性的产生原因不包括：A.染色体突变B.细菌种属特异性决定的耐药性C.非接合性R质粒介导D.接合性R质粒介导E.转座因子介导4、关于R质粒的描述，下列哪项是错误的：A.R质粒是耐药性质粒B.R质粒可通过接合方式传递C.R质粒在肠道菌中更为常见D.R质粒在呼吸道感染细菌中更为常见E.R质粒由RTF和r决定子组成5、R质粒决定的耐药性的特点不包括：A.以多重耐药性较为常见B.可从宿主菌检出R质粒C.容易因质粒丢失成为敏感株D.R质粒的多重耐药性较稳定E.耐药性可经接合转移6、细菌耐药性产生的机制不包括：A.钝化酶的产生B.药物作用靶位的改变C.抗菌药物的使用导致细菌发生耐药性基因突变D.细菌对药物的主动外排E.细菌细胞壁通透性的改变X型题1、下列基因转移与重组的方式中，哪些与细菌的耐药性形成有关？A.转化B.转导C.接合D.溶原性转换E.原生质体融合2、获得耐药性发生的原因：A.染色体突变B.细菌种属特异性决定的耐药性C.抗菌药物的使用D.R质粒介导E.转座因子介导3、细菌耐药性的控制策略：A.合理使用抗菌药物B.严格执行消毒隔离制度C.研制新抗菌药物D.研制质粒消除剂E.采用抗菌药物的“轮休”措施4、细菌耐药性产生的机制A.抗菌药物的使用导致细菌发生耐药性基因突变B.药物作用靶位的改变C.钝化酶的产生D.细菌对药物的主动外排E.细菌细胞壁通透性的改变二、填空题1、细菌耐药性产生的机制主要有，，和。

2、引起细菌耐药的钝化酶主要有，，和。

3、细菌耐药性的控制策略有，，，，和。

三、名词解释1、耐药性（drug resistance）；2、固有耐药性（intrinsic resistance）；3、获得耐药性（acquired resistance）；4、R质粒(resistance plasmid)。

基因重组的原理

基因重组的原理
基因重组是指通过改变或重新组合DNA分子中的基因序列，
使之产生新的组合形式。

基因重组可以发生在同一染色体上的不同区域，也可以发生在不同染色体之间。

基因重组的原理主要包括以下几个步骤：
1. DNA断裂：在重组发生的位置上，DNA双链发生断裂，使
得特定区域的DNA段与其他DNA段分离。

2. DNA连接：在断裂的末端，酶类介导的酯键形成，将DNA
断裂的末端连接在一起。

这个过程涉及到DNA连接酶的活性。

3. DNA修复：在染色体重组过程中，断裂的末端被蛋白质介
导的复合物修复。

修复可以通过两种方式进行：一种是非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ），这种方式不
需要同源DNA序列进行配对，而是通过酶类介导的连接来修复。

另一种是同源重组修复（Homologous recombination, HR），需要一段同源的DNA序列作为模板，进行复制和修复。

4. 结构调节：在重组过程中，染色体上的结构会发生变化，这些变化可能包括染色体的缩短、延长或者重组。

这种结构调节对于正确重组的发生至关重要。

基因重组在自然界中普遍存在，在生物体的进化和遗传变异过程中起着重要作用。

而人工基因重组则是通过技术手段，有针
对性地改变基因序列，以达到特定目的。

例如，基因重组可以用于基因工程领域，用于生物制药、农业改良、环境修复等方面。

基因重组技术的发展也为人类提供了更多的研究和治疗手段。

6细菌和噬菌体的重组作图

(2)低频转导(low-frequency transduction, LFT)
由于不正常环化现象发生的频率较低，在释放出的106个噬菌体中只有1个gal＋转导噬菌体感染受体，因此转导的频率很低，称为低频转导。 λdgal→ gal－受体
①稳定转导子
②不稳定：整合—切离
(3)高频转导(high frequency trasduction，HFT)
五、中断杂交作图
根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。
1961年 Jacob 和 Wollman
供体HfrH ：strs thr＋leu＋azir tonr lac＋ gal＋受体F－：strr thr－leu－azis tons lac－gal－
操作方法：37℃混合培养每隔一段时间取样搅拌器中断杂交涂布含链霉素的基本筛选培养基影印培养于含链霉素的几种不同的培养基（选择培养基）上观察重组子鉴定各基因的转移时间
判断细菌基因间的位置关系
以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu、thr、 azi三个基因的顺序。供体 thr+ leu+ azir → 受体thr- leu- azis，观察其共转导率。
三个基因间的排列顺序
② 重组值的计算 a+b+供体 → ab受体
3.特异性转导(局限性转导)
(1)产生机制
2.Hfr的特点：
(1)染色体重组频率高，比 F+×F- 高1000倍； (2)F因子转移频率低， F-→F+ 很少或没有。
3.Hfr和F+的联系和区别
联系：都是雄性菌，含有F质粒区别：（1）前者高频重组，后者低频重组；（2）前者F因子转移频率低，后者F因子转移频率高；（3）前者F因子整合，后者F因子游离。

第六章遗传重组

第六章遗传重组
1
主要内容
概述 6.1 6.2 6.3 6.4
同源重组位点专一性重组转座重组异常重组（了解）
2
概述：
遗传重组是生物界普遍存在的遗传现象。进行有性生殖的物种在减数分裂过程中发生重组。若发生了物理交换，则遗传物质产生新的排列组合。生存→变异→突变，重组适应环境、加速进化；损伤修复等。
链上，因而出现很低的转化频率。
敲除校正基因可使受体菌变为高转化效率菌。
45

P125
必须掌握
同源重组的功能和基本条件
同源重组的生物学功能：（1）对维持种群的遗传多样性有重要意义（2）在真核生物中，同源重组使染色体产生瞬间物理连接，保证了减数分裂中染色体的正确分离；（3）有助于损伤DNA的修复。同源重组的发生应具有以下基本条件：（1）在交换区具有相同或相似的序列；

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A A a a

粪壳菌的子囊孢子因在减数分裂中或减数分裂后8孢子中发生不同的修复作用，而产生多种不同的分离比。
A A
a a
野生型：突变型分离比有6：2；
4：4；
2：2：2：2等
34
（6）双链断裂修复模型
目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链断裂引发重组是个常见的机制。该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的两条链被核酸内切酶切断，然后在核酸外切酶作用下产生3’单链黏性末端。两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋的同源区，臵换“供体”双螺旋的一个单链而形成一段异源双链DNA，并同时产生一个D 环（D-loop）。
5´ 3´
3´
5´
5´ 3´
5´ 片
5´
3´

基因重组(hollidaY)

A、ＤＮＡ复制时空位的相对位置上出现Ｔ而引起转换
O T G C
G. L. ZHOU
A T
O C
G C
6
（2）碱基修饰剂（改变DNA结构的诱变剂）
B、ＤＮＡ复制时，在空位的相对位置上出现Ａ或Ｇ，引起颠换：
O A G C O C O G T A C G
C、导致ＤＮＡ断裂，引起染色体畸变成移码突变。

异源双链heteroduplex
G. L. ZHOU
31
(二)同源重组的Holliday模型
G. L. ZHOU
32
(二)同源重组的Holliday模型
G. L. ZHOU
33
(二)同源重组的Holliday模型
6.Holliday连接体异构化、拆分
G. L. ZHOU
34
6. Resolving Holliday junction
G. L. ZHOU
27
(二)同源重组的Holliday模型
1. Homologous DNA pairs
2. Nicks made near Chi (GCTGGTGG) sites by a nuclease. 2.两个DNA分子单链的同一部位发生断裂。
G. L. ZHOU
28
(二)同源重组的Holliday模型
G. L. ZHOU
基因转变伴随基因重组
26
引入：Holliday模型
这是R.Holliday 1964年提出的一个关于基因重组的模型。
(a)联会；(b)两个染色单体双链ＤＮＡ分子中各一条单链为核酸内切酶切断；（c）单链游离端移动；(d) 游离端交换位置；（e）单链连接成为半交叉；(f)半交叉位置移动成十字型结构；（g）两臂旋转；(h) 上下两个单链由限制性内切酶切断；(i) DNA连接，中间包含杂合双链的两条染色单体，两旁基因（Ａ和Ｂ，ａ和ｂ之间）发生了重组。

高中生物第六章基因重组与基因工程

第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。

2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。

二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

6上生物第一单元知识点

6上生物第一单元知识点第一部分：细胞的结构和功能细胞是生物体的基本单位，了解细胞的结构和功能对于理解生物体的生命活动具有重要意义。

细胞的基本结构1. 细胞膜：由磷脂和蛋白质组成，起到保护细胞内部结构，调节物质的进出功能。

2. 细胞质：包含细胞核和细胞器的胶状物质，是细胞内物质运输的场所。

3. 细胞核：控制细胞的生命活动，包含遗传物质DNA。

4. 线粒体：细胞呼吸的场所，产生细胞所需的能量。

5. 内质网：细胞蛋白质的合成和运输的通道。

6. 高尔基体：对蛋白质进行修饰和分泌。

细胞的功能1. 自我复制：细胞可以通过细胞分裂生产新的细胞。

2. 细胞新陈代谢：包括物质的吸收、消化、合成和分解等过程。

3. 细胞运动：某些细胞具有自主运动的能力，如纤毛细胞和鞭毛细胞。

第二部分：遗传与变异遗传是生物种群发展和演化的基础，通过遗传，生物可以传递和继承特定的性状，而变异则为进化提供了可能。

遗传物质DNA1. DNA是构成遗传物质的分子，由脱氧核糖核酸组成。

2. DNA通过碱基对的方式进行信息传递，包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）四种碱基。

基因和染色体1. 基因是遗传信息的基本单位，位于染色体上。

2. 染色体是细胞内DNA的组织形式，携带着生物的遗传信息。

遗传规律1. 孟德尔遗传规律：包括显性和隐性遗传、基因分离和基因自由组合等。

2. 随机分离和重组：由于基因分离和基因重组的随机性，后代的遗传组合具有多样性。

变异的起源和形式1. 变异是遗传信息的突发性改变。

2. 变异可通过突变和染色体重组等方式产生。

3. 变异的形式包括基因突变、染色体结构改变和染色体数目改变。

第三部分：细胞的生长和发育细胞的生长和发育是细胞从诞生到成熟的过程，涉及到细胞的分裂和分化等过程。

细胞的分裂1. 有丝分裂：细胞核进行分裂和遗传物质的分配。

2. 减数分裂：生殖细胞进行分裂，形成四个基因组不同的细胞。

细胞的分化1. 细胞分化是细胞从初始状态分化为不同形态和功能的过程。

微生物学-第六章微生物的遗传

2，T2噬菌体感染实验
用 32P 标记病毒的 DNA ， 35S 标记病毒的蛋白质外壳。然后将这两种不同标记的病毒
分别与宿主大肠杆菌混合，结果发现：用含有35S蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大多数放射性留在宿主细胞的外边，而用含有 32PDNA的T2噬菌体感染大肠杆菌时，32PDNA 注入宿主细胞，并产生噬菌体后代，这些T2 噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小
• 2) 如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达，就成为流产转导（abortive transduction），其特点是在选择培养基平板上形成微小菌落。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。
• 3）被降解, 转导失败，在选择平板上无菌落形成。
大肠杆菌基因组特点：
1，遗传信息是连续的。
2，功能相关的结构基因组成操纵子结构，有些功能相关的RNA基因也串联在一起。4100 个基因， 2584 个操纵子， 16SrRNA 基因 ---23SrRNA基因----5SrRNA基因串联在一起。
3，结构基因在基因组中多为单拷贝。rRNA 基因多拷贝，7个rRNA操纵子。
将待测样品与从老鼠肝脏抽提的酶混合在一起适当保温后，用直径约2~3mm的圆形滤纸片吸取待测样品，放置在含有鼠伤寒沙门氏细菌组氨酸缺陷型突变株的基本培养基平板中央， 370C培养16~24小时。如有诱变作用，则在滤纸片周围即可长出回复突变的菌落，由于试验纸片的化学药剂向四周扩散而形成自然的浓度梯度，故在浓度最高即离试验纸片近的地方，细菌会全部被杀死，因而无菌落形成；而离试验滤纸片较远的适宜地方形成回复突变的菌落最多。

(参考)基因工程第六章 DNA重组的操作

47
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）：二抗上携带一种酶能催化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法脂质体介导感染法显微注射法病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术电击法血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作，其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体介导法等；进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。

细菌基因转移和重组的方式

细菌基因转移和重组的方式细菌基因转移和重组是指细菌之间通过水平基因转移和重组的方式，将DNA片段从一个细菌传递到另一个细菌，从而实现基因的交流和组合。

这种方式可以使细菌获得新的基因，从而具备新的功能或适应新的环境。

细菌基因转移主要有三种方式：转化、转导和共轭。

转化是指细菌通过吸收自由DNA片段的方式获得新的基因。

在自然环境中，细菌的DNA片段可以由其他细菌释放出来，被周围的细菌吸收并整合到自己的基因组中。

转导是指细菌通过细菌噬菌体感染的方式获得新的基因。

噬菌体是一种能够感染细菌并将自己的基因组整合到细菌基因组中的病毒。

当噬菌体感染细菌时，它会释放出自己的基因组，并将其中的一部分整合到细菌的基因组中。

共轭是指细菌通过细菌质粒的方式获得新的基因。

细菌质粒是一种可以自主复制和传递的小型DNA分子，它可以在细菌之间进行传递，从而使细菌获得新的基因。

细菌基因重组是指细菌通过DNA重组的方式获得新的基因组合。

在细菌基因组中，存在着大量的DNA片段，这些片段可以通过重组的方式重新组合，形成新的基因组合。

基因重组可以发生在同一个细菌基因组中的不同位置，也可以发生在不同细菌基因组之间。

基因重组的发生需要一系列的酶和蛋白质参与，这些酶和蛋白质能够识别并切割DNA分子，从而使DNA片段重新组合。

基因重组的结果是产生新的DNA序列，从而产生新的基因组合。

细菌基因转移和重组的方式在细菌世界中起到了非常重要的作用。

通过这种方式，细菌可以获得新的基因，从而具备新的功能或适应新的环境。

例如，某些细菌可以通过水平基因转移和重组的方式获得抗生素抗性基因，从而在抗生素环境中存活下来。

此外，细菌基因转移和重组也是细菌进化和适应环境变化的重要手段。

细菌通过基因转移和重组可以在短时间内获得新的基因，从而适应新的环境。

然而，细菌基因转移和重组也可能带来一些负面影响。

例如，细菌通过基因转移和重组获得的抗生素抗性基因可能会传递给其他细菌，从而导致抗生素耐药性的扩散。

6癌基因与抑癌基因

杜尔贝科(1914～) 意大利裔美国病毒学家
1970年， H.Temi和Dulbecco 发现致癌的RNA病毒中存反转录酶，提出了原病毒假设，认为RNA病毒通过反向转录和正向转录以及与宿主细胞 DNA发生交换或重组，能形成癌基因。
特明(1935～1994) 美国病毒学家
1976年H.Evarmus和J.M.Bishop发现鸟类肉瘤病毒中含有致癌基因。被命名为病毒癌基因 (Virus oncogene V-onc). 80年代初通过很多实验证实了癌基因的存在。
RB：核磷酸蛋白，有磷酸化和非磷酸化两种形式
(1)主要是可以和肿瘤抗原相互作用：
RB的379~792残基区域可结合：
SV40 T抗原腺病毒E1A抗原人类乳头瘤病毒E7抗原
(2) RB产物可抑制部分致癌蛋白。 (3)RB还有抑制细胞增殖的作用。
②RB的作用机制：
静止期： ①RB非磷酸化形式，与转录因子E2F结合； ② E2F促进进入S期必需的基因，促进增殖。 ③RB/E2F 复合物干扰 E2F与DNA的结合，抑制细胞周期，抑制增殖。需增殖时： ①G1末至G2末cyclin/ CDK使RB磷酸化。 ②磷酸化RB与E2F解离； ③ E2F发挥转录因子作用，活化下游基因； ④细胞增殖。
③Rb基因的灭活机制：
Rb基因: 13q14,150kb,27exons & 26 intron → mRNA 4.7kb →Pr P110RB
① exon 2 ~ 6丢失，缺乏正常大小的mRNA及RB蛋白；
② exon 13～17丢失，基因移码突变，翻译提前终止，无RB表达；
③ exon 5～6单拷贝变成2个拷贝，mRNA相应增大，移码突变，翻译提前终止，无RB表达；

6基因的重组与转移

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