5--基因的重组与转移

分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
2°C离 心收集菌 体
On ice 混合
冰冷的水 重悬菌体
电转仪调为 2.5kV,25F 脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37°C中速 震荡60分钟
冰冷的水 重悬菌体
2°C离 心集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
4. 平板培养 基培养细菌
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
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第二节 重组体导入细菌细胞
外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
外源基因 导入细胞 的方法
连接反应体系中，插入片断比载体多10 倍以上。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连 接。但可以与插入片断以单链连接。
载体
5’
3’
插入片断
五、载体和外源DNA插入片段的连接结果
1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率 很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并 列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 而且目的DNA再切不下来
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
2. 人工加尾形成 “粘性末端”
cI857
DNA 其它基因
阻遏 蛋白
溶源状态（DNA不转录、不翻译）
32℃
阻遏 蛋白
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
44℃—45℃
（4） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。
噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
二、体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 （2）转导（transduction）
通过受体菌细胞表面的DNA接受器位 点（receptor site)，使带有外源基因的 重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
2. 在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
(5) 体 外 包装好的重组噬菌体感染受体菌，使 受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。
第五章 基因的重组与转移
外源DNA 转化或转导
载体DNA 连接 重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。
ligase nick
二、齐平末端（blunt end）的连接 1. 直接连接
（3）cI857基因突变的噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因， 感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保 持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、 外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。
但由于该噬菌体的S基因上有一个突变， 所以细菌还不裂解。
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
转化率 每gDNA转化成功的细菌克隆数。
转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/gDNA）。
BamHI
3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时 候，更要注意。
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC 载体
ATGCGGAATTCT 插入片断
ATGGAATTC T 重组 但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
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一、转化（transformation) 感受态大肠杆菌的制备
1. 目的
增加受体菌 细胞膜的通 透性。
2. 菌种
使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。
3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
4. 制备过程
培养大 肠杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 510 min
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
（1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。
①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
（1）用相同的酶切
EcoRI
EcoRI
EcoRI
（2）用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。
2. DNA插入的方向正确
（1）用双酶切
由于产生的粘性末端不同，只能以 固定方向连接。
EcoRI
BamHI EcoRI
BamHI
EcoRI
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段
三、PCR产物的连接
1. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补
相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
感受态细胞 （competent cells)
①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。 ③CaCl2处理
（1）热休克法
10ng载 体DNA
100L感 受态菌
10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA
On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42ºC 1分钟
37℃摇1小时
加入1mL LB培养基
（2）电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷 的水重悬