5--基因的重组与转移
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连接反应体系中，插入片断比载体多10 倍以上。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连 接。但可以与插入片断以单链连接。
载体
5’
3’
插入片断
五、载体和外源DNA插入片段的连接结果
1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
cI857
DNA 其它基因
阻遏 蛋白
溶源状态（DNA不转录、不翻译）
32℃
阻遏 蛋白
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
44℃—45℃
（4） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。
噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
BamHI
3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时 候，更要注意。
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC 载体
ATGCGGAATTCT 插入片断
ATGGAATTC T 重组 但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
2°C离 心收集菌 体
On ice 混合
冰冷的水 重悬菌体
电转仪调为 2.5kV,25F 脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37°C中速 震荡60分钟
冰冷的水 重悬菌体
2°C离 心集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
4. 平板培养 基培养细菌
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
(5) 体 外 包 装 过 程
（6） 转导
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使 受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。
17
第二节 重组体导入细菌细胞
外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 （3）转导（transducຫໍສະໝຸດ Baiduion) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
外源基因 导入细胞 的方法
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段
三、PCR产物的连接
1. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补
相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
（1）用相同的酶切
EcoRI
EcoRI
EcoRI
（2）用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。
2. DNA插入的方向正确
（1）用双酶切
由于产生的粘性末端不同，只能以 固定方向连接。
EcoRI
BamHI EcoRI
BamHI
EcoRI
（1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。
①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
感受态细胞 （competent cells)
①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。 ③CaCl2处理
第五章 基因的重组与转移
外源DNA 转化或转导
载体DNA 连接 重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。
ligase nick
二、齐平末端（blunt end）的连接 1. 直接连接
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
2. 在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
18
一、转化（transformation) 感受态大肠杆菌的制备
1. 目的
增加受体菌 细胞膜的通 透性。
2. 菌种
使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。
3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
4. 制备过程
培养大 肠杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 510 min
（3）cI857基因突变的噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因， 感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保 持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、 外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。
但由于该噬菌体的S基因上有一个突变， 所以细菌还不裂解。
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
（1）热休克法
10ng载 体DNA
100L感 受态菌
10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA
On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42ºC 1分钟
37℃摇1小时
加入1mL LB培养基
（2）电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷 的水重悬
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
二、体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 （2）转导（transduction）
通过受体菌细胞表面的DNA接受器位 点（receptor site)，使带有外源基因的 重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。
T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率 很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并 列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 而且目的DNA再切不下来
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
2. 人工加尾形成 “粘性末端”
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
转化率 每gDNA转化成功的细菌克隆数。
转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/gDNA）。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连 接。但可以与插入片断以单链连接。
载体
5’
3’
插入片断
五、载体和外源DNA插入片段的连接结果
1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
cI857
DNA 其它基因
阻遏 蛋白
溶源状态（DNA不转录、不翻译）
32℃
阻遏 蛋白
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
44℃—45℃
（4） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。
噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
BamHI
3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时 候，更要注意。
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC 载体
ATGCGGAATTCT 插入片断
ATGGAATTC T 重组 但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
2°C离 心收集菌 体
On ice 混合
冰冷的水 重悬菌体
电转仪调为 2.5kV,25F 脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37°C中速 震荡60分钟
冰冷的水 重悬菌体
2°C离 心集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
4. 平板培养 基培养细菌
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
(5) 体 外 包 装 过 程
（6） 转导
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使 受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。
17
第二节 重组体导入细菌细胞
外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 （3）转导（transducຫໍສະໝຸດ Baiduion) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
外源基因 导入细胞 的方法
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段
三、PCR产物的连接
1. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补
相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
（1）用相同的酶切
EcoRI
EcoRI
EcoRI
（2）用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。
2. DNA插入的方向正确
（1）用双酶切
由于产生的粘性末端不同，只能以 固定方向连接。
EcoRI
BamHI EcoRI
BamHI
EcoRI
（1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。
①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
感受态细胞 （competent cells)
①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。 ③CaCl2处理
第五章 基因的重组与转移
外源DNA 转化或转导
载体DNA 连接 重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。
ligase nick
二、齐平末端（blunt end）的连接 1. 直接连接
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
2. 在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
18
一、转化（transformation) 感受态大肠杆菌的制备
1. 目的
增加受体菌 细胞膜的通 透性。
2. 菌种
使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。
3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
4. 制备过程
培养大 肠杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 510 min
（3）cI857基因突变的噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因， 感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保 持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、 外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。
但由于该噬菌体的S基因上有一个突变， 所以细菌还不裂解。
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
（1）热休克法
10ng载 体DNA
100L感 受态菌
10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA
On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42ºC 1分钟
37℃摇1小时
加入1mL LB培养基
（2）电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷 的水重悬
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
二、体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 （2）转导（transduction）
通过受体菌细胞表面的DNA接受器位 点（receptor site)，使带有外源基因的 重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。
T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率 很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并 列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 而且目的DNA再切不下来
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
2. 人工加尾形成 “粘性末端”
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
转化率 每gDNA转化成功的细菌克隆数。
转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/gDNA）。