6第六章基因克隆操作过程

原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等）， 1970年建立。其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经 热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。 处于感受态的细菌，容易接受外源DNA。
2016/7/2
基因克隆操作过程
25
OD600=0.4左 右
2016/7/2
基因克隆操作过程
5
1. Digestion by restriction endonuclease（切）
作用对象 目的基因片段、载体
工具：限制 性核酸内切 酶
目的 获得线性化目的基因片段、 线性化载体
2016/7/2 基因克隆操作过程
Vector
Target gene
6
EcoR I
《分子克隆第 三版》
2016/7/2 基因克隆操作过程 26
《分子克隆 第三版》
2016/7/2 基因克隆操作过程 27
Ca2+诱导转化过程中应注意的事项
转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%； 热击过程中不要摇晃离心管； 检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些 （104菌落/板）；转化子于37℃培养不要超过20小时。因为 铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现卫星菌落。 转化过程中37℃温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高， 为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。 当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（4100rpm， 5min），并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。 刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。
加热
CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG
5' 5'
GT CA A
2016/7/2
TTTT T TT T A AAAA A
TG A AC
CA GT T
AAAA A AA A T TTTT T
S1 nuclease
AC T TG
TG AC
CTGCA G
BamHI
GATCC G
BamHI
GATCC G
PstI
CTGCA G
退火
CTGCA G G ACGTC
T4-DNA ligase CTGCAG GACGTC
2016/7/2
G GATCC CCTAG G
GGATCC CCTAGG
16
基因克隆操作过程
（5）平末端的连接
5' G 3' C C 3' G 5'
Pst I
Pvu II
2016/7/2
基因克隆操作过程
7
各种限制酶酶切反应所使 用的buffer（Takara）
双酶联合酶切所使用的buffer（Takara
2016/7/2
基因克隆操作过程
8
单酶切实例
2016/7/2
基因克隆操作过程
9
双酶联合酶切实例
2016/7/2
基因克隆操作过程
10
2. Ligation by DNA ligase（接）
5'
5'
T GATCC ACTAG G
T GATCC ACTAG G
G GATCA CCTAG T
G GATCA CCTAG T
5' 5'
T4-DNA ligase
5'
5' TGATCC ACTAGG TGATCC ACTAGG
基因克隆操作过程
GGATCA CCTAGT GGATCA CCTAGT
5' 5'
5' G CTTAA 5'
5' AATTC G
G CTTAA 5'
5' AATTC G
5'
退火
5' 5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
5' 5'
T4-DNA ligase
5' 5'
2016/7/2
GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG
作用对象 线性目的基因片段、线性化载体
工具： DNA 连接酶
目的 获得含有目的基因的重组 分子
2016/7/2 基因克隆操作过程
Vector
11
（1）单酶切产生的粘性末端的连接
5'
获得连接方向不同的两种产物 需要鉴定目的基因的连接方向
GAATTC CTTAAG
5'
GAATTC CTTAAG
EcoRI
Takara网站提供的同尾酶信息
2016/7/2
基因克隆操作过程
13
5'
TGATCA ACTAGT
5' 5'
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
5'
BclI
5' T 5' GATCA ACTAG 5' T
BamHI
5' GATCC G G CCTAG 5'
5'
退火
获得连接方向 不同的两种产物 需要鉴定目的 基因的连接方向 目的产物中对 应位置的序列不 再是原来的酶切 位点
CA GT
19
基因克隆操作过程
（6）粘性末端的更换
5' GGATCC CCTAGG 5'
BamHI
5' G CCTAG 5' 5' GATCC G
5'
Klenow
5'
GGATC CCTAG 5'
补平
5' GATCC CTAGG
5'
T4-DNA ligase
EcoRI
5'
GGAATTCC CCTTAAGG
2016/7/2
基因克隆操作过程
29
试剂的质量
所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除 菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4℃）。
防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿 如离心管、枪头等最好 是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它 试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。
教学目的及要求
理解基因工程各操作步骤的原理。 掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。 重点：目的基因转化子的筛选方法。 应用：能够根据一定的研究目的，确定基因克隆 的策略，并设计其技术路线。
2016/7/2 基因克隆操作过程 4
一、目的基因的体外重组——切与接
In vitro Recombination of Target Gene—— Digestion and Ligation
5' C G
切平
G C
5'
5' GATCC CTAGG
GGATC CCTAG 5'
T4-DNA ligase
获得连接方向 不同的两种产物
GGATCG CCTAGC GGATCG CCTAGC
5'
5'
CGATCC GCTAGG CGATCC GCTAGG
需要鉴定目的 基因的连接方向；
5' 5'
2016/7/2
质粒的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入 的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng 的cccDNA可使50μl 的感受态细胞达到饱和。 一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 ％。
EcoRI linker
GGATCGGAATTCCGATC CCTAGCCTTAAGGCTAGG
基因克隆操作过程
5'
2016/7/2
20
DNA ligase介导的体外连接实例
2016/7/2
基因克隆操作过程
21
3.重组率
重组率：指在基因重组实验中，获得的有目的基因的重组分子数的数目，
占载体分子总数的百分比。 在常规实验条件下，重组率一般为25-75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化 DNA重组的后续操作。
提高重组率的方法
提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：防止载体自连
碱性磷酸单酯酶CIP、BAP
2016/7/2
基因克隆操作过程
22
提高重组率的方法
加装同聚尾末端
5' GCATG 3' C C 3' GTACG
G 3' ACGTC CTGCA 3' G
基因克隆操作过程
目的产物中对 应位置的序列不 再是原来的酶切 15 位点
（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接
连接产物中目的基因的方向是确定的
CTGCAGNNNNNNNNNGGATCC GACGTCNNNNNNNNNCCTAGG GGATCC CCTAGG CTGCAG GACGTC
PstI
14
2016/7/2
（3）不同粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC
5'
5'
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
5'
PstI
5' CTGCA 3' G G 3' ACGTC
BamHI
5' GATCC G Klenow G CCTAG 5' 补平
5'
T4-DNA polymerase
Target gene
酶切
Target gene
连接
转化
筛选
扩增
2016/7/2
基因克隆操作过程
2
目的基因的体外重组——酶切和连接（切、接）
重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
目的基因转化子的筛选和鉴定（检）
2016/7/2
基因克隆操作过程
3
本章主要内容
目的基因的体外重组——切与接 重组DNA分子的转化和扩增——转与增 目的基因转化子的筛选和鉴定——检
G 3' C
C 3' G
TdT
dTTP
TdT
G 3' AAAAAAAAAAC
dATP
CAAAAAAAAAA 3' G
GTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTG
退火
5' 5'
T4-DNA ligase
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC
2016/7/2
基因克隆操作过程
30
（2）细菌原生质体的转化 适用对象：革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）， 其接纳外源 DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通 常去除细胞壁后再进行转化，这与酵母菌、霉菌、植物 细胞等类似。
细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不 尽相同。以链霉菌为例，细菌需生长在高渗培养基中 （如 34% 的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁 对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在 10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应 保持无水、无去污剂。 细菌原生质体的转化：由PEG和Ca2+介导
基因克隆操作过程
GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG
5' 5'
12wenku.baidu.com
（2）同尾酶生产的粘性末端的连接
• 同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。 • 同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相 同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同。 • 基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。
5'
TdT
dCTP
TdT
G 3' GGGGGGACGTC
dGTP
CTGCAGGGGGG 3' G
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
退火
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Klenow
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
T4-DNA ligase
第六章 基因克隆操作过程
Chapter VI The Manipulation Procedure of Gene Cloning
授课教师：王斌
2016/7/2
基因克隆操作过程
1
基因克隆操作过程概述
Restriction endonuclease
Vector
Vector
DNA ligase
Vector
细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细 菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行， 内含脯氨酸和微量元素。
2016/7/2 基因克隆操作过程 31
（3）λ噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含 葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5。 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液， 30℃ 保温10分钟。 转染裂解：加入20 倍体积的新鲜培养基，30℃继续培 养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加， 然后涂板筛选。
2016/7/2
基因克隆操作过程
28
提高转化效率的几个重要因素：
细胞生长状态和密度
不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养 液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度 在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合 适。密度过高或不足均会影响转化效率。
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
5'
23
2016/7/2
基因克隆操作过程
二、重组DNA分子的转化和扩增 ——转与增
2016/7/2
基因克隆操作过程
24
1.转化的原理与技术
（1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化