项目5谷氨酸发酵代谢曲线测定
发酵过程中谷氨酸含量的测定
发酵过程中谷氨酸含量的测定发酵过程中谷氨酸含量的测定 [适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 8学时一、实验目的了解华勃氏呼吸仪的使用方法，熟悉用华勃氏呼吸仪测定谷氨酸含量。
二、实验原理发酵液中谷氨酸含量的测定，普遍使用华勃氏呼吸仪，利用专一性较高的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶，在一定温度(37?)、一定pH值(4.8,5.0)和固定容积下，使L-谷氨酸脱羧生成二氧化碳。
通过测量反应系统中气体压力的升高，可计算出反应生成的二氧化碳的体积，然后换算成试样中谷氨酸的含量。
三、仪器设备华氏呼吸仪，1毫升移液管，检压管，反应瓶。
四、相关知识点大量形成谷氨酸是生产的目的，目前均采用华勃氏呼吸仪测定法。
一般从发酵12小时开始，每隔2-4小时测定一次。
五、实验步骤(一)检压管及反应瓶的准备将标定完反应瓶常数的检压管及反应瓶磨砂口上的高真空油脂用毛边纸擦试干净，再用棉花用少量二甲苯擦一次，用自来水清洗净后再用稀洗液浸泡约3小时，用自来水洗净，蒸馏水淋洗2次，去水后低温烘干。
在检压管下端按上一干净的短橡皮管，橡皮管末端用玻璃珠塞住。
小心将检压管固定在金属板上，在橡皮管内注入检压液。
打开三通活塞，旋动螺旋压板，检压液应能上升到最高刻度处，液柱必须连续，不能有气泡，两边高度应一致。
(二)发酵液的稀释本法要求试样含谷氨酸0.05,0.15,，否则反应生成二氧化碳太多，压力升高太大以致超过检压管刻度而无法读数。
一般发酵终了发酵液含谷氨酸6,8,，故应稀释50倍:吸取发酵液2mL，注入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即可。
(三)加液分别吸取上述发酵稀释液1mL，pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液0.2mL和蒸馏水1.0mL，置入反应瓶主室，另吸取0.3mL 2,大肠杆菌谷氨酸脱羧酶液置于反应瓶侧室内，使总体积为2(5mL。
主侧二室瓶口均以活塞脂涂沫，旋紧瓶塞，将反应瓶用小弹簧紧固在检压管上，将检压计装在仪器的恒温水浴振荡上(四)预热将仪器的电源接通，调节水浴温度为37?，打开三通活塞，旋动螺旋压板，调节液面高度达250mm以上，开启振荡;使在37?水浴中平衡约10分钟。
(完整版)谷氨酸发酵
1）生物素营养缺陷型⏹作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.⏹控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.2）油酸营养缺陷型⏹作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.⏹控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.（3）添加表面活性剂⏹添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.⏹机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.⏹关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.（4）添加青霉素⏹机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.⏹控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.谷氨酸发酵强制控制工艺⏹为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法.⏹控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。
谷氨酸发酵⏹ 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.⏹ 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃⏹ 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃.⏹ 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.二、谷氨酸发酵的生化过程⏹（1）是代谢控制发酵的典型代表⏹（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的……⏹整个过程可简单的分为2 个阶段:➢第1阶段是菌体生长阶段;➢第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。
谷氨酸发酵 实验报告(1)
兰州大学生命科学学院发酵工程实验谷氨酸发酵实验摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。
还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。
关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节引言：了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。
了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。
了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。
还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。
所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。
谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。
原理:谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。
谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。
谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。
谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。
如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。
生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。
因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。
项目5谷氨酸发酵代谢曲线测定
训练项目1
制药微生物发酵技术
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
一、材料和器材
• 1.菌种 黄色短杆菌
• 2.器材 恒温摇床、培养箱、5L发酵罐、SBA-40C多 功能葡萄糖-谷氨酸分析仪、分光光度计、250mL三角 瓶、吸管（10mL、1mL）、洗瓶、吸水纸、接种环、 显微镜、载玻片、盖玻片
• 1.了解种子培养基与发酵培养基的区别。 • 2.了解发酵工业的生产流程。 • 3.掌握5L发酵罐的操作及谷氨酸发酵的条件控制。 • 4.掌握分光光度计法测定菌浓及残糖、谷氨酸产量测定。 • 5.掌握分批发酵过程中菌体代谢曲线的绘制和菌体生长四期的特
点。
制药微生物发酵技术
引入（任务项目）
谷氨酸的产量发酵分析是通过？曲线
• 以时间为横坐标，OD620nm值、残糖量和谷氨酸产量为 纵坐标，画出谷氨酸发酵的代谢曲线，并分析菌体生长 四期的特点。
问题与讨论
制药微生物发酵技术
30
140
25
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68
制药微生物发酵技术
制药微生物发酵技术----课件
项目1
项目2
项目3
项目4
项目5
制药微生物发酵技术
1-3谷氨酸发酵工艺过程控制
1 谷氨酸发酵的代谢曲线测定 2 噬菌体的分离检查
制药微生物发酵技术
告知：
① 掌握灭菌与空气的净化知识。
② 掌握发酵工艺过程控制知识。
系列实验Ⅰ谷氨酸发酵
实验步骤：
1. 啤酒酵母扩大培养
2. 培养基的配置
3. 啤酒酵母的培养基选用麦芽汁培养 基,具体方法为：称取麦芽粉 ,比例 为4g麦芽粉对应10ml麦芽汁,保证 麦芽汁浓度在8~12..将麦芽粉和水 混匀, 在电炉上加热至 70℃保持半 小时左右.静置取上清液, 加入2%琼
2. 糖化制成麦汁
糖化：利用麦芽所含的各种水解酶,在适宜的条件 下,将麦芽中不溶性高分子物质〔淀粉、蛋白质、半 纤维及其中间分解产物〕,逐步分解成低分子可溶性 物质的过程.
过程包括：淀粉分解、蛋白质分解、B-葡聚糖分 解、酸的形成和多酚物质的变化.
3.麦汁过滤
目的：糖化结束后,应在最短的时间内,将糖化 醪液中的原料溶出物和非溶性的麦槽分离,以得 到澄清的麦汁和良好的浸出物收得率.
系列实验Ⅰ
液体通气发酵——谷氨酸发酵
实验目的
谷氨酸<Glutamic acid>是最先成功地利 用发酵法进行生产的氨基酸,谷氨酸发酵是 典型的代谢调控发酵,因此,了解谷氨酸发酵 机理,掌握其发酵工艺,将有助于对代谢调控 发酵的理解,有助于对其它有氧发酵,特别是 氨基酸发酵的理解和掌握.
谷氨酸发酵生理
〔2〕保压0.11MPa,105℃保持5分 钟.
〔3〕时间到后,关闭进气阀,打开冷
六、接种
缓慢降罐压至0.01MPa 火焰封口法接种
七、发酵过程的控制
〔1〕长菌期：0 ~12小时,最适温度 30~32度,控制pH不大于8.2.
〔2〕产酸期：12小时后,控制温度 34~36度,控制pH在7.1~7.2.
生产工艺流程
说明： 沥干：一般至含水量25%-30%为止；
谷氨酸棒杆菌发酵生产1，5-戊二胺的代谢流分析
谷氨酸棒杆菌发酵生产1，5-戊二胺的代谢流分析黎明;唐奇;李东霞;随树珍;路福平【摘要】为了提高糖类的利用效率，加强糖类代谢向生成尸胺的方向流动，提高尸胺产量，对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢网络进行分析，找出影响尸胺合成的代谢流量分配规律和关键节点，并通过改变溶氧及添加辅酶 NADPH 对关键节点进行验证．结果表明：6–磷酸葡萄糖和丙酮酸是影响碳源流向尸胺合成的关键节点，增强磷酸戊糖途径(HMP)和三羧酸循环(TCA)可以弱化由6–磷酸葡萄糖生成6–磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸，促进碳源向合成尸胺的方向流动，从而有效地提高尸胺产量(产量增幅为77.8%)．该研究为高产尸胺的谷氨酸棒杆菌工程菌种改造以及发酵控制提供了理论基础．%To improve the yield of cadaverine and the efficiency of carbohydrate utilization,we analysed the metabolic net-workof the fermentation of cadaverine in Corynebacterium glutamicum and found the key nodes which influenced the pro-duction of cadaverine. Key nodes were verified by improving the dissolved oxygen and adding coenzyme NADPH. The re-sults showed that the key nodes are glucose-6-phosphate and pyruvate. By enhancing the HMP pathway and tricarboxylic acid cycle,the processes of changing glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate and pyruvic acid into lactic acid were weakened,resulting in the carbon source fluiding to the synthesis of cadaverine,which could efficiently improve the yield of cadaverine(increased 77.8%). The study provided a theoretical basis for the transformation of high-producing cadaverine Corynebacterium glutamicum and fermentation control.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P9-13)【关键词】代谢途径;尸胺;谷氨酸棒杆菌;NADPH;糖类【作者】黎明;唐奇;李东霞;随树珍;路福平【作者单位】工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q9351.1 材料1.1.1 供试菌株谷氨酸棒杆菌工程菌株（C. glutamicum）ATCC13032/pXLB（CDV-2）由本实验室构建并保存.1.1.2 培养基种子培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10.发酵培养基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10.1.1.3 试剂与仪器苯甲酰氯，纯度为98%，上海金山亭新化工试剂厂；2，4-二硝基氟苯，分析纯. SBA-40C型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；SinChrom ODS-BP型色谱柱，4.6，mm× 200，mm，C18填料.1.2 培养方法在平板上取一环谷氨酸棒杆菌接种到含有5，mL种子培养基中活化，以2%的接种量接入到发酵培养基中.待培养液吸光度为1.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂诱导，到发酵中后期取样，并测量相关代谢指标.1.3 测定方法利用生物传感仪测定样品中葡萄糖与乳酸的浓度.利用高效液相色谱仪测定样品中氨基酸与尸胺的浓度.1.3.1 尸胺的测定取1，mL样品加入5，mL具塞刻度试管中，加入500，µL 2，mol/L NaOH溶液、10，µL苯甲酰氯，37，℃水浴振摇20，min，隔5，min旋涡振荡30，s，加入0.5，g NaCl、1，mL乙醚振荡30，s静置分层.把上层乙醚取至另一离心管中，待乙醚挥发完全，加入500，µL甲醇溶解，过膜后作为HPLC检测用样.柱温：20，℃；流动相：100%乙腈、0.02，mol/L乙酸铵；梯度：0～5，min乙腈体积分数为30%，5～10，min乙腈体积分数为75%，10～15，min乙腈体积分数为30%.1.3.2 氨基酸的测定取2，mL离心管，依次加入300，µL体积分数1%的2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液、300，µL 0.05，mol/L的衍生缓冲液NaHCO3和10，µL待测样品，65，℃水浴1，h后，用0.05，mol/L的定容缓冲液KH2，PO4定容至2，mL，过膜后作为HPLC检测样品.柱温：37，℃；流动相A为体积分数50%乙腈水溶液；流动相B为0.03，mol/L乙酸钠溶液.洗脱梯度见表1.1.4 尸胺代谢网络及平衡模型的建立1.4.1 代谢网络的建立建立代谢网络的原则：（1）代谢流分析是基于拟稳态假设的基础上的，即根据生理生化反应中物质的量的平衡，列出计量方程式，转化为矩阵的形式来计算；（2）据文献［11］所知，谷氨酸棒杆菌中糖类的利用途径包括EMP、TCA和HMP途径；（3）同功酶催化的反应按一个反应计算；（4）反应过程中无分支节点的反应按一步反应计算；（5）由于大量无效循环的存在，菌体中的ATP代谢并不平衡，因此不考虑ATP的总量的平衡；（6）根据谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢途径，表明丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和乳酸是影响尸胺代谢流分配的主要副产物.基于以上原则，建立的代谢网络如图1所示.图中：Glc为葡萄糖；Glc6P为6-磷酸葡萄糖；PEP为磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr为丙酮酸；Fru6P为6-磷酸果糖；GAP为3-磷酸甘油醛；P3G为3-磷酸甘油酸；AcCoA为乙酰辅酶A；Ribu5P为5-磷酸核酮糖；Xyl5P为5-磷酸木酮糖；Rib5P为5-磷酸核糖；Sed7P为7-磷酸景天庚酮糖；E4P为4-磷酸赤藓糖；OAA为草酰乙酸；α，KG为α-酮戊二酸；LAC为乳酸；Glu为谷氨酸；Ser为丝氨酸；Asp为天冬氨酸；Gly为甘氨酸；Thr为苏氨酸；Lys为赖氨酸；Cadaverine为尸胺.1.4.2 平衡模型的建立根据稳态假设，中间产物的合成速率与它的代谢速率是相等的，根据这个条件，建立平衡方程，结果见表2.将方程化为矩阵形式得出矩阵的秩为17，而一共有24个未知速率，因此，要解出该方程组，需要测定24-17=7个变量才能得出所有未知速率的解.在发酵中期，实验测定了不同溶氧下谷氨酸、葡萄糖、尸胺、甘氨酸、乳酸、丝氨酸、苏氨酸的浓度，数值微分后得出其消耗或生成速率，利用LINGO软件分析得出其余未知速率的值，进而得出代谢通量并进行通量分析，得出代谢节点.2.1 理想状态与实际状态下的代谢流分析代谢网络是一个多酶同步催化的复杂的反应体系，仅改变某一限速反应，对产物合成的影响往往不会很大［12］.因此，对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢途径进行代谢流分析，目的在于从宏观上把握影响尸胺合成的主要节点，从而有针对性地改造菌体及对尸胺发酵进行环境扰动.根据上述建立的代谢网络以及代谢方程式，在已知葡萄糖添加量而其他代谢产物未知的情况下，利用LINGO软件可对其进行理想状态代谢流计算，即在确定r1情况下，使r24达到最大时的代谢通量计算.以250，mL三角瓶50，mL装液量的实际状态下，通过对上述7种代谢产物测定，计算出实际代谢通量.计算得出的代谢通量见表3.由表3可推知：r2和r8在理想状态下的代谢通量分别为0和100，而在实际条件下代谢通量分别为71.02和28.98，表明6-磷酸葡萄糖是影响尸胺合成的代谢流分配的关键节点之一；同理，r7和r18在理想状态下的代谢通量分别为130和0，而实际状态下的代谢流分别为0.81和183.00，表明丙酮酸是影响尸胺合成的代谢流分配的又一个关键节点.6-磷酸葡萄糖是由糖酵解途径通向磷酸戊糖途径的首个中间代谢产物，由上述计算结果对比表明：提高磷酸戊糖途径的代谢通量可能是尸胺产量提高的关键所在.而丙酮酸亦是碳架进入TCA循环的首个中间代谢产物，因此，提高TCA循环的代谢通量也可能是尸胺产量提高的关键所在.磷酸戊糖途径的生理意义在于生成磷酸核糖提供核酸合成原料，而核酸为细菌本身的重要组成部分，提高磷酸戊糖途径的通量可以有效增加菌体的合成，生成辅酶NADPH提供代谢反应还原力为许多代谢反应提供前体.谷氨酸棒杆菌属好氧菌，改变溶氧可以改变菌体的合成速率及代谢产物的量与种类，提高溶氧可以有效减少乳酸的产生，增加TCA循环的代谢通量，有效改变菌体代谢网络的代谢流分配.因此，可以通过改变溶氧和加入辅酶NADPH作为扰动因子，对尸胺合成的代谢流分配及其关键节点进行验证.2.2 不同装液量下的代谢流分析摇瓶发酵简洁方便，分析效率高，而且可以通过改变摇瓶的装液量来控制发酵过程中的溶氧，从而进行不同溶氧条件下的代谢流分析.本研究在250，mL三角瓶中，分别以50，mL和25，mL装液量进行发酵实验，测定发酵中后期的葡萄糖、谷氨酸、乳酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、尸胺的消耗或积累速率.用LINGO软件进行分析，计算代谢通量，结果见表4.由表4可知：当装液量由50，mL减少到25，mL时，r7反应的代谢通量提高了81.5%，r18反应的代谢通量减小了2.73%，r24反应的代谢通量提高了12.0%，说明代谢流从合成乳酸向TCA偏移，导致合成尸胺的代谢流增加.由于减少装液量可以适当提高溶氧，说明提高溶氧可以促使糖代谢向合成尸胺的方向流动，减少乳酸的合成.这与提高溶氧可以减少乳酸产生的结果是一致的［13］.代谢流向TCA偏移后，进入TCA循环的碳架相应增高，能够合成尸胺的前体物质增加，进而增加了尸胺的产量.2.3 添加NADPH后的代谢流分析由2.1所知，为了证明提高磷酸戊糖途径的代谢通量是提高尸胺产量的关键所在，在不同装液量的基础之上，添加终浓度为25，µmol/L的NADPH进行摇瓶发酵，测定上述7种物质的代谢速率，并进行代谢流分析，结果见表5.由表5可知：与未加入NADPH相比，加入NADPH后，以50，mL装液量的实验组，r8反应的代谢通量提高了18.8%；而以25，mL装液量的实验组，r8反应的代谢通量仅提高了2.84%.由此表明：在溶氧不足时，添加NADPH可以提高磷酸戊糖途径的代谢通量，从而对提高尸胺产量有很大作用；而溶氧充足时，糖代谢向尸胺合成方向的流动明显增加，添加NADPH对磷酸戊糖途径的影响较小.可见，提高溶氧可以有效增加TCA循环以及HMP循环的代谢通量，提高菌体自身对尸胺合成所需NADPH的供给，明显提高尸胺产量.因此，提高溶氧成为提高尸胺产量的最关键因素.在提高溶氧与加入NADPH两方面的扰动下，尸胺的代谢通量由最初的5.00提高到7.20.而最终尸胺的产量提高了77.8%.通过对谷氨酸棒杆菌发酵生产尸胺的代谢网络进行代谢流分析，得出了影响尸胺产量的关键节点及与之相关的关键代谢途径.分析表明：提高磷酸戊糖途径和适当提高TCA循环途径的代谢通量是提高尸胺产量的重要手段.在发酵中后期，提高溶氧可以提高TCA循环的代谢通量，加入NADPH可以提高磷酸戊糖途径的代谢通量，两者均从整体上改变菌体代谢流分配.后期可利用分子生物学手段改造关键节点，改变菌体的代谢流，提高尸胺的产量.【相关文献】［1］ Kind S，Wittmann C. 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微生物工程谷氨酸发酵实验报告
微生物工程谷氨酸发酵实验报告谷氨酸发酵实验报告前言：谷氨酸发酵试验是一个基础性的实验，但涉及的内容比较广泛，对学生意义很大。
该实验是第一次做，我们做是有了钱一组的少许经验，担仍有很多不足。
该实验报告将对其中的错误进行分析，同时分析实验结果，对实验提出意见和建议。
关键字：谷氨酸1、实验内容该实验是系列实验，包括以下七个小实验：实验一谷氨酸菌种的制备及扩大培养实验二发酵罐结构以及空消实验三发酵培养基制备及实消实验四谷氨酸发酵过程控制实验五谷氨酸发酵过程中还原糖的测定实验六发酵过程中谷氨酸含量的测定实验七谷氨酸的等电回收及结晶实验具体内容在课件中很详细，再次不详加说明。
2、试验中的误差及错误2.1设备引起的误差及错误微生物实验需要很好的设备，否则很难将实验做好，仪器将直接决定实验是否成功。
能否有产物生成，是否被污染等。
2.1.1仪器的气密性所用仪器的气密性还可以，保证在空消和实消时能够消毒彻底，保证实验过程中的调控。
2.1.2 PH计所用的仪器PH计不准不能实时测定和调节PH值。
只能在取液时做测定，不能做到及时调节。
对结果及军中的生长有影响。
2.1.3 搅拌机由于在实验中误将玻璃棒掉进了发酵罐中，使得不能用搅拌进行混匀，只能用气体混匀，所以过程中有很多气泡。
2.2 操作引起的误差2.2.1 配比时加水过多，在一定量的情况下由于实消时产生的水过多是体积过大，浓度过低。
对效果产生影响。
2.2.2实时监控对于发酵试验，一定要保证实验过程中的状态，PH、温度、压力、气泡的量等在一定的范围内。
3、实验数据及处理3.1还原糖还原糖的标准曲线制作：glc的含量mg 0 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4OD值0 0.059 0.185 0.309 0.436 0.5543.2谷氨酸实验过程中Glu含量的测定值如下（忽高忽低）：4、实验结果分析5.1 对于葡萄糖标注曲线很准确，实时测定虽然有一定的波动，但是总体的趋势是正确的。
发酵工程应用实例 谷氨酸发酵
（2） pH值
1） pH值对谷氨酸产生菌生长的影响 2） pH值对谷氨酸积累的影响
发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。 • 发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌
体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5~8.0左右较为合适。 • 而在发酵中、后期将pH值控制在7.0~7.6左右对提高谷氨酸产量有利。
2.形态上共同特点（芽孢杆菌除外）:
（1）革兰氏阳性 （2）菌体为球形、短杆至棒状 （3）不形成芽孢 （4）没有鞭毛，不能运动 （5）都是生物素缺陷型 （6）都是需氧型微生物
二、谷氨酸合成途径
1.谷氨酸合成的方式
（1）氨基转移作用 -酮戊二酸 + 氨基酸
谷氨酸 + -酮酸
（2）还原氨基化作用 -酮戊二酸 + NH4+ + NADPH2
其他
⑤添加青霉素
• 机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去 保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.
• 控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉 素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.
（三）发酵条件的控制
（1）发酵温度
• 谷氨酸发酵前期(0~12h):30-32℃。 • 对数生长期:菌体浓度迅速增大（12h），糖耗快，维持温度30-32℃ • 在发酵中、后期:是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷
• 这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。
3. 谷氨酸发酵
当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变， 糖与尿素分解后产生的α－酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶 段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.2～ 7.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并 将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度34～37℃。
仿真谷氨酸发酵实验使用说明
仿真谷氨酸发酵实验使用说明一、系统说明1、“486”或其它新型电脑。
2、D盘留有250MB空间。
3、具多媒体功能。
二、安装方法装入光盘，先双击Ferment（盘符），再双击Disk1，在其菜单中双击Setup,即按顺序要求会自动将所有内容装入D盘。
三、启用在任务栏中选中Ferment即可开始使用。
本软件主要内容包括：（一）实验预习题（二）实验设备简介（三）实验演示（四）实验操作（五）实验结果：谷氨酸发酵标准曲线和实验曲线，实验成绩单。
（一）实验预习题共十道有关谷氨酸发酵基本知识的选择题。
（二）实验设备简介1、基本单元：可点击：（a）控制器，（b）罐体和罐盖，（c）外科系统，（d）空气系统。
2、管路：可点击：（e）供气系统，（f）放料系统，（g）供水系统。
可见气、水、料的流向。
3、控制器①温度控制器：设定及控制方式，加热或冷却指示，酸碱流加指示。
②pH控制器：设定及控制方式，酸碱流加指示。
③溶解氧（DO）控制器：设定及控制方式，转速提高或下降指示。
④搅拌转速控制器：设定及控制方式，转速快慢指示。
4、空气系统：可调节（点击）流量计按钮“+”“—”进行空气流量的设定。
5、补料系统：点击补料按钮可见料液的流向。
6、消毒系统：介绍电加热蒸器发生器的结构及控制面板的操作、压力表指示。
（可点击开关按钮观察压力指示。
7、罐体：介绍整个罐体的部件。
（三）实验演示演示整个操作过程，包括：①输入名字和学号，②排序，③PH电极校正，④配制培养基，⑤消毒，⑥控制器设定，⑦空气流量设定，⑧接种，⑨发酵。
（四）实验操作：按演示的操作方法进行仿真实验。
（五）实验结果：显示演习者操作总成绩和各步操作所得成绩，以及正常与不正常发酵的实验曲线。
附注：本软件存有20种不同控制条件下的发酵结果数据及曲线。
操作中需退出系统时可按Ｃｔｒｌ＋Ａｌｔ＋Ｄｅｌ结束任务。
操作数据一．预习题答案第一题：3 、第二题：4、第三题：1 、第四题：1 、第五题：2、第六题： 3 、第七题：3、第八题：1、3 、第九题：1、3、第十题：1、2 。
谷氨酸液体发酵
谷氨酸液体发酵摘要目的学习实验室发酵罐谷氨酸液体发酵。
方法用分光光度计测定发酵过程中发酵液的还原糖和谷氨酸的浓度。
结果没能得到谷氨酸发酵的理想曲线。
结论本实验结果并不理想，但我们已经对快速检测发酵进程有了基本了解。
关键词谷氨酸液体发酵；谷氨酸棒杆菌；质量控制1.材料与方法1.1谷氨酸菌种制备及扩大培养1.1.1一级种子培养基配制培养目的在于制备大量高活性的菌体，培养基配方如下：葡萄糖2.5％；尿素0.5％；硫酸镁0.04％；磷酸氢二钾0.1％；玉米浆3%；硫酸亚铁2ppm；硫酸锰2ppm。
1000mL三角瓶中装300mL培养基，每组3瓶，0.1MPa灭菌30分钟，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。
30～32℃摇床培养12小时。
1.1.2二级种子培养基配制培养目的是制备和发酵罐体积及培养条件相称的高活性菌体。
1000ml 三角瓶装300ml培养基，每组3瓶，0.1MPa灭菌10分钟，冷却后接种，摇床培养7～8小时。
培养基配方：葡萄糖2.5％；尿素0.34％；磷酸氢二钾0.16％；糖蜜 1.16％；硫酸镁0.043％；消泡剂0.01%；pH 7.0。
1.1.3接种接种一级种子，用接种环从斜面菌种刮取少量菌种到接种瓶中。
之后用移液器移取菌种到二级种子培养瓶中。
1.1.4并种将每3瓶二级菌种无菌合并在1000mL的三角瓶里，放入冰箱待用。
1. 2发酵培养基制备按工艺要求配制发酵培养基，10升发酵罐定容6升，实际配料时，定容到预定体积的60％左右（即10升发酵罐定容4升），另40％体积为蒸汽冷凝水和种子液预留。
培养基配方：葡萄糖13％；硫酸镁0.06％；磷酸氢二钾0.1%；糖蜜0.3％；硫酸锰、FeSO4 各2ppm；氢氧化钾0.04％；玉米粉0.125％；消泡剂0.5%。
调整pH为7.0。
尿素配成40％浓度，装在1000mL瓶中，每一瓶装800mL。
分消备用。
消泡剂配成1%浓度，分消备用。
1.3发酵培养装置消毒及培养过程控制空气过滤器及空气管路的消毒发酵罐空消电极校正发酵罐实消接种发酵过程的温度控制及pH控制1.5还原糖测定1.5.1葡萄糖标准曲线制作取5支15mm×150mm试管，按设计梯度加入0.4mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
谷氨酸发酵实验报告
一、实验目的1. 了解谷氨酸发酵的基本原理和过程。
2. 掌握谷氨酸发酵实验的操作方法。
3. 通过实验验证谷氨酸发酵过程中还原糖的消耗和谷氨酸的生成情况。
4. 分析发酵条件对谷氨酸发酵的影响。
二、实验原理谷氨酸发酵是一种典型的微生物发酵过程，主要利用谷氨酸棒杆菌在适宜的培养基和条件下，将糖类物质转化为谷氨酸。
发酵过程中，还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量发酵是否正常的重要指标。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 谷氨酸棒杆菌菌种- 葡萄糖- 酵母提取物- 牛肉膏- 磷酸氢二钠- 氯化钠- 琼脂- pH试纸- 还原糖检测试剂盒- 谷氨酸检测试剂盒- 恒温摇床- 恒温水浴锅- 721分光光度计2. 实验仪器：- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 试管- 离心机- 电子天平四、实验步骤1. 培养基制备：- 称取酵母提取物10g、牛肉膏5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钠2g、氯化钠1g，加入100mL蒸馏水溶解，定容至1000mL。
- 将培养基分装至锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟。
2. 菌种活化：- 将谷氨酸棒杆菌菌种接种于装有适量培养基的锥形瓶中，37℃恒温培养24小时。
3. 发酵实验：- 将活化后的菌液以1%的接种量接种于装有100mL培养基的锥形瓶中，置于恒温摇床中，37℃、150r/min振荡培养。
- 每隔2小时取样，测定还原糖和谷氨酸的含量。
4. 数据处理：- 根据还原糖和谷氨酸的测定结果，绘制糖耗曲线和谷氨酸生成曲线。
- 分析发酵条件对谷氨酸发酵的影响。
五、实验结果与分析1. 糖耗曲线：实验过程中，还原糖含量随时间逐渐降低，说明谷氨酸棒杆菌在发酵过程中不断消耗葡萄糖。
2. 谷氨酸生成曲线：实验过程中，谷氨酸含量随时间逐渐增加，说明谷氨酸棒杆菌在发酵过程中不断合成谷氨酸。
3. 发酵条件对谷氨酸发酵的影响：- 温度：37℃时，谷氨酸发酵效果较好。
- pH值：pH值在6.5-7.0时，谷氨酸发酵效果较好。
发酵工程实验的实验报告
一、实验目的1. 了解发酵工程的基本原理和操作方法。
2. 掌握发酵过程中菌种培养、培养基配制、发酵条件控制等基本技能。
3. 熟悉发酵过程中产物生成的监测方法。
二、实验原理发酵工程是指利用微生物的代谢活动，将生物质资源转化为人类所需产品的一门综合性工程技术。
本实验以谷氨酸棒杆菌为研究对象，通过摇瓶发酵的方式，探究其在适宜条件下对葡萄糖的转化率及谷氨酸的生成情况。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：摇床、锥形瓶（250ml）、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平、发酵培养基、葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠等。
2. 试剂：葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠等。
四、实验步骤1. 培养基配制：按照实验要求，称取葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠等试剂，加入适量的去离子水，充分溶解后，调节pH至7.0，定容至1000ml。
2. 菌种活化：从菌种保藏管中取出谷氨酸棒杆菌，接种于装有适量培养基的锥形瓶中，置于摇床上，37℃恒温培养24小时。
3. 接种：将活化后的菌种以1%的接种量接种于新鲜培养基中，置于摇床上，37℃恒温培养。
4. 发酵过程监测：每隔2小时取样，测定还原糖含量、谷氨酸含量、pH值等指标。
5. 数据处理与分析：将实验数据绘制成曲线，分析发酵过程中还原糖消耗、谷氨酸生成、pH值变化等规律。
五、实验结果与分析1. 还原糖消耗曲线：在发酵过程中，还原糖含量逐渐降低，表明谷氨酸棒杆菌在消耗葡萄糖的同时，产生谷氨酸。
2. 谷氨酸生成曲线：在发酵过程中，谷氨酸含量逐渐升高，表明谷氨酸棒杆菌在适宜条件下能够高效地将葡萄糖转化为谷氨酸。
3. pH值变化曲线：在发酵过程中，pH值逐渐下降，表明谷氨酸棒杆菌在代谢过程中产生酸性物质。
六、实验结论1. 本实验成功实现了谷氨酸棒杆菌的摇瓶发酵，为谷氨酸生产提供了实验依据。
谷氨酸发酵生产
谷氨酸发酵生产谷氨酸发酵一、实验目的谷氨酸(glutamic acid)是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸。
谷氨酸发酵是典型的代谢调控发酵，其代谢途径相对研究得比较清楚。
因此，了解谷氨酸发酵机制，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其他有氧发酵的理解和掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。
通过本次实验，掌握有氧发酵的一般工艺，熟练掌握通用机械搅拌罐的设备使用。
二、实验原理1、谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵是菌体异常代谢的产物，菌体正常代谢失调时，才能积累谷氨酸。
在正常的微生物代谢中，由葡萄糖生成的磷酸烯醇式丙酮酸比天冬氨酸优先合成谷氨酸。
谷氨酸合成过量时，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬酸合成酶的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。
天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。
所以，在正常情况下，谷氨酸并不积累。
谷氨酸生产菌由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图5-7。
它包括糖酵解途径(EMP途径)、磷酸己糖途径(HMP途径)，三羧酸循环(TCA循环)、乙醛酸循环，伍德-沃克曼反应(CO的固定反应等)。
2由于谷氨酸生产菌生理方面有以下共同特征，体内的代谢控制平衡被打破，使谷氨酸得以积累。
? 谷氨酸生产菌大多为生物素缺陷型。
谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP及HMP两个途径进行。
生物素充足时，HMP途径所占比例是38%，控制生物素亚适量的结果，发酵产酸期，HMP途径所占比例下降到约为26%，EMP途径所占的比例得以提高。
通过控制生物素亚适量，更重要的是由生物素促进的脂肪酸及磷脂合成减少，谷氨酸向膜外漏出，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。
? 谷氨酸生产菌的CO固定反应酶系活力强，可通过羧化作用(更多地2供应固定CO生成苹果酸或草酰乙酸转化成柠檬酸。
2? 谷氨酸生产菌的异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，使进入谷氨酸生成期后的乙醛酸循环弱，使异柠檬酸更多地转化成α-酮戊二酸。
谷氨酸发酵工艺流程及谷氨酸的提取操作流程
谷氨酸发酵、提取，精制工艺
（一）发酵及提取工艺流程
菌种（石河子大学菌种）
斜面
摇瓶种发酵罐（SY-3015）发酵液
GQ-75分离机离心（15000rpm ） （去菌体）发酵液
结晶（中和）罐，酸罐，
(离子交换 高流分
（二）谷氨酸的等电点-离子交换提取谷氨酸工艺
（三）谷氨酸钠的精制操作
1、中和
工艺条件：湿谷氨酸：水：(固体)纯碱=1：2：（0.3-0.34）
T=60℃，pH=6.4（用试纸测）
注意：60℃下，搅拌下，徐徐加入固体纯碱中和，至pH 6.4 ,搅拌至澄清。
2、谷氨酸钠喷雾干燥
工艺流程：中和完的澄清液，用SY-6000小型喷雾干燥仪干燥并收集；
工艺条件：
进风170℃，出风温度65-75℃，进料量控制40%（即500ml/h），空气流量600l/h （四）谷氨酸产生菌发酵代谢曲线示例。
第五章微生物与发酵工程测试题附答案
A．衰亡期和调整期B．调整期和稳定期C．对数期和衰亡期D．稳定期和对数期
29.下列关于固氮菌的叙述，错误．．的是 （）
A．一种根瘤菌能侵入所有种类的豆科植物B．豆科植物与其根瘤内的根瘤菌互利共生C．土壤中的根瘤菌不能固氮
D．具有根瘤的豆科植物能以氮气为氮源
30、酵母菌发酵产生CO2的摩尔数为N，在安静情况下，人消耗同样数量的葡萄糖可以产生的CO2量是()A、1/3NmolB、3NmolC、6NmolD、12Nmol31在以下描述中，可以将病毒与 其他微生物相区别的是()A.能够使人或动、植物患病B.没有细胞核，仅有核酸
第五章微生物与发酵工程测试题附答案
班级姓名得分
一、选择题（每题1.5分，共60分）
1.细菌的遗传物质位于()
A．核区和线粒体中；B．核区中；C．核区、质粒和线粒体中；D．核区和质粒中。
2.下列有关细菌繁殖的叙述，正确的是（）
A.细菌通过有丝分裂进行分裂生殖
B.分裂生殖时DNA随机分配C.分裂生殖时细胞质平均分配
26.谷氨酸棒状杆菌异化作用方式是需氧型，它的有氧呼吸的酶
主要存在于()Ａ．线粒体Ｂ．核糖体Ｃ．细胞膜Ｄ．内质
网27.在生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是（）A．稳定期B．调整期C．对数期D．衰亡期
28.将少量的某种细菌接种到恒定容积的液体培养基中，并置于
适宜的条件下培养，定期统计细菌的数目。如果以时间为横坐标， 以细菌数目的对数为纵坐标作图，可以得到细菌的生长曲线。曲线中，细菌数量变化较大的时期为
建工程菌
23.能影响发酵过程中温度变化的因素是()Ａ．微生物分解有机物释放的能量Ｂ．机械搅拌 Ｃ．发酵罐散热及水分蒸发Ｄ．A、B、C选项都对
谷氨酸发酵实验报告
谷氨酸发酵实验报告谷氨酸发酵实验报告篇一：实验二离子交换法提取谷氨酸实验二离子交换法提取谷氨酸一、实验目的掌握离子交换装置的结构和使用方法。
掌握离子交换法提取谷氨酸的工艺流程。
掌握等电点沉淀法提取谷氨酸。
了解认识离子交换树脂的处理和再生。
二、实验原理谷氨酸是两性电解质，是一种酸性氨基酸，等电点为，当pH＞时，羧基离解而带负电荷，能被阴离子交换树脂交换吸附；当pH＜时，氨基离解带正电荷，能被阳离子交换树脂交换吸附。
也就是说，谷氨酸可被阴离子交换树脂吸附也可以被阳离子交换树脂吸附。
由于谷氨酸是酸性氨基酸，被阴离子交换树脂的吸附能力强而被阳离子交换树脂的吸附能力弱，因此可选用弱碱性阴离子交换树脂或强酸性阳离子交换树脂来吸附氨基酸。
但是由于弱碱性阴离子交换树脂的机械强度和稳定性都比强酸性阳离子交换树脂差，价格又较贵，因此就都选强酸性阳离子交换树脂而不选用弱碱性阴离子交换树脂。
目前各味精厂均采用732#强酸性阳离子交换树脂，本实验就是采用732#树脂。
谷氨酸溶液中既含有谷氨酸也含有其他如蛋白质、残糖、色素等妨碍谷氨酸结晶的杂质存在，通过控制合适的交换条件，在根据树脂对谷氨酸以及对杂质吸附能力的差异，选择合适的洗脱剂和控制合适的洗脱条件，使谷氨酸和其他杂质分离，以达到浓缩提纯谷氨酸的目的。
三、实验装置1、离子交换装置本实验采用动态法固定床的单床式离子交换装置。
离子交换柱是有机玻璃柱，柱底用玻璃珠及玻璃碎片装填，以防树脂漏出。
2、树脂本实验用苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，编号为732#，其性能如下表：732#树脂的主要性能常数3、树脂的处理对市售干树脂，先经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加3倍量的2mol/L HCL溶液，在水浴中不断搅拌加热到80℃，30min后自水溶液中取出，倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用2mol/L NaOH溶液，同上洗树脂30min后，用蒸馏水洗至中性，这样用酸碱反复轮洗，直到溶液无黄色为止。
发酵工程 选择题(解答版)
单项选择题1.控制细菌的抗药性、固氮、抗生素生成等性状的基因位于C. 质粒2.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是A. 菌落3.要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用C. 固体培养基4.发酵工业常以培养微生物为主，所以又成为B. 微生物工程5.下列微生物的产物中没有菌种特异性的一组是B. 核苷酸、维生素、多糖、脂类、氨基酸6.可用于观察细菌运动的培养基是B. 半固体培养基7.下列说法正确的是D. 发酵生产中，按照用途可将培养基分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基8.下列与微生物的代谢活动异常旺盛无关的原因是D. 数量多9发酵罐发酵的过程中，使温度升高的热量来源于：D. ②④①冷水供应不足②微生物代谢旺盛③培养基不新鲜④搅拌⑤放料口排出产物10.研究微生物的生长是以群体为单位的，这项研究不包括D. 个体的体积增大11.在微生物生长的过程中，细胞形态最多和数目最多的时期是A. 衰亡期、稳定期12. 根据发酵参数的性质特点，下列属于物理参数的是C. 温度、泡沫水平、搅拌转速、空气流量、培养液体积、黏度和液位等13.环境中氧含量的状况，对不同代谢类型的微生物群体的生长具有不同的影响，下列菌中无明显影响的是A. 酵母菌14微生物群体生长状况的测定方法可以是：B. ①④①测定样品的细胞数目②测定次级代谢产物的总含量③测定培养基中细菌的体积④测定样品的细胞重量15 下列有关谷氨酸棒状杆菌的生长和谷氨酸发酵的叙述，错误的是B. 菌体能合成各种生长因子，不需要从外界补充16 在细菌培养中，所制备的斜面培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的B. 2/317 根据产物形成与底物利用之间的关系，可将发酵类型分为A. 生长关联型、部分生长关联型和非生长关联型18 在实际生产中，对数期的长短取决于：A. ②③①培养罐的大小②接种量的大小③培养基的多少④代谢产物合成的多少19发酵是利用微生物生产有用代谢产物的一种生产方式,通常说的乳酸发酵属于C.液体发酵20圆褐固氮菌可利用的氮源是B. 分子氮21 多数真菌的最适pH出为A. 5．0～6．022机械搅拌通风发酵罐主要部件包括罐身、搅拌器、挡板、冷却装置、空气分布装置等，在罐体表面往往装有各种装置，如为了便于清洗、安装和维修的C. 快开手孔或入孔23 关于放线菌叙述不正确的是A. 属于多细胞原核生物24 常用的酸味添加剂是B. 柠檬酸25 单细胞蛋白是通过下列何种方法获得的C. 发酵工程26 泡沫体系的三阶段变化中，以下说法错误的是D. 泡沫液膜变厚27生物素含量较多的是A. 牛乳28通风搅拌发酵罐与通风式发酵罐相比，下列不属于前者特点的是A. 发酵罐内的搅拌装置作用与通风装置是一样的29 能为发酵工程提供菌种的是B. 目的基因转移30 硝酸盐、铵盐、铵等无机氮作为氮源在被微生物利用的同时，会造成发酵液酸碱度度的变化，随着氮源的消耗培养基的pH值上升的盐成为生理碱性盐，反之成为生理酸性盐，以下氮源为生理酸性盐的是：C. (NH4)2SO431下列说法正确的是D. 发酵生产中，按照用途可将培养基分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基32用大肠杆菌生产胰岛素需应用的生物工程的组合是：B. ①③④①基因工程②细胞工程③发酵工程④酶工程33 有关酶的固定化的叙述中正确的是C. 分离后的酶包埋在明胶中34构成流感病毒的结构是 D. 囊膜、衣壳、核酸35下列哪条不是连续灭菌的优点A. 容易提高灭菌温度，易实现高温短时灭菌法，因而可减少培养基中营养物质损失，提高产物收率36以下不属于发酵工程范畴的是B. 缺氧时人的某些组织细胞产生乳酸37微生物的生长包括四个时期，其中微生物的增长接近于“J”型增长的是B. 对数期38在细菌的群体生长曲线中，产生初级代谢产物和次级代谢产物的最佳时期分别是B. 调整期、稳定期39发酵罐发酵的过程中，使温度升高的热量来源于：D. ②④①冷水供应不足②微生物代谢旺盛③培养基不新鲜④搅拌⑤放料口排出产物40有关谷氨酸发酵的叙述中正确的是B. 培养条件不当将不能得到产品41下列哪种物质不是常用的过滤介质A. 木质纤维素42 在深层好氧发酵过程中要求通入无菌空气以保证发酵液中的溶氧量，下面关于空气过滤除菌正确的说法是B. 在空气除菌过程中，一般采用几十米高的高空取气管取气，因为每升高10米，空气中微生物的数量可以降低一个数量级43下列属于发酵工程的内容依次是：D. ④⑨⑥⑦②⑩①提取目的基因②发酵过程③动物细胞融合④菌种的选育⑤固定化 ⑥灭 菌⑦扩大培养⑧植物组织培养⑨培养基配制⑩分离提纯44随着生物技术的快速发展，发酵工程也得到了快速发展，广义的发酵工程包括A. 上游工程、发酵工程和下游工程45以下不属于发酵工程范畴的是B. 缺氧时人的某些组织细胞产生乳酸46下列哪些是发酵的主要操作方式D. 全部都是47 下列有关谷氨酸棒状杆菌的生长和谷氨酸发酵的叙述，错误的是B. 菌体能合成各种生长因子，不需要从外界补充48( )是生物技术产业化，发展大规模生产的最关键环节。
微生物发酵技术考试模拟题(附答案)
微生物发酵技术考试模拟题（附答案）一、单选题（共40题，每题1分，共40分）1、接种龄以处于生命力旺盛的（）的菌体最合适。
A、迟缓期B、衰退期C、对数生长期D、稳定期正确答案：C2、目前发酵工业常用的处理菌体、固形物杂质和悬浮物等固体物质，保证处理液澄清的主要方法为（）A、蒸馏和萃取B、离心和萃取C、离子交换和过滤D、离心和过滤正确答案：D3、下面不属于抗生素的是（）。
A、链霉素B、溶菌酶C、红霉素D、从植物蒜中制得的蒜素正确答案：B4、在等电点时氨基酸的溶解度（）A、不变B、不一定，有的氨基酸大，有的氨基酸小C、最大D、最小正确答案：D5、萃取后分离时采用的设备是（）A、筛分设备B、过滤设备C、萃取设备D、离心设备正确答案：D6、生产四环素的菌种是( )A、白色链霉菌B、金色链霉菌C、灰色链霉素D、绿色链霉菌正确答案：B7、酶活性调节速度比酶合成调节速度（）A、相等B、无法比较C、慢D、快正确答案：D8、常用的生理酸性物质（）不仅可以调节发酵液pH值，还可以补充氮源。
A、硫酸铵B、NaOHC、尿素D、氨水正确答案：A9、（）空气除菌流程具有对热的利用合理，热交换罐可兼作贮气罐的特点。
A、高效前置空气过滤除菌流程B、将空气冷却至露点以上的空气除菌流程C、冷热空气直接混合式空气除菌流程D、利用热空气加热冷空气的空气除菌流程正确答案：D10、种子罐培养时，一级种子罐又叫做（）A、育种罐B、繁殖罐C、生产罐D、发芽罐正确答案：D11、（）抗生素能够抑制或干扰细胞壁合成A、四环素类B、青霉素类C、多肽类D、氨基糖苷类正确答案：B12、青霉素是谁发现的（）A、弗莱明B、郭霍C、巴斯德D、列文虎克正确答案：A13、管碟法测抗生素效价时，培养基厚度越薄，量-反应直线截距减小，抑菌圈（）A、不定B、一样C、越大D、越小正确答案：C14、发酵过程中，出现了污染，工人们进行了如下处理：a. 严控发酵液流失；b.彻底清理生产环境；c.停产一段时间；d.调换生产菌种。
谷氨酸系列发酵实验
谷氨酸发酵工程系列实验一、实验目的1、了解发酵工业菌种的制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。
2、了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程操作、3、了解和掌握快速测定还原糖含量的方法。
4、了解和掌握快速测定发酵过程谷氨酸含量的方法5、了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法二、实验原理谷氨酸是由谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为原料生产的一种呈味氨基酸，其代谢机理为：葡萄糖先经EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸经氧化脱氨基作用生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环生成α—酮戊二酸，α—酮戊二酸再经氨基化作用生成谷氨酸。
由于谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型突变株，因此在发酵过程中要控制生物素亚适量。
三、实验材料、仪器与试剂1、材料：谷氨酸棒杆菌、发酵培养基、谷氨酸发酵液不同发酵时间所取的样品等。
2、仪器：三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、天平、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、显微镜、发酵罐及控制系统、蒸汽发生器、空气压缩机、补料瓶、补料针、硅胶管、滴定管、滴定架、电炉、容量瓶、高速离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液器及枪头、无极调速搅拌机、旋转蒸发器、冰箱等3、试剂：无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取液、NaCl、NaOH、HCl、KNO3、去离子水、葡萄糖、尿素、消泡剂、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氢化钾、盐酸、L-谷氨酸分析纯、茚三酮、丙酮、酒精等。
四、实验步骤1、培养基的制备（1）斜面培养基：葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCl0.5%；琼脂2%（pH7.0）（2）一级培养基：蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCl1%（pH7.2）（3）二级培养基：葡萄糖 2.5%；尿素0.34%；K2HPO4·3H2O0.16%；MgSO4·7H2O；FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各0.0002%（pH7.0）各培养基分装到到三角瓶，用铝箔纸封口，高压灭菌。
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点。
制药微生物发酵技术
引入（任务项目）
谷氨酸的产量发酵分析是通过？曲线
• 3.培养基和试剂 5mol/L NaOH溶液、泡敌、保藏培 养基、活化培养基、种子培养基、发酵培养基
训练项目1
制药微生物发酵技术
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
二、内容
• 1.菌种活化 取保藏斜面菌种划线接种于活化斜面，32℃培 养24h。
• 2.种子培养 接一环生长良好的的活化斜面种子至装有 30mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，32℃ 、100rpm的恒温摇床上培养至对数生长中后期。
训练项目2
2 噬菌体的分离检查
制药微生物发酵技术
• 认识噬菌体，学习并掌握噬菌体的分离技 术。
训练项目2
2 噬菌体的分离检查
制药微生物发酵技术
• 噬菌体的存在，往往给发酵生产带来危害，但从分子遗传学研究 方面,噬菌体确是一个很好的工具。因此认识和掌握噬菌体的习 性，使之造福于人类是十分重要的。
• 噬菌体在自然界的广泛分布，往往造成微生物发酵工业的严重损 失与困难。如果生产菌株被一个噬菌体侵染，那么它会很快地在 菌体内得到增殖，并迅速裂解释放出100个左右的子代噬菌体， 其后果是严重的。因此，充分了解噬菌体的特性，对于防止生产 中的噬菌体污染具有一定的实际意义。
制药微生物发酵技术
制药微生物发酵技术----课件
项目1
项目2
项目3
项目4
项目5
制药微生物发酵技术
1-3谷氨酸发酵工艺过程控制
1 谷氨酸发酵的代谢曲线测定 2 噬菌体的分离检查
制药微生物发酵技术
告知：
① 掌握灭菌与空气的净化知识。
② 掌握发酵工艺过程控制知识。
③ 掌握发酵生产染菌及其防治知识。
④ 掌握发酵罐及其相关设备操作维护知识
• 亦可用葡萄糖试剂盒测定残糖，纸层析法测定谷氨酸产 量。
训练项目1
制药微生物发酵技术
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
一、材料和器材
• 1.菌种 黄色短杆菌
• 2.器材 恒温摇床、培养箱、5L发酵罐、SBA-40C多 功能葡萄糖-谷氨酸分析仪、分光光度计、250mL三角 瓶、吸管（10mL、1mL）、洗瓶、吸水纸、接种环、 显微镜、载玻片、盖玻片
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
• 发酵生产过程中要随时观察菌体生长情况。从培养液外 观变化和镜检两方面着手，及时发现并处理染菌事故； 定时取样检测相应的参数，尤其是菌浓、残糖及产物产 量，反馈调节发酵罐控制条件，如搅拌转数、碱液、消 泡剂流加速度等。
训练项目1
制药微生物发酵技术
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
• 3．噬菌体的分离 融化固体、半固体培养基，先倒底层 固体培养基平板，凝固后，分别取上述三个浓度的稀释 液0.5毫升于底层培养基上，然后在融化后并冷却至50℃ 的半固体培养基中加入5毫升黄色短杆菌菌液，摇匀，倾 注于上述平板上，与其中的噬菌体增殖液混匀放置。待 凝固后于32℃保温箱中培养24小时。
• 3.发酵培养 种子液镜检无杂菌。加大发酵罐的通气量，以 10％接种量接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐中。
训练项目1
制药微生物发酵技术
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
• 接种完毕，5L发酵罐各项参数设置如下：通气量3L/min， 转速250rpm，温度32℃，pH值7.0，培养30～40h。发 酵期间，流加尿素以补充氮源，每隔4h取样测定 OD620nm值（将发酵液稀释20倍后，用分光光度计于吸 光度620nm处测定）、谷氨酸产量和残糖量。
训练项目2
制药微生物发酵技术
2 噬菌体的分离检查
实训材料
• 1．样品 味精厂土样，黄色短杆菌。
• 2．培养基 肉汤固体培养基，肉汤半固体培养基
• 3．器皿 平皿，试管，三角瓶等。
训练项目2
2 噬菌体的分离检查
制药微生物发酵技术
实训步骤
• 1．噬菌体的繁殖
• (1)首先将黄色短杆菌接入装有20毫升肉汤培养基的三 角瓶中，32℃培养12小时，使细胞生长至对数中期，
训练项目2
2 噬菌体的分离检查
制药微生物发酵技术
• 4．噬菌体的选择 观察平板中噬菌斑的形成，用接种针 在噬菌斑中刺几下，接入有肉汤培养液的试管中，适当 稀释，再次以上述双层平板法分离。如此反复进行大约5 次，就可得到形态大小基本一致的噬菌斑。该噬菌斑便 可作为一个噬菌体的纯株应用。
制药微生物发酵技术
操练
提出生长曲线概念→提出代谢曲线的概念→曲线的绘制
训练项目1
制药微生物发酵技术
1
谷氨酸发酵的代谢曲线测定
一、项目指导
• 由于发酵的目的不同，发酵培养基与种子培养基有所不同。 • 发酵工业的生产流程一般是：保藏斜面→活化斜面→摇瓶种
子→种子罐→发酵罐，小型实验可以略去种子罐一步。 • 发酵罐的条件控制优于摇瓶，产物产量更高。
• (2)加入土样1克、碳酸钙0.3克摇匀继续培养24小时， 培养液经4000转/分离心10分钟，取上清液至无菌瓶 中，作为第一次噬菌体增殖液。
训练项目2
制药微生物发酵技术
2 噬菌体的分离检查
• 2．噬菌体增殖液的稀释 离心第二次增殖液，取上清液 用肉汤液体培养基以10倍稀释法适当稀释，取目1
制药微生物发酵技术
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谷氨酸发酵的代谢曲线测定
通用式发酵罐
制药微生物发酵技术
训练项目1
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谷氨酸发酵的代谢曲线测定
通 用 式 发 酵 罐
制药微生物发酵技术
训练项目1
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谷氨酸发酵的代谢曲线测定
小型发酵罐
制药微生物发酵技术
训练项目1
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谷氨酸发酵的代谢曲线测定
5 L 发 酵 罐
训练项目1
制药微生物发酵技术
分批发酵条件下，黄色短杆菌TK0303的菌体形态变化
5L罐延迟期 （4h）
5L罐对数期 （32h）
5L罐稳定期 （48h）
5L罐衰亡期 （68h）
摇瓶衰亡期 （72h）
训练项目1
制药微生物发酵技术
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谷氨酸发酵的代谢曲线测定
• 菌浓的测定方法有分光光度计法和干重法，生产中一般 采用前者。
• 残糖及谷氨酸产量一般采用SBA-40C多功能葡萄糖-谷 氨酸分析仪测定。