食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察

微生物学大实验

食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察

（标题小四黑体，正文小四宋体，段前、段后0，行距20磅）

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0 前言

食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。

本次实验以略微腐烂的苹果、栗子、香蕉，饮料为材料，运用三区划线、倾注、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。

1 试验材料和仪器设备

1．1试验材料

食材：土豆、苹果、栗子、香蕉、饮料。

试剂：营养琼脂粉、麦芽粉、琼脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚兰溶液、草酸结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、生理盐水、0.1%吕氏碱性美蓝染液、自来水等。

1．2仪器设备

试验仪器：显微镜、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、试管、酒精灯、接种针（环）、针、培养皿、盖玻片、载玻片、三角玻璃涂布棒等。

2 试验方法

2.1培养基的制备

2.1.1营养琼脂培养基

称取4.5克营养琼脂粉，加入100ml水加热溶解，分装，在121℃下蒸汽灭菌。20min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。

2.1.2土豆培养基

将去皮土豆200g切成2cm左右小块加入1000ml水煮沸10min，过滤补充水份，加入20g琼脂粉，20g葡萄糖，加热溶化，分装，121℃下蒸汽灭菌20min。

2.1.3麦芽汁培养基

称取5g麦芽粉加入100ml和2g琼脂，在115℃下蒸汽灭菌20min。

2.1.4糖发酵培养基的制备

2.1.4.1葡萄糖发酵管

取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均匀即可.

2.1.4.2葡萄糖发酵管

取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.

2.1.4.3麦芽糖发酵管

取0.25g麦芽糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.

2.1.4.4蔗糖发酵管

取0.25g蔗糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可

2.1.4.5甘露醇发酵管

取0.25g甘露醇加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可

注:糖溶液: 蛋白胨2g,0,04%溴甲酚紫水溶液2.5ml,蒸馏水100ml,调pH为7.4 分别吸取上述五种糖溶液5ml放在试管中,并放入一个小倒管.每种取两支试管.在培养箱中供糖发酵试验使用.

2．2 分离方法

2．2．1三区划线法

使用接种环，将其烧灼，待冷却后，取菌。然后在酒精灯附近，将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/3-1/2，此为第一区。再将接种环上多余的细菌烧灼，待冷后，在第一区划线末端，再划下一区域，面积约占1/4面积，此为第二区。用同样方法划第三区，划满整个平皿。

2．2．2点植法

使用接种针，将其烧灼，然后在培养皿上点一下以降温，取菌。然后在酒精灯附近，将已沾菌的接种针在培养皿中点上一点。用相同的方法在培养基上点第二个点，直至培养基上呈现均匀的六个点。

2．2．3涂布法

使用三角玻璃涂布棒，在蒸汽灭菌锅内灭菌，待冷却后，取菌，然后将菌均匀的涂在培养皿上。

2．3 培养

2．3．1细菌

在37±1℃恒温培养箱中培养24小时。

2．3．2酵母菌

在28℃恒温培养基中培养48小时。

2．3．3霉菌

在28℃恒温培养基中培养48小时。

2．4 鉴定

2．4.1形态鉴定

①.细菌：做革兰氏染色试验。

a.涂片将培养的不同菌分别做涂片，干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即

可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

b.染色初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出

酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。

复染用番红液染1～2min，水洗。

镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

②.酵母菌：

a.在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液，按无菌操作法在营养琼脂培

养基上取培养48小时的菌种少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。

b.盖玻片，放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察菌体形

态和出芽情况，同时根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

③.霉菌：制片观察，霉菌的组织状态及孢子形状。在载玻片中央滴加一滴乳酸

酚用针挑取菌落周边放在乳酸酚中搅拌均匀,盖上薄片至于显微镜观

察.

2.4.2生理鉴定

细菌：糖发酵试验。

用接种环在酒精灯上经灭菌后分别接种在五种糖溶液的试管中,在37±1℃恒温培养箱中培养24小时后观察其产酸产气情况

3 结果与讨论

3.1细菌

3.1.1菌落的形态：

培养结果：如下图是香蕉培养菌落(图一)和栗子培养菌落(图二)

图一(涂布法) 图二(点植法)

结果分析: 香蕉中分离的菌落为微小较为规则的圆形，颜色为近似乳白色。在37

±1℃恒温培养箱中培养24h后可嗅到一种特殊的臭味。说明该细菌在温暖，富含有机物质的培养基中能够正常的旺盛的生长。

栗子中分离的菌落为不规则椭圆形，颜色为乳白色和少许黄色两种,一部分表面干瘪无光泽且多褶皱,为菌落变老,中心隆起较高呈突脐状，直径在0.8-1.0cm之间。该菌在土豆琼脂培养基中繁殖旺盛,有嗜糖的特性,而且该菌落特征符合细菌菌落特征,因此初步判定该菌种为细菌。

3.1.2不同菌落革兰氏染色的结果

1）栗子中菌落革兰氏染色结果在显微镜下的观察结果如下图（图三）：

图三

结果分析：在显微镜（油镜）下可清楚观察到该细菌经革兰氏染色后呈现红色，为革兰氏阴性菌，且菌体均无芽孢，成短杆状，所以为革兰氏阴性无芽孢杆菌。

2)香蕉中菌落经革兰氏染色后在显微镜下的观察结果如下图（图四）：