TRIZOL法提取总RNA
【精选】Trizol法提取细菌总RNA
实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。
无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
二、主要试剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水超净工作台 2.0 mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体；2、每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡15 s，室温静置5 min 4℃，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。
）4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃，12000 g，离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；5、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；小心吸去上清；6、加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4℃，7500 g，离心 5 min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；7、各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)；（二）. RNA 浓度的测定取10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizoｌ法使用步骤一、分离纯化得基本原理研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。
ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。
Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。
二、用户需自备得试剂与材料无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)三、准备工作RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。
它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。
用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。
它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。
RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。
取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。
1、料制品得处理尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下:1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。
注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。
2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。
3)在通风柜中室温处理过夜。
4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻与金属物品250°C烘烤3小时以上。
Trizol法提取总RNA Protocol
Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。
然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。
最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。
所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。
2.氯仿：用于抽提RNA。
3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。
4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。
6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。
实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。
2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。
3.移液器：用于吸取试剂和样品。
4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。
5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。
准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。
2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。
3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。
实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。
2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。
3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。
4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。
5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。
注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA
TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA简介TRIzol是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA试剂，可以从动物组织，真核细胞等中提取总RNA。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA。
加入氯仿离心后，溶液会形成上清层，中间层和有机层，RNA 分布在上清层中，收集上清层经异丙醇沉淀后便可以回收得到总RNA。
材料（1）试剂：RIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、PBS 缓冲液等。
（2）器材：RNase Free EP管、冷冻离心机、组织匀浆器等。
实验步骤1、样品处理（1）细胞：收集细胞沉淀，加入1ml TRIzol吹打混匀。
（2）组织样品：取一小块样品于1.5ml离心管中，剪碎，加入TRIzol后匀浆器匀浆。
2、抽提RNA（1）室温孵育5min，加入200ul氯仿/1ml TRIzol，震荡混匀，室温静置3min。
（2）（提前预冷离心机）4°C ，12000×g离心15 min，离心后液体分为三层，小心吸取上层水相至新的EP管。
RNA在上层水相，中间层为DNA，下层为蛋白质。
吸上清时，不可吸到中间层，宁可少吸也不能多吸。
（3）加入500ul异丙醇/1ml TRIzol，上下颠倒混匀，冰上孵育10min。
（4）4°C ，12000×g离心10 min，弃上清。
（5）加入1ml 75%乙醇轻柔洗涤沉淀，短暂涡旋使沉淀漂起。
（6）4°C ，7500×g离心5 min，吸弃上清，静置干燥沉淀。
沉淀不能过干或过湿，待沉淀会变为半透明色即可。
（7）视沉淀量加入适量DEPC水溶解，轻轻吹打，-80°C长期保存。
3、总RNA 纯度、浓度和完整性检测（1）One Drop检测RNA纯度和浓度：纯净RNA的A260/A280的比值为2.0，小于1.9说明存在有机物污染，大于2.1则说明RNA发生了降解。
Trizol试剂法
细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体
RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂 解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等 杂质，最终获得高纯RNA产物的过程。
• RNA 提取的关键是防止RNA酶对RNA的降解作用.RNA提 取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取 RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品， 提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA 降解。 • Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总NA的试剂。它 在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释 放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心， 样品分成水样层和有机层。
• 三、RNA沉淀
• 6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静 置10分钟。
• 7.离心12000rpm 10分钟4°C。
• 8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注 意避免吸弃RNA沉淀。
• 四、RNA清洗
• 离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清 洗DNA),振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温7500g离 心5分钟。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以 上清洗步骤一次。室温静置5－15分，使RNA沉淀干燥， 加入适量 DEPC水溶解。 • RNA在4℃至少保存1周，－20℃至少保存1年
• Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍是 一类强力的蛋白质变性剂，可以抑制RNA酶,可溶解蛋白质，细胞 结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。促使核蛋白体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。 • 当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，加速有机相和水相的分层。 而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层， 这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无 色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。上层水 相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在 酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。
动植物总RNA提取-Trizol法
动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol的主要成分是酚。
主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
x0.1%的8－羟基喹啉的，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制x异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
Trizol法提取蚯蚓组织总RNA
高速离心机
电泳槽
实验过程：
RNA提取
1．蚯蚓先用自来水洗，称重，用灭菌的DEPC水洗涤。
2．将蚯蚓放入研钵中，加入Trizol（0.1mg蚯蚓加1mLtrizol），倒入液氨，使液氮浸没蚯蚓，用研锤研磨蚯蚓成粉末状（注意：此过程需要重复加几次液氮，再研磨）。研磨好后，室温放置，待研钵内固体变成液体后，进行下一步。
Trizol法提取蚯蚓组织总RNA(自己整理)
实验材料：
1 mL tip头：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
200μLtip头：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
10μLtip头：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
1.5 mL和200μL离心管：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
RNA表征（琼脂糖凝胶电泳）
1.配胶：
1%琼脂糖胶配制：称取0.2g琼脂，加25 mL1×TAE或者1×TBE，电热套或微波炉加热溶解，冷却至不烫手的情况下加入10μLEB，摇匀。
2.将配好的胶倒入电泳槽，待其冷却固化后，轻轻地抽出梳子。
3.拿出一支新的塑料一次性手套，平放在试验台上，将3μLLoading buffer滴在手套上，再将6μLRNA溶液滴到loading buffer上，将此混合溶液加入到凝胶孔（也就是梳子拔出后，在凝胶上留的孔）里，DNA marker直接加到凝胶孔里（marker要放在最边上的孔里）。
7．12000转速离心15分钟。倒掉上清液。
8．向离心管中加入75%乙醇（洗涤RNA，此时RNA还是沉淀）1mL，轻轻摇动后，立刻12000转速离心。
9．倒掉上清液，将离心管盖子打开，轻轻的倒放在干净的滤纸上2min，使管内的液体流出，RNA固体留于离心管底部。
总RNA提取
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
8.TRIZOL百科名片TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol 在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。
主要成分TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
TRIZOL法提取总RNA
目录
• 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 实验优化和常见问题处理
01
实验原理
Trizol的组成和作用
Trizol是一种常用的细胞裂解液，主要由苯酚、异硫氰酸胍和苯酚等成分 组成。
苯酚的作用是使蛋白质变性并释放核酸，异硫氰酸胍的作用是抑制DNA 酶活性，防止DNA降解，同时能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ效地变性蛋白质，使RNA充分释放。
RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳
将RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察28S和18S rRNA条带的亮度及完整性， 判断RNA的质量。
生物信息学分析
将RNA测序数据与基因组数据进行比对，分析转录本的拼接情况，评估RNA的 完整性。
反转录和PCR验证
反转录
将RNA反转录成cDNA，以便进行后 续的PCR验证。
效果。
去除DNA和蛋白质
在提取RNA的过程中，需要去除DNA 和蛋白质等杂质，以避免对后续实验 的干扰。
在去除杂质的过程中，需要注意控制 好离心时间和转速，以保证去除效果。
Trizol法中，DNA和蛋白质可以通过 离心和洗涤的方法去除。在离心后， 上清液中的DNA和蛋白质可以被去除， 而RNA则留在沉淀中。
在使用Trizol法时，通常采用玻璃匀浆器或匀浆机进行匀浆破碎。
抽提RNA
抽提RNA的目的是将RNA从细 胞碎片和其他杂质中分离出来。
Trizol法是一种常用的RNA抽提 试剂，它能够有效地分离出
RNA，同时抑制DNA和蛋白质 的降解。
在抽提过程中，需要按照试剂说 明书进行操作，注意控制好细胞 碎片的浓度和体积，以保证抽提
将提取的RNA存储在无菌环境中， 避免污染。
Trizol法提取动植物细胞组织总RNA
Trizol 法提取细胞/组织样本总RNA1. 所需试剂：名称来源储存条件有效期RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent（R401）仓库4℃1年DEPC水配制间室温1周75%乙醇（DEPC水配）自备室温7天氯仿外购室温1年异丙醇外购室温1年2%琼脂糖凝胶自制室温1天Marker DL5000 仓库室温1年PBS缓冲液自备室温1年2. 所需耗材及仪器：序号名称序号名称1 冷冻离心机 4 制冰机、冰盒和冰2 通风橱 5 电泳仪及电泳槽3 RNase free枪头和EP管 6 OneDrop3. 操作步骤：3.1 细胞样本预处理1）小心倒掉细胞培养液，用移液器吸取5ml 1×PBS缓冲液小心加至培养皿中，轻轻晃动，将残留的培养液洗掉，用枪吸净PBS缓冲液，向每个培养皿中加入2 ml Trizol用枪吹打，使细胞完全悬浮和裂解。
（一般一次提取的1 mg RNA需要10盘HeLa Cell。
）2）将裂解的细胞转移至50 ml RNase Free离心管中，在超净台中分装至1.5 ml RNase Free EP管，每管分装1 ml。
3.2 动物组织样本预处理1）取动物组织样本50-100 mg于1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml Trizol，用匀浆机高速匀浆，直至无明显颗粒状物质；或将动物组织剪成碎块，迅速转移至已用液氮预冷的灭菌研钵内，将组织碎块研磨成粉末，再称取50-100 mg于1.5 ml EP管中，并加入1 ml Trizol 中，用移液器吹打至无明显颗粒状物质。
3.3 植物组织样本预处理1）取新鲜植物组织样本15-30 mg于1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml Trizol，用匀浆机高速匀浆，直至无明显颗粒状物质；或将动物组织剪成碎块，迅速转移至已用液氮预冷的灭菌研钵内，将组织碎块研磨成粉末，再称取15-30 mg于1.5 ml EP管中，并加入1 ml Trizol中，用移液器吹打至无明显颗粒状物质。
Trizol法提取总RNA(细胞和组织)
Trizol法提取总RNA
1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol 试剂裂解；
②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；
2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；
3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；
4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；
5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清；
6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）；
7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀；
8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录；
9、进行反转录或分装保存于-80℃。
Trizol法提取组织总RNA步骤
1.研磨制样：先向研钵中加入少量液氮，等液氮挥发使研钵预冷。
再向研钵内倒入适量液氮。
从-70度冰箱取出组织，用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。
迅速研磨组织块，成粉末时加入1ml的trizol，继续研磨，可看到粉末成浆，由浓变稀，直至组织样全部溶解，用移液枪吸到无酶EP管。
2. Trizol法提取RNA
1) 室温静置3-10min，使蛋白质变性；
2) 加入1/4~1/5体积的氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min。
（核蛋白复合体彻底裂解）
3) 吸取上清至无酶的EP管中，加入等体积的酚：氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min，取上清。
若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次，但对于组织一般都要重复该步骤，至没有蛋白层为止，一般抽提两次。
（离心后会分为三次：上层：水相，中间层：DNA，下层：蛋白。
为了降低水相和有机相分界处DNA污染，不要吸取水相的最下层）4) 加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，然后4℃离心12000rpm，30min，弃上清。
（此步骤主要是充分沉淀RNA，然后收集。
故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上，甚至过夜）
5) 加入100ul 70%乙醇，将沉淀吹起来，注意不要吹散，然后4℃12000rpm，5min。
6) 弃上清，空气中挥发乙醇，至壁上无液滴。
7) 加入适量DEPC水，（一般为20ul）溶解。
8) 分光光度计检测RNA浓度和OD值，将Total RNA稀释至1ug/ul，备用。
总RNA的Trizol法提取流程及原理
总RNA的Trizol法提取流程及原理提取原理：Trizol试剂的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是对细胞进行裂解，从而使细胞当中的蛋白质以及核酸物质解聚而得以释放。
苯酚虽然可以有效的使蛋白质变性，但它不能完全抑制RNA酶的活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（即RNA酶）。
Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
在样品的裂解液或匀浆中，Trizol能保持RNA的完整性。
加入氯仿(CHCl3)后离心，样品能分成水样层和有机层。
而RNA存在于水样层中。
在收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀的方法来还原。
在除去水样层之后，样品中的核酸和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。
Trizol试剂不但可用于小量样品（组织：50-100mg；细胞：5×106），也可用于大量样品（组织≥1g或细胞≥107），对动物、植物、细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。
反应迅速，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保护分析等。
本试剂带有颜色，以便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。
保存条件：2-8℃，避光保存12个月。
实验前需要准备的试剂：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水。
实验前需要准备的物品：1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）样品前处理注意点：1.选择新鲜血液。
2.选择生长旺盛的组织。
3.选择新鲜的幼嫩组织。
4.选择处于生长旺盛的时期的细胞。
RNA纯化要求：1.纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。
2.排除有机溶剂和金属离子的污染。
3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
TRIZOL法提取RNA
总细胞RNA的提取在建库过程中，由于cDNA合成这一步将使用通用引物oligo dT，因此在总RNA提取这一步中，提取纯化mRNA不是非常必要的。
提取高纯度的总细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商业化的试剂盒。
1.TRIZOL法
(1)在上述方法中制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨，至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL
溶液。
(2)将上述Eppendorf管置室温(25~27℃)静置15~20min后(也可置4℃较长时间)，每管加入0.2ml氯仿(02ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。
(3)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。
在4℃12 000r/min离心10min。
(4)小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。
(5)于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min或4℃沉淀30min至1h。
(6)4℃12 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次。
(7)最后让沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。
(8)每管用8~10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。
Trizol法提取水稻总RNA的原理和方法
Trizol法提取水稻总RNA
原理：Trizol试剂中主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，此外，与RNA结合，形成RNA-有机溶剂复合物。
这个复合物可以稳定RNA的结构并保护它免受酶降解→当加入氯仿时，形成水相和有机相，酸性苯酚可促使RNA进入水相，而苯酚又可被氯仿抽提，离心后便可形成含RNA的水相层（上层）和含蛋白质和DNA（中层）的有机层（下层）→再使用异丙醇沉淀水相中的RNA，乙醇洗涤沉淀中残留的有机溶剂，最终风干得到RNA。
方法：新鲜组织液氮冷冻，研磨成粉末状→样品中加入Trizol（已预冷），涡旋振荡10s充分混匀，冰上静置5-10 min→加入1/4 Trizol体积的氯仿(已预冷)，充分振荡混匀后冰上静置10 min→12000 rpm，4℃离心10 min(下层为有机溶剂，中间为蛋白质，上层为RNA)→加入预冷的异丙醇-20℃沉淀30min或过夜→12000 rpm，4℃离心15 min，弃上清收集RNA→加70%乙醇清洗沉淀两次→离心弃上清，干燥RNA→DEPC水溶解RNA→-80℃保存。
RNA提取方法
总RNA的提取方法（Trizol）
1、取1g植物材料，倒入液氮剧烈研磨，成粉（研磨成粉称重，无液氮时继续添加），转入离心管中，加入1ml Trizol混匀（除DNA）。
2、室温放置5min。
3、加200ul氯仿（1ml Trizol+0.2ml氯仿目的：除酚）剧烈震荡15s，室温放置3min（时间的控制）。
4、12000rpm，4℃,15min，取上层水相，大约600ul，下层有机相弃去。
5、加异丙醇（-20℃）混匀，室温放置10min（1ml Trizol+500ul异丙醇，目的：除盐，若盐少，可用无水乙醇）
6、12000rmp，4℃,10min，弃上清，RNA在管底和管壁形成胶状沉淀。
7、加1ml75﹪乙醇洗涤沉淀（用枪头吹打）低速离心5min，弃上清，4℃，,7500rmp，一般为7000rmp。
8、室温放置，晾干5至10min（不要过干，否则RNA难溶，另外，乙醇残留时会对RNA逆转录酶抑制）。
9、加25-30ulDEPC水，可用枪头吹打帮助溶解。
①看到沉淀时加30-50ulDEPC 水；②看不到沉淀时加20-25ulDEPC水。
注意事项：
1、DNA制备所需的水、溶液，都必须用DEPC 37℃预处理。
2、操作过程中要用到的Eppenolorf管，枪头必须经DEPC处理
3、玻璃器皿需高温干热（200℃）灭菌2-3h。
4、塑料制品和电泳槽等需要0.5mol/L的NaoH处理1-2h，然后用无菌水漂洗干净。
5、操作台和枪先用氯仿擦一遍。
6、操作中常换一次性手套，手是主要的污染源。
7、戴口罩，避免口中的RNA酶污染。
TRIZOL法提取总RNA
TRIZOL法提取总RNA（改进的一步法）Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。
1.在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2.称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。
（材料体积≤Trizol体积的10%）旋涡震荡混匀，15-30℃静置5分钟。
3.去除胞壁残渣、多糖、蛋白、脂肪：离心（4℃，1‚2000 ×g）10分钟。
取上清至一新的EP管中。
4.分相：①加0.2 ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟。
15-30℃静置2-3分钟。
②离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）15分钟。
5.沉淀，并去除多糖：①用200μl的枪取无色水相（大约原初Trizol体积的60%，约600μl ）至一新的EP管中。
切勿吸到中间层。
②加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃静置10分钟。
③离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）10分钟。
倾去上清。
6. 清洗：①用200μl的枪吸除多余上清，加1ml 冰预冷的75% 乙醇，旋涡震荡。
②离心（4℃，7500 ×g）5分钟。
7. 用真空泵吸除乙醇，37℃干燥10分钟。
切勿干燥彻底，否则极难溶解。
8. 加适量的DEPC•H2O（一般20μl），枪打数次，使沉淀溶解。
然后置于55-60℃水浴中彻底溶解10分钟。
迅速冰浴，5分钟，稍离心。
9. 置于-70℃保存。
注意事项：①在第2步静置后，或第3步取上清后，可以在-70℃保存一个月。
②在第6步旋涡震荡后，可在-4℃保存一周，或在–20℃保存一年。
③高盐溶液：0.8M柠檬酸钠+1.2M氯化钠，DEPC处理后高温灭菌。
④通常用0.1-0.15 g材料可以提取 60-100 μg 总RNA。
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反转录PCR(RT-PCR) 反转录
mRNA Oligo dT, 逆转录酶 cDNA 特异性引物, Taq酶 PCR
用途: 用途 获得所需cDNA片段；检测基因表达
注意问题： 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、mRNA丰度
1.逆转录： 逆转录： 逆转录
5’
mRNA cDNA
AAAAAAAA3’ TTTTTTTT
从组织中提取RNA
• 本实验目的：提取大鼠总RNA • 组织来源：大鼠肝脏。 • 每组做两个样品
步骤
• • • • • • • • • • 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入 1mlTRIZOL试剂。匀浆。 移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。 4℃离心，12,000g×15min。 仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。 4℃离心，12,000g×10min。 弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离 心，7500g×5min。 弃上清，空气干燥5-10min，加入50µl无RNase水重悬沉淀。 核酸定量或电泳检测。多余样品-70℃保存备用。
RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 、缓冲液、 、逆转录酶、 引物（随机引物:Oligo dT) 引物（随机引物
实验步骤
• 取1µg总RNA于一PCR管，70℃反应10min，轻轻离心后 置于冰上。 • 2）建立20µl RT反应体系： • MgCl2 4µl • 10×RT缓冲液 2µl • dNTP Mixture（10mM） 2µl（1.25mmol/L） • RNase inhibitor 0.5µl • 逆转录酶 1µl（200U） • Oligo(dT)15引物 1µl • 总RNA 1µg • 加无核酶水至总体积 20µl • 涡旋混匀，42℃反应15分钟，95℃加热5分钟，0-5℃5分 钟。
• 故根据OD 260 /OD 280的比值可以估 计核酸的纯度：
DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比 值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明 样品中含有RNA污染， 若RNA样品比值高 于2.0，则提示RNA 有降解。RNA、DNA 溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
实验步骤
• 取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE） 至100ul，混匀。 • 将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀 释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读 数。核酸定量仪将直接给出样品浓度。
2.PCR: 2.PCR: PCR
GAPDH (sense)
AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’
cDNA rTaq GAPDH
GAPDH (antisense)
GAPDH
cDNA、缓冲液、dNTP、rTaq、引物 、缓冲液、 、 、 特异引物)、 （特异引物 、 Mg2+
实验步骤
注意事项
• EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污 染环境。 • 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意 样品不能混样。
实验步骤
（1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 （2）冷却到60℃，加入1μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。 （3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖 （约50℃）倒入，室温冷却凝固。 （4）将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖 凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 （5）用移液器吸取总RNA样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点样孔。 (6) 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带 由负极向正极移动，电泳约30min。
• 在波长260nm紫外线下，1OD值的光
密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml； 单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核 苷酸为20ug/ml。
DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍 数× 50/1000（ug/ul） RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍 数 ×40/1000（ug/ul）
电泳检测
• 琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用 方法 • 琼脂糖 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以 形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖浓度。 • DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外 分子在碱性缓冲液中带负电荷 加电场作用下向正极泳动。
• 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。 • 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
RT-PCR
RT-PCR
• RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以 的多聚酶反应（ 的多聚酶反应 ） mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse 为模板进行逆转录反应（ transcription， RT）与PCR，可用于检测 ， ） ， 单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的 单个细胞或少数细胞中少于 个拷贝的 RNA模板。 模板。 模板 mRNA cDNA PCR产物 产物
专题
• 2.human IL8 ELISA检测 • 3.报道系统的单光子检测
TRIZOL法提取总RNA
简介
• 研究基因的表达和调控时常常要从组织和 细胞中分离和纯化RNA。 • RNA 质 量 的 高 低 常 常 影 响 cDNA 库 ， RTPCR和Northern Blot等分子生物学实验的 成败。
注意事项
• 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操 作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。 • 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染 了RNA酶的物品后，应更换手套 • 样品量和Trizol 的加入量一定要按步骤（1 ）的比 例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则 会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降 解。
建立PCR反应体系： RT获得逆转录反应得到的cDNA 5µl 5.0µM的GAPDH混合引物 2µl 10×PCR buffer 5µl 10mM dNTPs 1µl Taq DNA聚合酶 0.5µl MgCl2 4µl ddH2O 32.5 µl Total volume 50 µl • 按下列程序运行循环：step1 step2 step3 step4 step5 step6 95℃变性 4 min 95℃变性 45 sec 53℃复性 45 sec 72℃延伸 90 se 72℃温育 10 min 4℃ 保存 24 hrs
•
step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。
Hale Waihona Puke 预染色的标本上样电泳检测结果： 电泳检测结果： RNA提取： 提取： 提取
防止RNA RNA降解 关键 防止RNA降解
RNA提取的成功与否 提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 检测中最 重要的步骤。 重要的步骤。
核酸定量
• 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫 外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。 例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm， 胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276 nm，胸腺嘧 啶：264.5 nm，尿嘧啶：259 nm。这些碱基 与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰 不会改变。但核苷酸最大吸收波长是260nm， 吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分 光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
RNase
• 它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA制备有关的分子生物学实验时，必须 戴手套。 • RNase的又一污染源是取液器，包括枪头 和EP管等
RNase处理
• 所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长 时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗 涤。 • 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染 了RNA酶的物品后，应更换手套。 • 配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理 12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能 高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏 水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌。
实验总体安排
1．大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定： ．大鼠 基因的钓取、 基因的钓取 克隆和鉴定： 大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测 GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶） RT-PCR产物的胶回收 连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆） 挑单克隆，摇菌过夜、提质粒 酶切鉴定，电泳检测
• Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的 试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰 酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。 核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。 异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶， 保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离 心，样品分成水样层和有机层。RNA存在 于水样层中。收集上面的的水样层后，用异 丙醇沉淀火的RNA