TRIZOL法提取总RNA

• 在波长260nm紫外线下，1OD值的光
密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml； 单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核 苷酸为20ug/ml。
DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍 数× 50/1000（ug/ul） RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍 数 ×40/1000（ug/ul）
2.PCR: 2.PCR: PCR
GAPDБайду номын сангаас (sense)
AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’
cDNA rTaq GAPDH
GAPDH (antisense)
GAPDH
cDNA、缓冲液、dNTP、rTaq、引物 、缓冲液、 、 、 特异引物)、 （特异引物 、 Mg2+
实验步骤
电泳检测
• 琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用 方法 • 琼脂糖 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以 形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖浓度。 • DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外 分子在碱性缓冲液中带负电荷 加电场作用下向正极泳动。
• 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。 • 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
注意事项
• 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操 作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。 • 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染 了RNA酶的物品后，应更换手套 • 样品量和Trizol 的加入量一定要按步骤（1 ）的比 例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则 会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降 解。
RNase
• 它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA制备有关的分子生物学实验时，必须 戴手套。 • RNase的又一污染源是取液器，包括枪头 和EP管等
RNase处理
• 所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长 时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗 涤。 • 全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染 了RNA酶的物品后，应更换手套。 • 配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理 12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能 高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏 水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌。
建立PCR反应体系： RT获得逆转录反应得到的cDNA 5µl 5.0µM的GAPDH混合引物 2µl 10×PCR buffer 5µl 10mM dNTPs 1µl Taq DNA聚合酶 0.5µl MgCl2 4µl ddH2O 32.5 µl Total volume 50 µl • 按下列程序运行循环：step1 step2 step3 step4 step5 step6 95℃变性 4 min 95℃变性 45 sec 53℃复性 45 sec 72℃延伸 90 se 72℃温育 10 min 4℃ 保存 24 hrs
从组织中提取RNA
• 本实验目的：提取大鼠总RNA • 组织来源：大鼠肝脏。 • 每组做两个样品
步骤
• • • • • • • • • • 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入 1mlTRIZOL试剂。匀浆。 移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。 4℃离心，12,000g×15min。 仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。 4℃离心，12,000g×10min。 弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离 心，7500g×5min。 弃上清，空气干燥5-10min，加入50µl无RNase水重悬沉淀。 核酸定量或电泳检测。多余样品-70℃保存备用。
注意事项
• EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污 染环境。 • 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意 样品不能混样。
实验步骤
（1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 （2）冷却到60℃，加入1μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。 （3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖 （约50℃）倒入，室温冷却凝固。 （4）将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖 凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 （5）用移液器吸取总RNA样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点样孔。 (6) 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带 由负极向正极移动，电泳约30min。
RT-PCR
RT-PCR
• RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以 的多聚酶反应（ 的多聚酶反应 ） mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse 为模板进行逆转录反应（ transcription， RT）与PCR，可用于检测 ， ） ， 单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的 单个细胞或少数细胞中少于 个拷贝的 RNA模板。 模板。 模板 mRNA cDNA PCR产物 产物
RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 、缓冲液、 、逆转录酶、 引物（随机引物:Oligo dT) 引物（随机引物
实验步骤
• 取1µg总RNA于一PCR管，70℃反应10min，轻轻离心后 置于冰上。 • 2）建立20µl RT反应体系： • MgCl2 4µl • 10×RT缓冲液 2µl • dNTP Mixture（10mM） 2µl（1.25mmol/L） • RNase inhibitor 0.5µl • 逆转录酶 1µl（200U） • Oligo(dT)15引物 1µl • 总RNA 1µg • 加无核酶水至总体积 20µl • 涡旋混匀，42℃反应15分钟，95℃加热5分钟，0-5℃5分 钟。
• 故根据OD 260 /OD 280的比值可以估 计核酸的纯度：
DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比 值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明 样品中含有RNA污染， 若RNA样品比值高 于2.0，则提示RNA 有降解。RNA、DNA 溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
实验步骤
• 取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE） 至100ul，混匀。 • 将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀 释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读 数。核酸定量仪将直接给出样品浓度。
专题
• 2.human IL8 ELISA检测 • 3.报道系统的单光子检测
TRIZOL法提取总RNA
简介
• 研究基因的表达和调控时常常要从组织和 细胞中分离和纯化RNA。 • RNA 质 量 的 高 低 常 常 影 响 cDNA 库 ， RTPCR和Northern Blot等分子生物学实验的 成败。
预染色的标本
上样
电泳检测结果： 电泳检测结果： RNA提取： 提取： 提取
防止RNA RNA降解 关键 防止RNA降解
RNA提取的成功与否 提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 检测中最 重要的步骤。 重要的步骤。
核酸定量
• 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫 外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。 例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm， 胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276 nm，胸腺嘧 啶：264.5 nm，尿嘧啶：259 nm。这些碱基 与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰 不会改变。但核苷酸最大吸收波长是260nm， 吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分 光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
实验总体安排
1．大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定： ．大鼠 基因的钓取、 基因的钓取 克隆和鉴定： 大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测 GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶） RT-PCR产物的胶回收 连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆） 挑单克隆，摇菌过夜、提质粒 酶切鉴定，电泳检测
•
step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。
• Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的 试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰 酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。 核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。 异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶， 保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离 心，样品分成水样层和有机层。RNA存在 于水样层中。收集上面的的水样层后，用异 丙醇沉淀火的RNA
反转录PCR(RT-PCR) 反转录
mRNA Oligo dT, 逆转录酶 cDNA 特异性引物, Taq酶 PCR
用途: 用途 获得所需cDNA片段；检测基因表达
注意问题： 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、mRNA丰度
1.逆转录： 逆转录： 逆转录
5’
mRNA cDNA
AAAAAAAA3’ TTTTTTTT