大学课程遗传学实验实验九 环介导 jc课件

F3、B3
各0.4µl
FIP、BIP
各1.6µl
dNTP betaine
4µl
25µl
2.5µl
10×Thermopol缓冲液 2.5µl
水
10µl
Bst DNA聚合酶
1µl
略
3、PCR仪中95 ℃5min。
4、加入Bst DNA聚合酶1µl。
5、短暂离心,放入65℃的扩增仪中恒温1个小 时。（制胶）
实验九 环介导等温扩增 （ LAMP）技术扩增单纯疱疹病
毒Ⅱ型DNA
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）
是最早发现的人类疱疹病毒，也是所有人类病毒 性疾病中最常见的病毒。
• 它有两种血清型HSV-I和HSV-II，其中 HSV-II主要感染外生殖器和躯干下部皮肤， 引起生殖器疱疹、新生儿疱疹胎儿畸形等。 在生殖器疱疹患者中，90%以上是由HSVII引起，而且无疱疹特异性症状的HSV-II宫 颈炎也是妇女常见的疾病，而且可垂直传 播胎儿和新生儿。因此，建立一种早期、 快速、特异、敏感的检测方法，对优生优 育及阻断HSV-II传播有着更重要的意义。
环介导的等温扩增(Loop–mediated isothermal amplification，LAMP):针对 靶基因的六个区域设计四条特异性引物,利 用链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)在等温条件下高效、快速、 特异地扩增靶序列。
实验目的
1. 掌握LAMP扩增单纯疱疹病毒II型 DNA的 基本原理。
8U/µl
dNTPs
2.5mM of each
F3、B3、FIP、BIP
25µM
琼脂糖凝胶
2﹪
10×Thermopol缓冲液
实验步骤
1、提取含有目的片段的质粒作为阳性模板（为了便于提取 目的DNA，我们将靶序列克隆到质粒中）。
2、将各成分按以下次序在0.5ml灭菌离心管内混合：
阳性模板（质粒DNA） 1µl
2. 熟悉LAMP扩增单纯疱疹病毒II型 DNA的 操作过程。
LAMP引物
其中四条引物包括两条外引物(F3、B3)和两 条内引物（FIP、BIP），FIP又由F1c-F2 组成，BIP由B1c-B2组成，F1c、B1c分别 是F1和B1的互补序列。
LAMP引物位置
扩增过程
扩增过程分为两个阶段： 第1阶段为起始阶段， 第2阶段是扩增循环阶段。
起始阶段
任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延 伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP 的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的 作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c 结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的 F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状 结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于 FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端 的Fl区段为起点,以自身为模板，进行DNA合成延伸形成 茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
6、 取15µl DNA扩增产物，在含0.5μg/ml溴 化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，电 压5V/cm，紫外灯下观察结果。
思考题
1、与PCR相比，LAMP有哪些优势? 2、LAMP与PCR的电泳条带有什么差别？
乙肝病毒检测
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模 板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成， 解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’ 末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状 结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新 一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。扩增的最 后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA 的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向 重复序列。
LAMP 技术特点
1.灵敏度高：普通PCR的十倍 2.特异性强 3.速度快。满足临床样本快速检测需要 4.设备简单 5.操作简便 6.检测便捷：LAMP 在合成DNA 的同时还产
生大量的焦磷酸镁沉淀,可根据反应体系中 是否形成白色沉淀来定性判断LAMP 结果
LAMP的应用
• 1. 病毒检测 • 2. 细菌检测 • 3. 真菌与寄生虫的检测 • 4. 动物胚胎性别检测
本实验选择特异性基因HSV-II-gD基因 作为LAMP引物设计的靶序列，最后选出一 套扩增区域位于GeneBank中的141080141282之间的引物。
实验器材与试剂Fra Baidu bibliotek
1.实验器材 PCR扩增仪（或水浴锅），离心机，电泳仪，
移液枪等
2.实验试剂
试剂
浓度
Betaine三甲铵乙内酯 5M
Bst DNA聚合酶