8 亲和色谱
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释
亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述亲和色谱是一种分离和纯化生物大分子的常用技术，它通过利用生物大分子与其配体之间的特异性相互作用来实现分离。
配体可以是一种蛋白质、抗体、寡核苷酸或其他具有亲和性的分子。
亲和色谱的洗脱步骤是整个分离过程中非常重要的一环。
洗脱步骤通常是在样品与亲和色谱介质之间相互作用的基础上进行的，旨在以一种控制的方式解离目标分子与亲和介质之间的相互作用，从而实现目标分子的高效纯化。
在洗脱步骤中，通常会使用适当的洗脱缓冲液来改变样品与亲和介质之间的物理、化学条件，从而打破它们之间的亲和作用。
这样一来，目标分子会从亲和介质上解离出来，进而被洗脱出来。
洗脱缓冲液的选择具有很大的灵活性，可以根据目标分子与亲和介质之间的相互作用类型进行优化。
常用的洗脱策略包括改变pH值、离子强度或离子种类、添加竞争性配体等。
通过这些手段调控洗脱缓冲液的条件，可以实现对目标分子的高效洗脱。
同时，洗脱步骤的优化也需要考虑目标分子的稳定性和纯化效率等因素。
总之，亲和色谱的洗脱步骤是亲和色谱技术中至关重要的一环。
它通过改变样品与亲和介质之间的相互作用条件，实现了目标分子的高效纯化。
洗脱策略的选择和优化对于获取高纯度的目标分子至关重要，因此需要充分考虑各种因素的影响并进行实验验证。
文章结构部分的内容可以包括以下几个方面：1.2 文章结构本文共分为三个部分：引言、正文和结论。
引言部分介绍了亲和色谱洗脱步骤的背景和意义，包括亲和色谱的定义和作用。
接着介绍了本文的目的，即详细讨论亲和色谱的洗脱步骤。
正文部分分为两个小节。
第一个小节是亲和色谱的原理，详细介绍了亲和色谱的基本原理和工作机制，包括亲和剂与目标分子的特异性结合、固定相和流动相的选择等内容。
第二个小节是亲和色谱的洗脱步骤，将详细讨论亲和色谱洗脱的各个步骤，包括样品的加载、洗脱剂的选择和优化、梯度洗脱的条件等。
结论部分对亲和色谱洗脱步骤进行总结，归纳了各个步骤的重要性和影响因素。
亲和色谱
聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
第四节 亲和吸附剂的制备
一、要求 ㈠. ㈡. 结 L与基质结合，对L-S结合无干扰； L为小分子有的需“手臂”，使L-S
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
亲和色谱法
亲和色谱法亲和色谱法是一种用于分离、纯化生物大分子的技术，它利用生物分子之间的亲和作用来进行分离、纯化。
它的基本原理是：在柱子的表面放置一种可以与目标生物分子发生亲和作用的固定化剂，然后将待测样品通过柱子进行流动。
当目标生物分子与固定化剂发生亲和作用时，就会被吸附在柱子的表面；而其他的杂质分子则不会被吸附，经过柱子流出。
最后，再通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来，即可得到高纯度的目标生物分子。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子；缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
亲和色谱法主要应用在生物学、药学、食品工业、环境监测等领域，并在这些领域取得了巨大的成功。
在生物学领域，亲和色谱法常用于抗体分离、酶的纯化、抗原的分离等；在药学领域，亲和色谱法常用于药物的纯化、抗体药物的生产等；在食品工业中，亲和色谱法常用于食品添加剂的分离、蛋白质的纯化等；在环境监测领域，亲和色谱法常用于水质监测、空气监测等。
亲和色谱法的原理是基于生物分子之间的亲和作用，因此选择固定化剂时需要考虑到固定化剂与目标生物分子之间的亲和作用。
常用的固定化剂有抗体、酶、抗原、细胞表面蛋白等。
选择固定化剂时，需要考虑到固定化剂的稳定性、选择性、可交换性、可再生性等因素。
亲和色谱法的实验过程大致分为固定化、流动、洗脱、解离四个步骤。
在固定化步骤中，需要将固定化剂放在柱子中，然后将柱子浸泡在预处理溶液中，使固定化剂与柱子结合起来。
在流动步骤中，需要将待测样品通过柱子进行流动。
在洗脱步骤中，需要通过适当的洗脱溶液将非目标生物分子从柱子上洗脱出来。
在解离步骤中，需要通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子。
缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
因此，在使用亲和色谱法时，需要根据实际情况来选择适当的固定化剂和洗脱溶液，并适当调整流速，以提高分离效率。
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
亲和色谱
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
第9章 亲和色谱
硅胶的活化
硅烷化试剂 配基的固定化 直接固定法(慢) 间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
配基密度对蛋白质吸附的影响
通常情况下，目标产物的吸附容量随配基固定化密度 的提高而增大。但是，当配基固定化密度过高时，配 基之间会产生空间位阻作用(steric hindrance)，影响 配基与目标产物之间的亲和吸附，配基的有效利用率 降低； 因此，配基固定化密度也不宜过高，通常存在最佳密 度值范围。
模型分析(前述吸附理论和模型均可用于亲和色谱的分析)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.6 亲和色谱的应用
组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化-酶的抑制剂为 亲和配基
t-PA是一种糖蛋白，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋 白药物； t-PA主要存在于动物心脏组织中，但含量很低； 目前主要利用重组DNA动物细胞生产t-PA 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒常用作配基
生物分离工程 第8章 亲和色谱
间隔臂的作用(消除空间位阻的影响)
配基
目 标 分 子
间隔臂
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.4 亲和吸附平衡
吸附等温线
基本上可用Langmuir或Freundlich方程描述
色素亲和吸附平衡
色素配基研究得最多的是辛巴蓝(Cibacron Blue 3GA, CB) CB与蛋白质的结合机理
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔”的关系是亲和作用的必要条件，但并不充分， 还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整 地体现亲和结合作用，包括：
生物分离工程 第8章 亲和色谱
静电作用：亲和作用分子对的结合部位上带有相反电 荷时，产生静电引力。如果满足“钥匙”和“锁孔” 的关系，在近距离发生的静电引力 很强烈的； 氢键：如果亲和作用分子对的一个分子中含有O原子或 N原子，结合部位之间可以产生氢键作用，形成O-H-O 或O-H-N的氢键结合，但氢键的产生与否受结合部位 之间位置关系的严格制约，O-H-O或O-H-N需排列在一 条直线上； 疏水性相互作用：如果亲和作用分子对的一个分子中 含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上 也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用， 如含有脯氨酸等氨基酸残基的蛋白质，胶原与单宁的 结合可通过疏水键结合； 配位键：如果亲和作用分子对均与同一金属离子配位， 则两者之间可通过金属配位键结合；
亲和色谱分离
中等盐浓度的缓冲液能稳定溶液中蛋白质并
防止由于离子交换所引起的非特异性相互作 用。
5 操作方法
3. 柱操作
柱的大小取决于吸附剂的容量和所需纯
化的蛋白质的量。一般地说，高的容量
② 流速控制
不能太快
延长时间可促进吸附
③ 吸附时间的控制
④ 进样量的大小
减少进样量，可提高吸附效果。
4 亲和色谱操作条件的选择
2. 清洗条件的选择
洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附
条件与目的分子洗脱条件之间
4 亲和色谱操作条件的选择
3. 洗脱条件的选择
在实际操作过程中，应该在洗脱强度和 耐受程度之间做好平衡。
1. 载体的选择
常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃载
体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡
聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联琼脂
糖凝胶载体等。
2. 配基的选择
根据配基应用和性质，可将其分为两
类：特殊配基和通用配基。亲和层析
中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、
某一酶的专用抑制剂、某一激素的受
体等。通用配基可适用于一类物质的
分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和
层析的通用配基。
2. 配基的选择
首先，应当仅仅识别被纯化的目的物(配 体)。其次，配体与配基应该有足够大的亲 和力。再次，配基与相应目的物之间的结
合应具有可逆性。第四，配体具有足够的
稳定性，能够耐受反应条件以及清洗合再 生等条件。最后，配基的分子大小必须合 适。
3. 载体的活化与偶联
载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配基
第八章 亲和色谱
第八章亲和色谱( Affinity chromatography)第一节生物亲和作用•生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合——生物分子间的这种特异性相互作用称生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合或亲和结合。
一、生物亲和作用的概念•亲和作用是分子之间的结合作用，自然界普遍存在的现象，生物分子间的亲和作用具有更高的选择性二、亲和作用的本质必要条件：钥匙和锁孔的关系此外，还需要具备相互作用：静电作用；氢键；疏水性相互作用；配位键；弱共价键•(1) 离子强度三、影响亲和作用的因素静电引力减弱或完全破坏亲和作用氢键疏水相互作用亲和作用增大静电引力在亲和作用中占重要地位，所以一般可以用高盐洗脱•蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数不同。
•(2) pH 值如果，静电引力对亲和作用的贡献最大，pH 就会严重影响亲和作用。
溶液pH 值选择非常重要。
•(3) 抑制氢键形成的物质•(4) 温度•(5) 离液离子•(6) 螯合剂四、亲和作用体系第二节亲和色谱原理•将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固定粒子共价偶联，可以特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子容易从混合物中得到选择性分离纯化。
•亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象的配基，亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质。
•操作一般分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生等4个步骤。
配基不溶性母体载体或担体当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与间隔臂以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
第三节亲和色谱介质•①酶的抑制剂与酶的活性部位结合•生物大分子或小分子化合物•②抗体单抗和多克隆抗体免疫亲和色谱•③A蛋白相对分子量约42000,与抗体结合,但不影响抗体与抗原结合可用于分离抗体-抗原复合体•④凝集素与糖特异结合的蛋白质的总称,如刀豆蛋白可用作糖蛋白、多糖、糖脂等的亲和配基。
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和色谱法的原理及应用
亲和色谱法的原理及应用一、亲和色谱法的原理亲和色谱法是一种利用生物大分子间的特异性相互作用进行分离和纯化的方法。
其原理是通过靶分子与固相上的配体之间产生亲和结合来实现分离。
亲和色谱法利用了配体与靶分子之间的特异性相互作用，如抗原与抗体的结合、酶与底物的结合等，从而实现对目标分子的选择性捕获。
其分离和纯化效果优于传统的分离方法，成为现代生物科学研究中不可或缺的技术手段。
二、亲和色谱法的应用亲和色谱法在生物学和药物研发等领域中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用案例：1.抗体纯化：亲和色谱法广泛应用于抗体的纯化工艺中。
通过将抗体的抗原特异性与配体结合，可以实现对抗体的高效选择性纯化。
2.蛋白质纯化：亲和色谱法在蛋白质纯化中起到了重要的作用。
通过将某一特定结合配体固定在色谱柱上，可以实现对目标蛋白质的选择性捕获。
3.酶底物亲和纯化：亲和色谱法可利用酶与底物之间的亲和结合进行酶的纯化。
通过将底物或类似物固定到色谱柱上，可实现对酶的选择性捕获。
4.核酸纯化：亲和色谱法可应用于核酸的纯化过程。
通过将亲和配体固定在色谱柱上，可以实现对目标核酸的高效分离。
5.生物药物开发：亲和色谱法在生物药物的开发过程中起到关键作用。
通过分离和纯化目标蛋白质，可以获得高纯度的生物药物。
三、亲和色谱法的优势和局限性使用亲和色谱法进行分离和纯化具有以下优势：•高选择性：亲和色谱法可以实现对目标分子的高度选择性捕获，减少了其他杂质的干扰。
•高纯度：亲和色谱法可以获得高纯度的目标分子，满足进一步研究和应用的需要。
•原位纯化：亲和色谱法能够在原位进行纯化操作，避免了传统离心、沉淀等分离步骤。
然而，亲和色谱法也存在一些局限性：•配体选择性：亲和色谱法的成功与否，取决于配体与靶分子之间的相互作用是否特异、强烈，因此选择合适的配体是亲和色谱法的关键。
•杂质的干扰：亲和色谱法在分离和纯化过程中，有时可能会受到杂质的干扰，导致目标分子的选择性捕获不够理想。
亲和色谱层析
亲和色谱层析
亲和色谱层析是一种分离和纯化生物分子的方法，主要用于从混合物中分离目标生物分子，例如蛋白质、抗体、核酸等。
亲和色谱层析的基本原理是通过生物分子之间的特异性相互作用来实现分离。
以下是亲和色谱层析的主要步骤和原理：
1.亲和基质选择：选择一种适当的亲和基质（affinity matrix），这是一种包含亲和配体（affinity ligand）的材料，具有对目标分子的特异性结合能力。
亲和配体可以是抗体、金属离子、小分子化合物等，与目标分子有特异性相互作用。
2.样品加载：将混合物样品加载到亲和柱（亲和基质填充的柱子）中。
3.特异性结合：在亲和柱中，目标分子与亲和基质上的亲和配体特异性结合。
非目标分子则会通过柱子，被洗脱。
4.洗脱：通过改变缓冲液的条件，例如改变pH值、离子强度或温度，使得目标分子与亲和基质的亲和结合减弱，从而将目标分子洗脱下来。
5.收集纯化的目标分子：洗脱的溶液中包含了纯化的目标分子，可以进一步进行分析或其他实验。
亲和色谱层析的优势在于其对生物分子的高选择性，能够在不破坏目标分子生物活性的情况下进行分离和纯化。
然而，也需要根据具体的目标分子和样品特性选择适当的亲和基质和亲和配体。
亲和色谱法affinity chromatography.doc
亲和色谱法affinity chromatography离子交换色谱法ion exchange chromatography，IEC离子色谱法ion chromatography离子抑制色谱法ion suppression chromatography离子对色谱法ion pair chromatography疏水作用色谱法hydrophobic interaction chromatography制备液相色谱法preparative liquid chromatography平面色谱法planar chromatography纸色谱法paper chromatography薄层色谱法thin layer chromatography，TLC高效薄层色谱法high performance thin layer chromatography，HPTLC 浸渍薄层色谱法impregnated thin layer chromatography凝胶薄层色谱法gel thin layer chromatography离子交换薄层色谱法ion exchange thin layer chromatography制备薄层色谱法preparative thin layer chromatography薄层棒色谱法thin layer rod chromatography液相色谱仪liquid chromatograph制备液相色谱仪preparative liquid chromatograph凝胶渗透色谱仪gel permeation chromatograph涂布器spreader点样器sample applicator色谱柱chromatographic column棒状色谱柱monolith column monolith column微粒柱microparticle column填充毛细管柱packed capillary column空心柱open tubular column微径柱microbore column混合柱mixed column组合柱coupled column预柱precolumn保护柱guard column预饱和柱presaturation column浓缩柱concentrating column抑制柱suppression column薄层板thin layer plate色谱图chromatogram色谱峰chromatographic peak峰底peak base峰高h，peak height峰宽W，peak width半高峰宽Wh/2，peak width at half height峰面积A，peak area拖尾峰tailing area前伸峰leading area假峰ghost peak畸峰distorted peak反峰negative peak拐点inflection point原点origin斑点spot区带zone复班multiple spot区带脱尾zone tailing基线base line基线漂移baseline drift基线噪声N，baseline noise统计矩moment一阶原点矩γ1，first origin moment二阶中心矩μ2，second central moment三阶中心矩μ3，third central moment液相色谱法liquid chromatography，LC液液色谱法liquid liquid chromatography，LLC液固色谱法liquid solid chromatography，LSC正相液相色谱法normal phase liquid chromatography反相液相色谱法reversed phase liquid chromatography，RPLC柱液相色谱法liquid column chromatography高效液相色谱法high performance liquid chromatography，HPLC 尺寸排除色谱法size exclusion chromatography，SEC凝胶过滤色谱法gel filtration chromatography凝胶渗透色谱法gel permeation chromatography，GPC浓缩区薄层板concentrating thin layer plate荧光薄层板fluorescence thin layer plate反相薄层板reversed phase thin layer plate梯度薄层板gradient thin layer plate烧结板sintered plate展开室development chamber往复泵reciprocating pump注射泵syringe pump气动泵pneumatic pump蠕动泵peristaltic pump检测器detector微分检测器differential detector积分检测器integral detector总体性能检测器bulk property detector溶质性能检测器solute property detector(示差)折光率检测器[differential] refractive index detector荧光检测器fluorescence detector紫外可见光检测器ultraviolet visible detector电化学检测器electrochemical detector蒸发(激光)光散射检测器[laser] light scattering detector光密度计densitometer薄层扫描仪thin layer scanner柱后反应器post-column reactor体积标记器volume marker记录器recorder积分仪integrator馏分收集器fraction collector工作站work station固定相stationary phase固定液stationary liquid载体support柱填充剂column packing化学键合相填充剂chemically bonded phase packing薄壳型填充剂pellicular packing多孔型填充剂porous packing吸附剂adsorbent离子交换剂ion exchanger基体matrix载板support plate粘合剂binder流动相mobile phase洗脱(淋洗)剂eluant，eluent展开剂developer等水容剂isohydric solvent改性剂modifier显色剂color [developing] agent死时间t0，dead time保留时间tR，retention time调整保留时间t'R，adjusted retention time死体积V0，dead volume保留体积vR，retention volume调整保留体积v'R，adjusted retention volume柱外体积Vext，extra-column volune粒间体积V0，interstitial volume(多孔填充剂的)孔体积VP，pore volume of porous packing 液相总体积Vtol，total liquid volume洗脱体积ve，elution volume流体力学体积vh，hydrodynamic volume相对保留值ri.s，relative retention value分离因子α，separation factor流动相迁移距离dm，mobile phase migration distance流动相前沿mobile phase front溶质迁移距离ds，solute migration distance比移值Rf，Rf value高比移值hRf，high Rf value相对比移值Ri.s，relative Rf value保留常数值Rm，Rm value板效能plate efficiency折合板高hr，reduced plate height分离度R，resolution液相载荷量liquid phase loading离子交换容量ion exchange capacity负载容量loading capacity渗透极限permeability limit排除极限Vh，max，exclusion limit拖尾因子T，tailing factor柱外效应extra-column effect管壁效应wall effect间隔臂效应spacer arm effect边缘效应edge effect斑点定位法localization of spot放射自显影法autoradiography原位定量in situ quantitation生物自显影法bioautography归一法normalization method内标法internal standard method外标法external standard method叠加法addition method普适校准(曲线、函数) calibration function or curve [function]谱带扩展(加宽) band broadening(分离作用的)校准函数或校准曲线universal calibration function or curve [of separation] 加宽校正broadening correction加宽校正因子broadening correction factor溶剂强度参数ε0，solvent strength parameter洗脱序列eluotropic series洗脱(淋洗) elution等度洗脱gradient elution梯度洗脱gradient elution(再)循环洗脱recycling elution线性溶剂强度洗脱linear solvent strength gradient程序溶剂programmed solvent程序压力programmed pressure程序流速programmed flow展开development上行展开ascending development下行展开descending development双向展开two dimensional development 环形展开circular development离心展开centrifugal development向心展开centripetal development径向展开radial development多次展开multiple development分步展开stepwise development连续展开continuous development梯度展开gradient development匀浆填充slurry packing停流进样stop-flow injection阀进样valve injection柱上富集on-column enrichment流出液eluate柱上检测on-column detection柱寿命column life柱流失column bleeding显谱visualization活化activation反冲back flushing脱气degassing沟流channeling过载overloading。
chapter8亲和层析精品文档
Often need spacer arm
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系
相互作用
静电作用
氢键
疏水性相互作用 配位键
弱共价键
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
• 生物体内相互作用的分子对： • (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 • (2) 抗原—抗体。 • (3) 激素—受体。 • (4) 糖蛋白与凝集素, • (5) 生物素—生物素结合蛋白等
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核 糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系， 都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力 称为亲和力。
• 凝集素（Lectin）是指一种从各种植 物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖 蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血 球（含血型物质），故名凝集素。
• 常用的为植物凝集素 （Phytoagglutin，PNA），通常以其 被提取的植物命名，如刀豆素A （Conconvalina，ConA）、麦胚素 （Wheat germ agglutinin，WGA）、 花生凝集素（Peanut agglutinin， PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们 的总称。
亲和色谱过程及在新冠疫苗研制过程中的作用 -回复
亲和色谱过程及在新冠疫苗研制过程中的作用-回复亲和色谱（Affinity Chromatography）是一种分离和纯化生物分子的有效技术方法。
它基于生物分子之间的亲和性，利用化学特性或生物活性之间的特异性相互作用，将目标分子与其他非特异性的分子分离开来。
亲和色谱在新冠疫苗研制过程中起着重要作用，下面我们将一步一步回答。
第一步：了解亲和色谱的原理和基本步骤亲和色谱的原理基于生物分子之间的亲和性相互作用。
常用的亲和色谱基质有固定金属离子、亲和剂、抗体等。
基本步骤包括亲和基质的固定、样品的加载、非特异性结合物的洗脱以及目标分子的洗脱。
第二步：了解新冠疫苗的研制过程新冠疫苗的研制过程包括病原体鉴定、蛋白表达和纯化、动物实验、临床试验等。
其中，蛋白表达和纯化是关键步骤之一，而亲和色谱在蛋白纯化过程中发挥着重要作用。
第三步：亲和色谱在新冠疫苗纯化中的应用在新冠疫苗研制过程中，亲和色谱可以用于纯化病毒蛋白或疫苗候选分子。
以新冠病毒(SARS-CoV-2)的刺突蛋白为例，亲和色谱可以通过与特异性抗体结合，将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
这样可以提高目标蛋白的纯度，为后续的研究和生产提供高质量的材料基础。
第四步：确定亲和色谱方法的条件在亲和色谱中，参数的优化对于纯化效果至关重要。
选择适当的亲和基质和结合条件，如pH、温度等，可以提高目标蛋白的结合和纯化效率。
这需要经过一系列的实验和优化，确保获得高纯度的蛋白。
第五步：亲和色谱在新冠疫苗研究中的挑战和解决方案亲和色谱在新冠疫苗研究中也面临一些挑战，如选择合适的亲和基质、处理大规模样品等。
针对这些问题，科研人员可以根据具体情况选择最适合的亲和基质，如用于大规模纯化的亲和膜；同时，进行工艺优化，如缩短纯化时间、提高产量等，以应对规模化研制的需求。
第六步：亲和色谱在新冠疫苗研制中的其他应用除了蛋白纯化，亲和色谱在新冠疫苗研究中还有其他应用。
例如，可以利用亲和色谱技术筛选出与病毒结合的中和抗体，用于研发新冠疫苗；亲和色谱也可以用于检测新冠病毒的存在和浓度，以监测疫苗疗效。
亲和色谱名词解释
亲和色谱名词解释
亲和色谱（Affinity chromatography）是一种基于生物分子之间特异性相互作用的层析技术，用于分离和纯化特定的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖等。
亲和色谱依赖于亲和剂（affinity ligand）与目标分子之间的特异性相互作用。
亲和剂通常是一种高度特异性结合到目标分子的物质，可以是抗体、酶、亲和标靶蛋白等。
这种特异性相互作用可以是通过离子交换、亲水性、金属离子的配位、疏水性等作用机制实现的。
亲和色谱的原理是将亲和剂固定在固定相上，并将混合物溶液通过柱床进行层析分离。
由于亲和剂与目标分子之间的特异性相互作用，目标分子可以选择性地结合到亲和剂上，而其他非目标分子则通过柱床被洗脱。
最后，目标分子可以通过改变缓冲条件、温度或添加特定的竞争性配体等方式进行洗脱。
亲和色谱具有选择性高、纯度好、操作简单等优点。
它广泛应用于生物医学研究、药物开发、生物制药等领域，特别适用于从复杂的混合物中高效分离纯化目标分子。
亲和色谱知识简介
亲和色谱原理及其应用陕西科技大学职业技术学院生物化工工艺092班郝少杰20090305247摘要：亲和色谱也称为亲和层析，是液相色谱的一个分支，主要用于生物分子的分离、纯化和分析。
是利用生物分子，特别是生物大分子与亲和色谱固定相表面配位体之间，存在的生物学和生物化学过程的特效性亲和吸附作用，来进行选择性分离生物分子的分离方法。
至今，亲和色谱已在生物化学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、生物工程、临床医学、新型高效药物研究中，成为常规的分离、分析和制备的有效工具，并且在生物大分子的结构、功能研究中，成为一种普遍采用的方法。
关键词：亲和色谱，分离方法，纯化，普遍采用的方法。
一、亲和色谱的原理生物大分子（肽、蛋白质、核酸等）的一个共同特性，是它们具有以特有的高效方式去识别或键合到其他分子上的能力，这就使得所有的生物大分子，可借助亲和作用过程来进行分离和纯化。
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。
二、一般流程亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。
待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。
然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。
如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。
三、影响亲和色谱的因素1、上样体积若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。
若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。
2、柱长亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。
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4)．温度T T 使分子和原子的热运动，结合 中心的静电作用、氢键及金属配位 键，但可使疏水性作用。
5)．离子 SCN-，I-和ClO4-等半径较大的阴离 子能降低疏水相互作用。则这些离 子会降低Affinity。
6). 表面活性剂/乙二醇
7)．鳌合剂 如果Affinity源于亲和分子对与金属离子 形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸 EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使 Affinity消失。
Affinity。
许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱， 说明静电引力在Affinity中占有重要地位。
2)．pH 配体
配基
结合中心
在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是 非常重要的.
3).抑制氢键形成的物质
脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成. 因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐 酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。
是亲和技术与膜分离相结合的分离 纯化技术，是亲和层析的另一种变形.
优点(兼备亲和吸附与膜分离):
1st 亲和作用高选择性 + 不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增 大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。 使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析；
2nd 膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作;
吸附的影响因素
亲水性 目标产物
1st 离子强度
疏水性 目标产物
疏水性 杂蛋白
亲水性 杂蛋白
2nd 离子种类
3rd pH Value 4th 杂蛋白
亲和色谱洗脱
可控制的条件
1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质
4th 温度
5th 离子
SCN-，I-和ClO-
6th 乙二醇、丙三醇
孔径有很宽的分布范围，因此，单纯的超滤/ 微滤分离蛋白质等生物大分子的选择性很低，一 般只有当两种组分的分子量相差10倍以上时才有 可能得到完全分离。
办法:
亲和错流过滤(affinity cross-flow filtration) 亲和过滤(affinity filtration) 亲和超滤(affinity ultrafiltration)
3rd 制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物(如聚丙 烯酰胺)或无孔微粒(如聚合脂质体、纳米硅胶)，无内扩散传 质阻力，目标分子的亲和结合速度快，从而可最大程度地分 挥膜分离法速度快的优势.
4th 传统的亲和吸附介质(如琼脂糖凝胶)也可用做亲和过滤介质， 此时内扩散传质阻力可能成为分离操作的速度控制步骤。但 是，由于膜分离法易于放大，只要保证在吸附过程中目标分 子与亲和过滤介质有足够长的接触时间，利用较大的吸附接 触器仍可在较高的过滤速度下操作.
1 亲和膜过滤
传统亲和技术存在的问题: 1st 固定床型亲和层析利用多糖凝胶为
固定相，床层压降随流速线性增大； 由于软凝胶的机械强度较低，容易 发生压密现象(受压变形)，在较高压 力下，流速随压力提高而下降。因 此，利用软产胶为固定相的层析操 作速度有限.
2nd 用刚性粒子(如 硅胶)为固定相 虽然可通过增大 压力提高流速， 但高压操作势必 增大设备投资。
利用亲和膜的纯化方法又称
membrane-based
affinity
chromatography
亲和膜色谱
原理 优点 ➢ 传质阻力小, 达到吸附平衡的
时间短; ➢ 压降小，流速快，设备体积小，
配基用量低。 ➢ 膜介质种类多。 缺点 分离效率 膜污染
2 亲和错流过滤
超滤膜/微滤膜存在问题:
增大柱径
p不变 流速提高 分离速度提高
“短粗”型亲 和柱
为使分离速度达到极限 值，“理想”的层析柱几何形 状应该是柱高等于介质直径.
结果?
1 亲和膜过滤
结果 = 亲和膜
亲和膜吸附分离的原理
亲和膜(Affinity membrane)
利用亲和配基修饰的微滤膜为亲
和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，
是固定床亲和层析的变型。所以，
缺点: 单板性
目标分子与亲和过滤介质的接触在 全混槽中进行，最多只能达到一级吸附 平衡，相当于层析过程的一个塔板。这 一单板属性决定了其分离效率不如亲和 层析，特别是对于亲和常数小于 105dm3/mol的亲和体系.
7th 表面活性剂
8th 鳌合剂
EDTA鳌合剂除金属离子
９th 游离配基：如NAD, et al.
按选择性高分类 1st 非特异性洗脱(1-7) 2nd 特异性洗脱(8-9)
按洗脱方式分类
1st 线性洗脱 2nd stepwise洗脱(最常用）
亲和集成技术
1 亲和膜过滤 2 亲和错流过滤 3 亲和双水相分配 4 亲和反胶团萃取 5 亲和沉淀
亲和色谱
生物亲和作用 亲和色谱及原理 亲和色谱介质 亲和色谱过程分析及应用 其他亲和分离技术
主要内容
Affinity Chromatography
生物物质，特别是酶和抗体等蛋 白质，具有识别特定物质并与该物质 的分子相结合的能力。这种特异性相 互作用称为亲和作用。利用生物分子 间的这种特异性结合作用的原理进行 生物物质分离纯化的技术称为亲和纯 化技术，其代表为亲和层析法Affinity chromatography。
亲和作用结构特点
立体结构中含有某些亲和结合的部 位，这些呈陷或凸起部位恰好能够进 入与其发生亲和作用的分子的凹陷部 位，就象钥匙和锁孔的关系一样。蛋 白质分子表面的凹陷凸起部位与整个 蛋白质分子相比要小得多，如，IgG直 径一般为几纳米到十几纳米，而结合 部位的直径一般为1~2nm。
亲和作用的作用力
解决之道?
比较?
1 亲和膜过滤
设计比较:
柱高/直径 = 250/4.6
柱高/直径 = 200/252 = 0.794= 54Biblioteka 3Cu-IDA-Seph-
arose CL-6B φ252×200
IDA-Sepha-
rose CL-6B φ252×100
1 亲和膜过滤
. 如柱体积一定(即料液 处理能力一定) 降低柱高
具有“钥匙和锁孔”的关系是 产生亲和结合作用的必要条件， 但并不充分。除此之外，还需要 分子或原子水平的各种相互作用.
亲和作用的影响因素
1)．离子强度
如Affinity主要源于静电引力或氢键，则提高 I 无疑
会减弱或完全破坏Affinity。
疏水性作用随 I 提高而增大, 因此，当Affinity作用 主要源于疏水性相互作用时，增大 I 则可提高