8 亲和色谱

缺点: 单板性
目标分子与亲和过滤介质的接触在 全混槽中进行，最多只能达到一级吸附 平衡，相当于层析过程的一个塔板。这 一单板属性决定了其分离效率不如亲和 层析，特别是对于亲和常数小于 105dm3/mol的亲和体系.
4)．温度T T 使分子和原子的热运动，结合 中心的静电作用、氢键及金属配位 键，但可使疏水性作用。
5)．离子 SCN-，I-和ClO4-等半径较大的阴离 子能降低疏水相互作用。则这些离 子会降低Affinity。
6). 表面活性剂/乙二醇
7)．鳌合剂 如果Affinity源于亲和分子对与金属离子 形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸 EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使 Affinity消失。
具有“钥匙和锁孔”的关系是 产生亲和结合作用的必要条件， 但并不充分。除此之外，还需要 分子或原子水平的各种相互作用.
亲和作用的影响因素
1)．离子强度
如Affinity主要源于静电引力或氢键，则提高 I 无疑
会减弱或完全破坏Affinity。
疏水性作用随 I 提高而增大, 因此，当Affinity作用 主要源于疏水性相互作用时，增大 I 则可提高
7th 表面活性剂
8th 鳌合剂
EDTA鳌合剂除金属离子
９th 游离配基：如NAD, et al.
按选择性高分类 1st 非特异性洗脱(1-7) 2nd 特异性洗脱(8-9)
按洗脱方式分类
1st 线性洗脱 2nd stepwise洗脱(最常用）
亲和集成技术
1 亲和膜过滤 2 亲和错流过滤 3 亲和双水相分配 4 亲和反胶团萃取 5 亲和沉淀
3rd 制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物(如聚丙 烯酰胺)或无孔微粒(如聚合脂质体、纳米硅胶)，无内扩散传 质阻力，目标分子的亲和结合速度快，从而可最大程度地分 挥膜分离法速度快的优势.
4th 传统的亲和吸附介质(如琼脂糖凝胶)也可用做亲和过滤介质， 此时内扩散传质阻力可能成为分离操作的速度控制步骤。但 是，由于膜分离法易于放大，只要保证在吸附过程中目标分 子与亲和过滤介质有足够长的接触时间，利用较大的吸附接 触器仍可在较高的过滤速度下操作.
增大柱径
p不变 流速提高 分离速度提高
“短粗”型亲 和柱
为使分离速度达到极限 值，“理想”的层析柱几何形 状应该是柱高等于介质直径.
结果?
1 亲和膜过滤
结果 = 亲和膜
亲和膜吸附分离的原理
亲和膜(Affinity membrane)
利用亲和配基修饰的微滤膜为亲
和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，
是固定床亲和层析的变型。所以，
利用亲和膜的纯化方法又称
membrane-based
affinity
chromatography
亲和膜色谱
原理 优点 ➢ 传质阻力小, 达到吸附平衡的
时间短; ➢ 压降小，流速快，设备体积小，
配基用量低。 ➢ 膜介质种类多。 缺点 分离效率 膜污染
2 亲和错流过滤
超滤膜/微滤膜存在问题:
Affinity。
许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱， 说明静电引力在Affinity中占有重要地位。
2)．pH 配体
配基
结合中心
在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是 非常重要的.
3).抑制氢键形成的物质
脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成. 因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐 酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。
亲和作用结构特点
立体结构中含有某些亲和结合的部 位，这些呈陷或凸起部位恰好能够进 入与其发生亲和作用的分子的凹陷部 位，就象钥匙和锁孔的关系一样。蛋 白质分子表面的凹陷凸起部位与整个 蛋白质分子相比要小得多，如，IgG直 径一般为几纳米到十几纳米，而结合 部位的直径一般为1~2nm。
亲和作用的作用力
孔径有很宽的分布范围，因此，单纯的超滤/ 微滤分离蛋白质等生物大分子的选择性很低，一 般只有当两种组分的分子量相差10倍以上时才有 可能得到完全分离。
办法:
亲和错流过滤(affinity cross-flow filtration) 亲和过滤(affinity filtration) 亲和超滤(affinity ultrafiltration)
亲和色谱
生物亲和作用 亲和色谱及原理 亲和色谱介质 亲和色谱过程分析及应用 其他亲和分离技术
主要内容
Affinity Chromatography
生物物质，特别是酶和抗体等蛋 白质，具有识别特定物质并与该物质 的分子相结合的能力。这种特异性相 互作用称为亲和作用。利用生物分子 间的这种特异性结合作用的原理进行 生物物质分离纯化的技术称为亲和纯 化技术，其代表为亲和层析法Affinity chromatography。
解决之道?
比较?
1 亲和膜过滤
设计比较:
柱高/直径 = 250/4.6
柱高/直径 = 200/252 = 0.794
= 54.3
Cu-IDA-Seph-
arose CL-6B φ252×200
IDA-Sepha-
rose CL-6B φ252×100
1 亲和膜过滤
. 如柱体积一定(即料液 处理能力一定) 降低柱高
是亲和技术与膜分离相结合的分离 纯化技术，是亲和层析的另一种变形.
优点(兼备亲和吸附与膜分离):
1st 亲和作用高选择性 + 不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增 大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。 使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析；
2nd 膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作;
1 亲和膜过滤
传统亲和技术存在的问题: 1st 固定床型亲和层析利用多糖凝胶为
固定相，床层压降随流速线性增大； 由于软凝胶的机械强度较低，容易 发生压密现象(受压变形)，在较高压 力下，流速随压力提高而下降。因 此，利用软产胶为固定相的层析操 作速度有限.
2nd 用刚性粒子(如 硅胶)为固定相 虽然可通过增大 压力提高流速， 但高压操作势必 增大设备投资。
吸附的影响因素
亲水性 目标产物
1st 离ห้องสมุดไป่ตู้强度
疏水性 目标产物
疏水性 杂蛋白
亲水性 杂蛋白
2nd 离子种类
3rd pH Value 4th 杂蛋白
亲和色谱洗脱
可控制的条件
1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质
4th 温度
5th 离子
SCN-，I-和ClO-
6th 乙二醇、丙三醇