第03章抗体制备

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免疫学概论第4章抗体PPT课件

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• 抗体的概述 • 抗体的结构 • 抗体的产生与类别 • 抗体的应用 • 总结与展望
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抗体的概述
抗体的定义
抗体（Antibody）：指B淋巴细胞或记忆B细胞在抗原刺激下，经一系列活化、增殖、分化后形成的浆细胞分泌出来的一类能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。
免疫调节
抗体可调节机体免疫应答，用于治疗免疫相关疾病，如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。
被动免疫
将含有抗体的免疫血清或免疫球蛋白注入机体，使机体获得特异性免疫力。
抗体在免疫学研究中的应用
01
02
03
抗原定位
通过抗体标记抗原，研究抗原在细胞或组织中的定位和分布。
免疫细胞功能研究
抗体可用来研究免疫细胞的活化、分化、凋亡等过程，有下产生的一种蛋白质，具有高度的特异性，能够与相应的抗原结合，发挥免疫效应。
抗体的类型
IgG
IgM
IgA
IgE
免疫球蛋白G，是血清中含量最高的抗体类型，也是唯一能够通过胎盘的抗体类型。它具有抗菌、抗病毒、抗毒素等作用，是机体重要的防御机制。
免疫球蛋白M，是初次免疫应答中最早产生的抗体类型，主要存在于血液中。它具有抗菌、抗病毒、抗毒素等作用，但效价较低。
疾病的抗体药物，提高治疗效果和降低副作用。
03
免疫治疗和免疫调控
抗体在免疫治疗和免疫调控方面具有广阔的应用前景，未来将进一步探
索其在肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等领域的应用。
THANKS
感谢观看
合物，进而发挥免疫效应。
激活补体
抗体能够与抗原结合后激活补体系统，通过补体的级联反应，发挥溶解和杀伤作用。

03第三章抗原09-1

附：第二节超抗原和有丝分裂原
一、超抗原
（一）超抗原的概念
某些抗原物质，只需极低浓度即可激活2 20% 某些抗原物质，只需极低浓度即可激活 2% ～ 20% 的 T 细胞克隆，或激活大量的B细胞克隆，产生极强的应答效应，克隆，或激活大量的B细胞克隆，产生极强的应答效应，这类抗原称为超抗原（ antigen，SAg）这类抗原称为超抗原（super antigen，SAg）。
（三）根据抗原的来源分类
antigen） 1．外源性抗原（exogenous antigen）外源性抗原（并非由抗原提呈细胞合成、来源于细胞外的抗原。并非由抗原提呈细胞合成、来源于细胞外的抗原。此类抗原被APC 吞噬，加工为抗原短肽， APC吞噬分子结合，类抗原被 APC 吞噬，加工为抗原短肽，与 MHC-II分子结合，分子结合提呈至APC表面，被CD4+T细胞表面，细胞TCR识别。识别。提呈至表面细胞识别 antigen） 2．内源性抗原（endogenous antigen）内源性抗原（抗原提呈细胞内新合成的抗原。抗原提呈细胞内新合成的抗原。此类抗原在细胞内被加工处理，分子结合，工处理，与MHC-I分子结合，提呈至细胞表面，被CD8+T细分子结合提呈至细胞表面，细识别。胞TCR识别分子的大小密切相关，免疫原性与分子的大小密切相关，凡具有免疫原性的物质，分子量常大于10KDa。 10KDa KDa者的物质，分子量常大于 10KDa 。分子量小于 5KDa 者，一般免疫原性很弱；分子量在1KDa以下的为半抗原以下的为半抗原。般免疫原性很弱；分子量在1KDa以下的为半抗原。
（四）抗原的类属性（交叉性）抗原的类属性（交叉性）

单克隆抗体技术讲解

三、单克隆抗体技术的应用
克隆化过程
单克隆抗体的制取
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合
选择性培养
抗体分泌细胞的筛选
四、单克隆抗体制备过程
1.致敏淋巴细胞的准备动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式—体内、体外剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定间隔—视抗原而定佐剂—视抗原而定收集时间：末次接种后72 h 2.骨髓瘤细胞的准备细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态 HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病手口足病癌症亚急性湿疹
用于诊断鉴定人的血型类别用于寻常型银屑病亚急性湿疹用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤犬瘟热病毒单克隆抗体单克隆抗体药物
一、单克隆抗体技术发展
Georges J.F. Kohler Cesar Milstein 1975年将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合, 成功建立了单克隆抗体技术。 1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。
第四章抗体工程制药第三节单克隆抗体的制备
Annual Work Summary Report
汇报人 | 小智
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2.单克隆抗体的概念和特点
3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
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主要内容
固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高
1.检验医学诊断（1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸（5）细胞因子的测定（6）其他：吗啡类毒品检测试纸等 2.蛋白质的提纯 3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术

生化药物制备第三章、动物细胞工程制药

行分离纯化。
1
超滤系统
通过超滤膜过滤去除杂质，浓缩目标产物。
离心机
进一步分离纯化细胞和细胞器。
冻干机
用于制备干粉制剂，保护药物活性成分。
制剂生产设备
01
灌装机
将药液灌装到安瓿、西林瓶等包装容器中。
贴标机
在包装容器上贴上标签，标明药品信息。
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02
封口机
对灌装好的包装容器进行封口，保证密封性。
针对所选细胞系，筛选和优化培养基成分，以满足细胞生长和产物表达的需求。
细胞培养条件控制
对细胞培养过程中的温度、pH值、溶解氧等关键参数进行严格控制，确保细胞正常生长和增殖。
细胞扩增技术
采用适当的细胞扩增技术，如微载体培养、流加培养等，实现细胞的大规模扩增。
中游工艺：目标产物分离纯化
收获与预处理
随着精准医疗的发展，动物细胞工程制药将更加注重个性化治疗
药物的研发和生产。
03
监管政策日益严格
面对不断加强的药品监管政策，企业需要加强质量管理体系建设
，确保产品质量和安全。
02
新技术不断涌现
基因编辑、细胞重编程等新技术将为动物细胞工程制药带来更多
创新机遇。
04
国际合作与竞争并存
加强国际合作，学习借鉴国际先进经验和技术，同时积极应对国
05 动物细胞工程制药设备与设施
细胞培养设备
生物反应器
用于大规模培养动物细胞，提供恒定的温度、pH值、溶解氧等条件。
离心机
用于细胞分离、沉淀和洗涤等操作。
培养箱
提供细胞生长所需的恒温、恒湿、无菌环境。
显微镜
观察细胞生长状态和形态变化。

03 第三章 t检验2013

• 问不同饲料组的大白鼠肝中维生素A含量有无差别？
表3-1 对子号 1 2 3 4 5 6 7 8 合计
不同饲料组大白鼠肝中维生素A含量 ( m ol/ g ) 正常组 VE缺乏组 3.72 2.57 2.09 2.51 3.14 1.88 4.14 3.35 3.98 3.40 3.93 2.83 3.61 2.62 3.19 1.83 d 1.15 -0.42 1.26 0.79 0.58 1.10 0.99 1.36 6.81 d的平方 1.3225 0.1764 1.5876 0.6241 0.3364 1.2100 0.9801 1.8496 8.0867
X t / 2, S X
有样本计算的置信区间（3.13，3.41）kg，已知总体被包含在置信区间内，可认为：该地农村新生儿出生体重与该地新生儿平均出生体重相同。
置信区间法（单侧） μ0=3.36kg n=40 x =3.27kg s=0.44kg
X t , S X
有样本计算的置信区间（？）kg，已知总体被包含在置信区间内，可认为：该地农村新生儿出生体重与该地新生儿平均出生体重相同。
t
X 0 S n
例
已知某地新生儿出生体重均数为3.36kg。从该地农村随机抽取 40 名新生儿，测得其平均体
重为3.27kg，标准差为0.44kg，
问该地农村新生儿出生体重是否与该地新生儿平均出生体重不同？
双侧检验
（1）建立检验假设，确定检验水准
H0 ： μ ＝ 3.36 ，即该地农村新生儿出生体重与该地
（1）建立检验假设，确定检验水准
H0：μ＝3.36，即该地农村新生儿出生体重与
该地新生儿平均出生体重相同；
H1：μ≠3.36，即该地农村新生儿出生体重与

2.2-2 动物细胞工程——动物细胞融合技术与单克隆抗体-高二生物课件(人教版2019选择性必修3)

课后习题·拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题? 解决这些问题的大致思路是怎样的?这样做会有什么风险?请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 ↓
细胞膜被病毒颗粒穿通 ↓
细胞膜连接 ↓
细胞核融合，形成杂交细胞
相关信息
灭活病毒诱导细胞融合的原理
病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
➢ 请同学们看图对比动物和植物细胞融合的异同：
二、单克隆抗体及其应用
1.单克隆抗体的优点
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
二、单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体的应用
（1）作为诊断试剂——最广泛的应用
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
第一次筛选置于选择性培养基上培养
多种杂交瘤细胞
1
2
3
杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体制备过程
克隆化培养
多种杂交瘤细胞
第二次筛选抗体检测 (抗原-抗体杂交技术)
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
阳性细胞
二、单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体制备过程
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞

03第三章消毒与灭菌

分类：第一类：低温维持巴氏消毒法，在63-65℃保持 30min。
第二类：高温瞬时巴氏消毒法，在71-72℃保持15s。
第三类：超高温巴氏消毒法，在132℃ 保持1-2s。
加热消毒后需迅速冷却至10 ℃以下，称为冷击。
3）流通蒸汽灭菌法：利用蒸汽在蒸笼或流通蒸汽灭菌器内进行灭菌的方法，也称间歇灭菌法。灭菌后需保温过夜再灭菌，以达到完全灭菌的目的。
髓、尾鞘、尾板、尾刺、尾丝组成。
不同的噬菌体示意图
（二）抗原性及抵抗力 1、抗原性：能刺激机体产生特异性抗体。
特性：该抗体能抑制相应噬菌体侵袭敏感细菌，但对已吸附或已进入宿主菌的噬菌体不起作用。 2、抵抗力：对理化因素的抵抗力较强，较耐热、耐低温和冰冻，但对紫外线和Ｘ射线敏感；大多数能抵抗乙醚、氯仿和乙醇，在 0.5%升汞或苯酚中经3—7天不丧失活性。在饱和NaCl溶液中保持活力数年。
可见光线对微生物一般无多大影响，但长时间作用也能妨碍微生物的新陈代谢与繁殖，故培养细菌和保存菌种，均应置于阴暗处。（二）阳光：直射日光有强烈的杀菌作用，紫外线是日光杀菌作用的主要因素。
（三）紫外线：紫外线中波长200-300nm部分具有杀菌作用，以265-266nm波长段的杀菌力最强。一般实验室常用253.7nm，杀菌力强而稳定，照射1015min即可。特点：穿透力很差，即使是很薄的玻璃也不能透过。适用范围：常用于微生物实验室、无菌室、手术室、传染病房、种蛋室等的空气消毒，或用于不能用高温或化学药品消毒的物品表面消毒。
二、消毒剂的种类及其应用
消毒剂的种类很多，一般可根据用途与消毒剂特点选择使用。理想的消毒剂杀菌力强、无腐蚀性、能长期保存、对动物毒性很小、无残留污染、价格低等。消毒剂的分类（1）使菌体蛋白质变性如酚类、醇类、重金属盐类、酸碱类、醛类；（2）损伤胞浆膜如酚类(低浓度)、表面活性剂、醇类等脂溶剂；

小麦DREB4蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(３):９~１４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０３.００２收稿日期:２０２２－０６－２８基金项目:山东省农业良种工程项目(２０１９ＬＺＧＣ０１７０２)ꎻ山东省自然科学基金青年项目(ＺＲ２０２０ＱＣ１１４)ꎻ国家自然科学基金青年项目(３２００１５４２)ꎻ山东省农业良种工程项目(２０２１ＬＺＧＣ０１３)ꎻ小麦玉米国家工程实验室开放课题(２０１８ＬＹＺＷＳ０６)作者简介:李永波(１９８６ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｂ９２０３２７＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ通信作者:樊庆琦(１９８０ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｆａｎｑｉｎｇｑｉ＠１６３.ｃｏｍ楚秀生(１９６３ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｘｓｃｈｕ２００７＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备李永波１ꎬ鲁琳１ꎬ方会见２ꎬ崔德周１ꎬ孟福燕３ꎬ黄琛１ꎬ隋新霞１ꎬ樊庆琦１ꎬ楚秀生１ꎬ４(１.山东省农业科学院作物研究所/黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/山东省小麦技术创新中心/济南市小麦遗传改良重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东鲁研良种有限公司ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.郓城县种子公司ꎬ山东郓城㊀２７４７００ꎻ４.烟台大学生命科学学院ꎬ山东烟台㊀２６４０００)㊀㊀摘要:ＤＲＥＢ(ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ)转录因子在小麦非生物胁迫中起着非常重要的作用ꎬ但由于目前缺乏可识别小麦内源性ＤＲＥＢ蛋白的抗体ꎬ导致其在蛋白水平上的研究进展非常缓慢ꎮ本研究通过分析ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ三种蛋白序列ꎬ将ＤＲＥＢ４Ａ在大肠杆菌中进行表达ꎬ并利用纯化后的蛋白作为抗原免疫兔子ꎬ在国内外首次获得小麦ＤＲＥＢ４的多克隆抗体ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证明ꎬ该抗体可特异性识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白ꎮ该抗体介导的免疫组织化学结果显示ꎬＤＲＥＢ４蛋白定位于细胞核内ꎮ本研究为深入研究植物ＤＲＥＢ信号通路提供了有力的检测工具ꎮ关键词:小麦ꎻ非生物胁迫ꎻＤＲＥＢ４转录因子ꎻ多克隆抗体中图分类号:Ｓ５１２.１:Ｑ７８６㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０３－０００９－０６ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＤＲＥＢ４ＰｒｏｔｅｉｎＬｉＹｏｎｇｂｏ１ꎬＬｕＬｉｎ１ꎬＦａｎｇＨｕｉｊｉａｎ２ꎬＣｕｉＤｅｚｈｏｕ１ꎬＭｅｎｇＦｕｙａｎ３ꎬＨｕａｎｇＣｈｅｎ１ꎬＳｕｉＸｉｎｘｉａ１ꎬＦａｎＱｉｎｇｑｉ１ꎬＣｈｕＸｉｕｓｈｅｎｇ１ꎬ４(１.ＣｒｏｐＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＨｕａｎｇ￣ＨｕａｉＲｉｖｅｒＰｌａｉｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＷｈｅａｔ/ＪｉｎａｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｈａｎｄｏｎｇＬｕｙａｎＳｅｅｄＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＹｕｎｃｈｅｎｇＣｏｕｎｔｒｙＳｅｅｄＣｏｍｐａｎｙꎬＹｕｎｃｈｅｎｇ２７４７００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａｎｔａｉ２６４０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤＲＥＢ(ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｂｉｎｄｉｎｇ)ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｐｌａｙｓａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｗｈｅａｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｄｕｅｔｏｔｈｅｌａｃｋｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｈａｔｃａｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｗｈｅａｔｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＲＥＢｐｒｏｔｅｉｎꎬｉｔｓｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓａｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｉｓｖｅｒｙｓｌｏｗ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｒｅｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＤＲＥＢ４Ａꎬ４Ｂａｎｄ４ＣꎬｔｈｅＤＲＥＢ４ＡｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉꎬａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄａｓａｎａｎｔｉｇｅｎｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅｒａｂｂｉｔｓꎬｔｈｅｎｔｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｗｈｅａｔＤＲＥＢ４ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ.ＴｈｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｕｌｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｗｈｅａｔｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＤＲＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎ.Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＤＲＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅａｐｏｗｅｒｆｕｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｏｏｌｆｏｒｉｎ￣ｄｅｐｔｈｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｐｌａｎｔＤＲＥＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＷｈｅａｔꎻＡｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓꎻＤＲＥＢ４ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻＰｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ㊀㊀干旱㊁盐㊁高温㊁冷等各种非生物胁迫会严重影响小麦产量ꎮＤＲＥＢ蛋白含有一个保守的ＡＰ２结构域ꎬ可以和顺式作用元件ＤＲＥ核心序列(Ａ/ＧＣＣＧＡＣ)发生特异性结合ꎬ通过在转录水平上调控下游基因的表达[１]ꎬ进而应对各种非生物胁迫ꎮ到目前为止ꎬＤＲＥＢ转录因子在拟南芥[２]㊁大豆[３]㊁水稻[４]㊁玉米[５]㊁大麦[６]和小麦[７]等多种植物中被鉴定出来ꎮＤＲＥＢ分为六大类(ＤＲＥＢ１~６)[８]ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ１在拟南芥㊁水稻㊁玉米中主要应答冷胁迫[４]ꎬＤＲＥＢ２主要应答干旱㊁盐胁迫[９]ꎬＤＲＥＢ３参与ＡＢＡ和糖信号途径[１０]ꎬＤＲＥＢ４应答干旱㊁冷胁迫及在乙烯与茉莉酸途径中起作用[１１]ꎬＤＲＥＢ５参与应答干旱㊁冷胁迫[１２]ꎬＤＲＥＢ６应答干旱㊁盐胁迫[１３]ꎮ大量研究已验证了ＤＲＥＢ在植物应对非生物胁迫中的功能ꎮ如在小麦中过表达拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ㊁大豆ＧｍＤＲＥＢ１或棉花ＧｈＤＲＥＢ基因ꎬ可通过提高根系活力㊁光合作用及渗透调节能力提高小麦的抗旱性[１４－１６]ꎻ在拟南芥中过表达大豆ＧｍＤＲＥＢ２㊁ＧｍＤＲＥＢ３或小麦ＴａＤＲＥＢ３基因ꎬ可提高拟南芥抗旱㊁耐盐㊁耐高温及抗冻性[１ꎬ１７ꎬ１８]ꎻ过表达ＧｍＤＲＥＢ６基因ꎬ可增强大豆的耐盐能力[１９]ꎮ然而ꎬ目前几乎所有关于ＤＲＥＢ的研究是集中在转录水平上的调控ꎬ缺乏蛋白质水平上的调控研究ꎬ且ＤＲＥＢ蛋白发挥生物学功能是否通过磷酸化㊁乙酰化等蛋白水平上的调控尚未可知ꎬ因此ꎬ研究识别内源性ＤＲＥＢ蛋白的特异性多克隆抗体ꎬ对于ＤＲＥＢ在蛋白水平的调控研究具有非常重要的意义ꎮ本研究通过对小麦中已有的ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ进行序列分析ꎬ选取ＤＲＥＢ４Ａ进行原核表达㊁纯化ꎬ并以其作为抗原ꎬ首次制备出可识别小麦内源ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎬ以期为进一步研究植物ＤＲＥＢ４在蛋白水平上的调控机理提供方法学基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试小麦品种为济麦３７９ꎬ由山东省审定(鲁审麦２０２１００１７)ꎮ取其幼苗期根㊁叶为材料进行试验ꎮ１.２㊀ＤＲＥＢ４序列分析与合成本研究通过ＤＮＡＭＡＮ８软件对ＮＣＢＩ中提交的ＤＲＥＢ４Ａ(ＡＹ７８１３５４.１)㊁４Ｂ(ＡＹ７８１３５５.１)和４Ｃ(ＡＹ７８１３５６.１)序列进行分析ꎻＤＲＥＢ４Ａ序列的合成由北京擎科生物科技有限公司进行ꎮ１.３㊀ＤＲＥＢ４Ａ载体构建、原核表达及纯化将上述合成的ＤＲＥＢ４Ａ序列与大肠杆菌表达载体ＰＥＴ３０ａ通过同源重组的方法(ｐＥＡＳＹ®－ＢａｓｉｃＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔꎬＣＵ２０１－０２ꎬ北京全式金生物技术股份有限公司)连接ꎬ将连接产物转入ＤＨ５α(北京擎科生物科技有限公司)感受态细胞中ꎬ冰上放置１５ｍｉｎꎬ４２ħ水浴热激９０ｓꎬ再冰上放置２ｍｉｎꎬ加入１ｍＬ无任何抗生素的ＬＢ液体培养基ꎬ３７ħ㊁２１０ｒ/ｍｉｎ水平摇１ｈꎬ然后取１００μＬ菌液ꎬ涂于含有卡那霉素的ＬＢ固体培养基上ꎬ３７ħ过夜培养ꎮ挑取１０个单克隆进行ＰＣＲ检测ꎬ选取２个阳性信号最强的单克隆由北京擎科生物科技有限公司进行测序ꎬ对测序正确的单克隆进行摇菌㊁质粒提取(质粒小提试剂盒ꎬＤＰ１０３ꎬ北京天根生化科技有限公司)ꎮ将提取好的质粒转入ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞(ＣＤ７０１－０２ꎬ北京全式金生物技术股份有限公司)中ꎬ剩余步骤同ＤＨ５α感受态细胞转化ꎮ挑单克隆ꎬ置于５ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ过夜培养ꎬ然后吸取１ｍＬ菌液ꎬ加入到３００ｍＬＬＢ液体培养基中进行扩大培养ꎬ待菌液ＯＤ值为０.６~０.８时ꎬ加入终浓度为５０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ(Ｇ５０４２－１Ｇꎬ武汉塞维尔生物科技有限公司)进行诱导表达ꎬ２８ħ过夜培养ꎻ菌液于６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ收集菌体沉淀ꎬ用１ˑＰＢＳ(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ)清洗沉淀１次ꎬ然后加入４０ｍＬ１ˑＰＢＳ重悬ꎬ超声破碎(开３ｓꎬ关３ｓꎻ共计３０ｍｉｎ)ꎬ６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ分别将沉淀㊁上清液进行ＳＤＳ电泳检测ꎮ利用Ｈｉｓ标签蛋白纯化试剂盒(Ｐ２２２６ꎬ上海碧云天生物技术有限公司)对上清液进行纯化ꎬ然后置于透析袋中４ħ过夜透析ꎬ将透析后的蛋白置于０１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀－２０ħ保存备用ꎮ１.４㊀小麦ＤＲＥＢ４多克隆抗体制备选取实验级日本大耳白兔和新西兰大白兔各１只ꎬ饲养体重至１~２ｋｇ时ꎬ用注射器将充分混匀的１ｍＬ完全弗氏佐剂(液体石蜡ʒ羊毛脂＝２ʒ１)和０.３ｍｇＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第１针ꎬ标记为第１天ꎻ第１２天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂(完全弗氏佐剂＋终浓度２０ｍｇ/ｍＬ的卡介苗)和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行皮下注射第２针ꎻ第２６天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第３针ꎻ第４０天ꎬ将充分混匀的１ｍＬ不完全弗氏佐剂和０.１５ｍｇ融合蛋白对每只兔子进行肌肉注射第４针ꎻ第５３天ꎬ取兔子血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证ꎮ１.５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析利用植物组织蛋白裂解液提取小麦幼苗期根㊁叶部的总蛋白(植物蛋白提取试剂盒ꎬＣＷ０８８５ꎬ康为世纪生物技术有限公司)ꎬ配制１５％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳ꎻ通过湿法转膜ꎬ将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上ꎬ然后将膜放入含有２％脱脂奶粉的ＴＢＳ(２５ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌꎬ１３７ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)中ꎬ封闭１ｈꎻ加入ＤＲＥＢ４多克隆抗体(１ʒ１０００稀释于２％脱脂奶粉中)ꎬ４ħ过夜ꎻ用ＴＢＳＴ(ＴＢＳ＋２０％吐温－２０)洗涤３次后ꎬ向封闭液中加入碱性磷酸酶(ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅꎬＡＰ)标记的二抗ꎬ缓慢摇动２４ｈꎬ然后ＴＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎻ最后用发色液(ＴＢＳ１０ｍＬꎬ５％ＮＢＴ４５μＬꎬ５％ＢＣＩＰ３５μＬ)进行发色ꎮ１.６㊀免疫组织化学法进行亚细胞定位将小麦叶片下表皮撕下ꎬ置于４％多聚甲醛中ꎬ室温放置２４ｈꎬ弃掉多聚甲醛ꎬ用１ˑＰＢＳ清洗３次ꎬ加入２％脱脂奶粉于３７ħ封闭３０ｍｉｎꎬ然后在４ħ下加入ＤＲＥＢ４多克隆抗体(１ʒ２００稀释于２％脱脂奶粉中)过夜ꎻ用ＰＢＳ洗涤３次后ꎬ加入１μＬ二抗(山羊抗兔－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗体)和１０ｍＬＢＳＡꎬ３７ħ继续孵育１ｈꎬ然后用ＴＢＳ清洗３次ꎬ在室温下用４ᶄꎬ６－二脒基－２－苯基吲哚(ＤＡ￣ＰＩꎬＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ.ꎬＳａｎＪｏｓｅꎬＣＡꎬＵＳＡ)染色１０ｍｉｎꎬ然后用ＴＢＳ清洗３次ꎬ置于荧光显微镜(ＨＴ７７００ꎬＨｉｔａｃｈｉꎬＴｏｋｙｏꎬＪａｐａｎ)下观察并拍照ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀小麦ＤＲＥＢ４序列分析在普通小麦中ꎬＤＲＥＢ４存在ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ㊁４Ｃ三种转录本ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ａ编码３９４个氨基酸ꎬ分子量为４２.８ｋＤａꎻＤＲＥＢ４Ｂ编码３４６个氨基酸ꎬ分子量为３７.７ｋＤａꎻＤＲＥＢ４Ｃ编码６８个氨基酸ꎬ分子量为７.１ｋＤａ(图１)ꎮ三个蛋白氨基酸序列的保守性为６１.２８％ꎬ第１~２５位的氨基酸完全一致ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ｂ除第２６~７３位氨基酸缺失外ꎬ其它位置的氨基酸与ＤＲＥＢ４Ａ完全一致ꎮＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ存在序列间的差异ꎬ可能是应对不同非生物胁迫产生的可变剪切所致ꎮ图中深蓝色区域为保守区域ꎮ图１㊀普通小麦ＤＲＥＢ４Ａ、４Ｂ和４Ｃ的氨基酸序列分析２.２㊀小麦ＤＲＥＢ４Ａ的原核表达鉴于ＤＲＥＢ４Ａ的氨基酸序列最长ꎬ选其进行后续分析ꎮ首先ꎬ将人工合成的ＤＲＥＢ４Ａ序列与表达载体ＰＥＴ３０ａ连接后ꎬ在大肠杆菌中进行表达ꎬ上清液中的蛋白纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测ꎮ结果显示ꎬ在大约５０ｋＤａ处出现清晰的蛋白条带(图２)ꎬ与预期的蛋白分子量相符ꎬ表明ＤＲＥＢ４Ａ成功表达ꎮ１１㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李永波ꎬ等:小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备图２㊀小麦ＤＲＥＢ４Ａ的原核表达及纯化２.３㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体的制备本研究以上述获得的纯化ＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白为抗原免疫兔子ꎬ从兔血清中获取了ＤＲＥＢ４多克隆抗体ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示ꎬ该抗体在目的蛋白位置清楚地识别到ＤＲＥＢ４Ａ蛋白(图３)ꎮ图３㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体对ＤＲＥＢ４Ａ融合蛋白的识别２.４㊀ＤＲＥＢ４多克隆抗体对小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的识别及特异性检测为了进一步验证该抗体能否识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白ꎬ分别提取小麦苗期根㊁叶总蛋白进行免疫识别ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示ꎬ仅在３７ｋＤａ处检测到清晰的蛋白条带ꎬ这与预测的ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白分子量一致(图４)ꎮ表明该抗体可以识别小麦内源性ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白ꎬ而且特异性好ꎬ可以用于后续植物ＤＲＥＢ分子机理的相关研究ꎮ图４㊀小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白检测２.５㊀ＤＲＥＢ４亚细胞定位分析ＤＲＥＢ４定位于细胞核中(图５)ꎬ与前人报道的ＤＲＥＢ转录因子核定位的结果一致[２０]ꎬ进一步证实了该抗体特异性较好ꎬ可用于开展免疫组织或细胞化学研究的可行性ꎮ对照为前血清ꎮ图５㊀利用免疫组织化学法进行的㊀㊀㊀ＤＲＥＢ４亚细胞定位分析结果３㊀讨论与结论ＤＲＥＢ是一类抗非生物胁迫的转录因子ꎬ目前主要用于抗逆转基因植物的培育及相关分子机理的解析[２１]ꎮ小麦ＤＲＥＢ４蛋白是一种对动物和人类无危害的蛋白ꎬ将其用于粮食作物抗逆性转基因改良有着广阔的市场前景[２２]ꎮＤＲＥＢ４在小麦中存在三种转录形式(ＤＲＥＢ４Ａ㊁４Ｂ和４Ｃ)[２３]ꎬ其中ꎬＤＲＥＢ４Ａ编码的多肽链最长ꎬ涵盖的蛋白信２１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀息最丰富ꎬ推测由此蛋白作为抗原产生的抗体可识别ＤＲＥＢ４的所有三种形式ꎬ因此本研究利用ＤＲＥＢ４Ａ蛋白作为抗原ꎬ进行了ＤＲＥＢ４多克隆抗体的制备ꎮ经过抗原上清蛋白的纯化㊁免疫注射ꎬ最终研制出能识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎮ尽管从植物中已克隆出多种类型的ＤＲＥＢ基因ꎬ但由于其抗体类型匮乏以及识别内源性蛋白抗体的空白ꎬ导致有关ＤＲＥＢ在蛋白水平上的调控机理研究进展相对缓慢ꎮ目前ꎬ只有拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ的抗体制备成功ꎬ且仅对大肠杆菌中表达的拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ融合蛋白进行了检测[２４]ꎮ本研究首次开发了特异性识别小麦内源ＤＲＥＢ４蛋白的多克隆抗体ꎬ既丰富了植物ＤＲＥＢ的抗体类型ꎬ也为进一步推动ＤＲＥＢ在蛋白水平上的研究提供了方法学基础ꎮ利用本研究制备的ＤＲＥＢ４多克隆抗体检测小麦苗期根㊁叶内源性ＤＲＥＢ４蛋白时ꎬ仅识别到了ＤＲＥＢ４Ｂ蛋白条带ꎬ与预测的该抗体能识别小麦中ＤＲＥＢ４三种蛋白形式的结果不一致ꎬ这可能是因为ＤＲＥＢ４具有组织器官以及不同发育阶段表达特异性ꎬ在小麦苗期根㊁叶中主要以ＤＲＥＢ４Ｂ的形式表达ꎬ而在花㊁籽粒等其它组织器官以及不同发育阶段中则以其它形式表达ꎻ另外ꎬＤＲＥＢ４在不同小麦品种中的表达形式也可能存在一定的差异ꎬ本研究所用小麦品种济麦３７９为抗旱节水型品种ꎬ在其苗期根㊁叶中主要以ＤＲＥＢ４Ｂ的形式表达ꎬ但在其它类型的小麦品种中以哪种形式表达还有待进一步研究ꎮ传统ＤＲＥＢ基因亚细胞定位是采用构建ＤＲＥＢ－ＧＦＰ过表达载体转入组织或细胞中的方法进行定位[２０]ꎬ而本研究是利用该抗体对内源ＤＲＥＢ４进行免疫定位ꎬ与传统方法相比可避免因过表达造成目的蛋白移位的现象ꎮ综上所述ꎬ本研究通过对ＤＲＥＢ４Ａ进行大肠杆菌表达㊁纯化ꎬ并以此作为抗原成功制备出可识别小麦内源性ＤＲＥＢ４蛋白的高度特异性多克隆抗体ꎬ可为深入研究植物ＤＲＥＢ４在蛋白水平上参与非生物胁迫的调控机理奠定方法学基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＮｉｕＸꎬＬｕｏＴꎬＺｈａｏＨꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｅａｔＤＲＥＢｇｅｎｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴａＤＲＥＢ３ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ２０２０ꎬ７４０:１４４５１４. [２]㊀ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒＥＪꎬＧｉｌｍｏｕｒＳＪꎬＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ.ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣＢＦ１ｅｎｃｏｄｅｓａｎＡＰ２ｄｏｍａｉｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｔｈａｔｂｉｎｄｓｔｏｔｈｅＣ￣ｒｅｐｅａｔ/ＤＲＥꎬａｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇＤＮＡｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｔｈａｔｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔ[Ｊ].Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡꎬ１９９７ꎬ９４(３):１０３５－１０４０. [３]㊀ＭｉｚｏｉＪꎬＯｈｏｒｉＴꎬＭｏｒｉｗａｋｉＴꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ２Ａꎻ２ꎬａｃａｎｏｎｉｃａｌＤＥＨＹＤＲＡＴＩＯＮ￣ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥＥＬＥＭＥＮＴ￣ＢＩＮＤＩＮＧＰＲＯＴＥＩＮ２￣ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｓｏｙｂｅａｎꎬｉｓｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙｒｅｇｕ￣ｌａｔｅｄａｎｄｍｅｄｉａｔｅｓｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ１６１(１):３４６－３６１.[４]㊀ＤｕｂｏｕｚｅｔＪＧꎬＳａｋｕｍａＹꎬＩｔｏＹꎬｅｔａｌ.ＯｓＤＲＥＢｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅꎬＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.ꎬｅｎｃｏｄｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｒｏｕｇｈｔ￣ꎬｈｉｇｈ￣ｓａｌｔ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００３ꎬ３３(４):７５１－７６３.[５]㊀ＱｉｎＦꎬＫａｋｉｍｏｔｏＭꎬＳａｋｕｍａＹꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ￣ａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＺｍＤＲＥＢ２ＡｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎＺｅａｍａｙｓＬ.[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２００７ꎬ５０(１):５４－６９. [６]㊀ＸｕｅＧＰ.ＡｎＡＰ２ｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＨｖＣＢＦ１ａｃｔｉ￣ｖａｔｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｂａｒｌｅｙｔｈｒｏｕｇｈｉｎ￣ｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａ(Ｇ/ａ)(Ｃ/ｔ)ＣＧＡＣｍｏｔｉｆ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏ￣ｐｈｙｓ.Ａｃｔａꎬ２００２ꎬ１５７７(１):６３－７２.[７]㊀ＳｈｅｎＹＧꎬＺｈａｎｇＷＫꎬＨｅＳＪꎬｅｔａｌ.ＡｎＥＲＥＢＰ/ＡＰ２￣ｔｙｐｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｗａｓａＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｏｌｄꎬｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎａｎｄＡＢＡｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].Ｔｈｅｏｒ.Ａｐｐｌ.Ｇｅｎｅｔ.ꎬ２００３ꎬ１０６(５):９２３－９３０.[８]㊀ＳａｋｕｍａＹꎬＬｉｕＱꎬＤｕｂｏｕｚｅｔＪＧ.ＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＥＲＦ/ＡＰ２ｄｏｍａｉｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＲＥＢｓꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃ￣ｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ａｎｄｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２００２ꎬ２９０(３):９９８－１００９.[９]㊀ＣｈｅｎＨꎬＬｉｕＬꎬＷａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＶｒＤＲＥＢ２ＡꎬａＤＲＥＢ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆｒｏｍＶｉｇｎａｒａｄｉａｔａꎬｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｉｇｈ￣ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].Ｊ.ＰｌａｎｔＲｅｓ.ꎬ２０１６ꎬ１２９(２):２６３－２７３.[１０]ＮｉｕＸꎬＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓＴꎬＢａｔｅＮＪ.ＭａｉｚｅＡＢＩ４ｂｉｎｄｓｃｏｕｐｌｉｎｇｅｌ￣ｅｍｅｎｔ１ｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄａｎｄｓｕｇａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００２ꎬ１４(１０):２５６５－２５７５.[１１]ＳｕｎＳꎬＹｕＪＰꎬＣｈｅｎＦꎬｅｔａｌ.ＴＩＮＹꎬａｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ(ＤＲＥ)￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ￣ｌｉｋｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｃｏｎ￣ｎｅｃｔｉｎｇｔｈｅＤＲＥ￣ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ２８３(１０):６２６１－６２７１.[１２]ＤｏｎｇＣＪꎬＬｉｕＪＹ.ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥＡＲ￣ｍｏｔｉｆ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏ￣ｔｅｉｎＲＡＰ２.１ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｏｒｔｏｋｅｅｐｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｎｄｅｒｔｉｇｈｔｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ１０:４７.３１㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李永波ꎬ等:小麦ＤＲＥＢ４蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[１３]ＬｉｎＲＣꎬＰａｒｋＨＪꎬＷａｎｇＨＹ.ＲｏｌｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲＡＰ２.４ｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｌｉｇｈｔ￣ａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｓ￣ｓｅｓａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｐｌａｎｔꎬ２００８ꎬ１(１):４２－５７.[１４]ＰｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉＡꎬＲｅｙｎｏｌｄｓＭꎬＰａｃｈｅｃｏＭꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｅｓｓ￣ｉｎ￣ｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｗｈｅａｔｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＤＲＥＢ１Ａｇｅｎｅｄｅｌａｙｓｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｓｙｍｐｔｏｍｓｕｎｄｅｒｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅꎬ２００４ꎬ４７(３):４９３－５００.[１５]ＺｈｏｕＹꎬＣｈｅｎＭꎬＧｕｏＪꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｙｂｅａｎＤＲＥＢ１ｅｎｈａｎｃｅｓｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２０２０ꎬ７１(６):１８４２－１８５７. [１６]刘洋洋ꎬ郭栋ꎬ楚秀生ꎬ等.转ＤＲＥＢ基因小麦新品系抗旱生理指标测定[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１３ꎬ４５(３):３８－４１. [１７]ＣｈｅｎＭꎬＸｕＺꎬＸｉａＬꎬｅｔａｌ.Ｃｏｌｄ￣ｉｎｄｕｃｅｄｍｏｄｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅꎬＧｍＤＲＥＢ３ꎬｉｎｓｏｙｂｅａｎ(ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ.)[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｂｏｔ.ꎬ２００９ꎬ６０(１):１２１－１３５.[１８]ＣｈｅｎＭꎬＷａｎｇＱＹꎬＣｈｅｎｇＸＧꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ２ꎬａｓｏｙｂｅａｎＤＲＥ￣ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｃｏｎｆｅｒｒｅｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｈｉｇｈ￣ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２００７ꎬ３５３(２):２９９－３０５.[１９]ＴｕＴＱꎬＶａｃｉａｘａＰꎬＬｏＴＴＭꎬｅｔａｌ.ＧｍＤＲＥＢ６ꎬａｓｏｙｂｅａｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｎｏｔａｂｌｙａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｔＰ５ＣＳａｎｄＮｔＣＬＣｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｓａｕｄｉ.Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０２１ꎬ２８(１２):７１７５－７１８１.[２０]倪志勇.小麦ＤＲＥＢ转录因子的分子生物学特性分析及功能鉴定[Ｄ].杨凌:西北农林科技大学ꎬ２００８.[２１]ＳａｒｋａｒＴꎬＴｈａｎｋａｐｐａｎＲꎬＭｉｓｈｒａＧＰꎬｅｔａｌ.ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｓｅｏｆＤＲＥＢｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒ￣ａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｒｏｐｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓꎬ２０１９ꎬ２５(６):１３２３－１３３４.[２２]ＣａｏＢꎬＨｅＸꎬＬｕｏＹꎬｅｔａｌ.Ｓａｆｅｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ￣ｂｉｎｄｉｎｇ(ＤＲＥＢ)４ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ.ｃｏｌｉ[Ｊ].ＦｏｏｄａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ５０(１１):４０７７－４０８４.[２３]徐兆师.小麦抗逆相关转录因子基因的克隆与鉴定[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２００５.[２４]范玉清ꎬ刘恒ꎬ任伟.拟南芥ＤＲＥＢ１Ａ转录因子的原核表达和多克隆抗体制备[Ｊ].植物生理学通讯ꎬ２００７ꎬ４３(３):５３３－５３７.４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。

细胞生物学部分考研真题整理

细胞生物学部分考研真题整理第三章细胞生物学研究方法一、名词解释激光扫描共聚焦显微术（06中科）绿色荧光蛋白（03北师）(04武大) (西北大学03)基因敲除（03北师）(西北大学05)原位杂交（04北师）（04曲师大）免疫共沉淀（05北师）RT-PCR（06北师）细胞原代培养（06北师）（07华中师大）细胞融合（06北师）(浙江师大07)显微镜分辨率（07华中师大）(西北大学04)Cytoplast(04武大) (西北大学03) （03华南师大）（04曲师大）monoclonal antibody (西北大学05) (浙江师大07)nucleosome(西北大学05) (04山师)fluorescence microscopy(西北大学05)Southern blotting(西北大学05)DNA指纹技术(西北大学04)Northern bloting(西北大学04) (西北大学03)酵母双杂交技术(西北大学04)Western bloting(西北大学03)接触抑制(浙江师大07)转基因植物(04中科大)细胞培养（04华南师大）组织中心免疫细胞化学技术（04华南师大）免疫胶体金技术（03华南师大）细胞工程（03华南师大）(06东北师大)非细胞体系(06山师) (04山师) (04夏大)分子杂交（05曲师大）Autoradiography(04南开)二、简答及问答1. 请简单谈谈下列仪器的要紧用途与特点1）干涉差显微镜（ICM）2）激光共聚焦扫描显微镜（confocal）3）电荷偶连仪（CCD）4）流式细胞仪（flow cytometry）(05武大)2. ? 细胞生物学实验的镜检标本制备中为什么务必取材新鲜且迅速固定？透射电镜观察的样品为什么务必事前进行脱水处理？(04武大)3. 为什么体外培养的癌细胞能在悬浮条件下增殖生长，而正常细胞却只能在贴壁培养时增殖生长？(04武大)4. 分析细胞融合技术在人类基因组物理作图中的应用价值。

03第三章生物制品的菌种与毒种(兽医生物制品学)

(四)遗传性状稳定
菌种和毒种在保存、传代和使用过程中，受各种因素影响而变异，因此保证其遗传性状稳定是保证生物制品质量的重要因素之一。
微生物种是以群体形式存在，遗传学纯一性和相对稳定性是指群体变异幅度必须有严格的限制。为保持种的纯一和相对稳定，生产生物制品的菌、毒种应通过定期传代、筛选、检定等工作进行控制。
初选依据包括: ①细菌菌落特征变异，如菌落大小、形状，色泽、粗糙或光滑称荧光等；②病毒蚀斑的变异；③对温度敏感性变异；④对药物敏感性变异；⑤对营养要求变异，如对氨基酸的特殊需要；⑥对宿主动物易感性变异。我国经过长期研究，育成了一些弱毒株作为疫苗种毒生产疫苗，在控制和消灭动物疫病中发挥了重要作用。
例如，鸡新城疫出LaSota弱毒株和D10，是分别从自然鸡群和鸭群中分离到的，然后再通过克隆、挑选等途径育成。鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒FC126株即分离于火鸡，对鸡无致病性，其抗原性与鸡马立克氏病病毒一致。然而，微生物自发突变率往往很低，形成具有稳定遗传性状的过程比较长，因此获得的机率不高。
2.弱毒菌种和毒种的选育途径
弱毒菌（毒）种的选育
自然弱毒株的分离
人工诱变致弱
同源动物 (如NDV LaSota株)
异源动物 (如HVT FC126株)
化学途径
物理途径
生物途径
亚硝基胍醋酸铊洗衣粉
高温紫外线
非易感动物鸡胚、细胞
杂交减毒
1.自然弱毒株的选育
自然弱毒株又称自发突变毒株，由自然强毒株在自然因素作用下因遗传基因突变形成了与祖代性状(特别是致病力和抗原性)不尽相同的生物株。这些自然因素，如异种非易感动物、温度、日光、干燥、紫外线等都可能是导致细菌和病毒自发突变的原因。因此，人们往往有意或无意地从自然中分离、筛选和育成一些弱毒菌(毒)株，作为兽医生物制品的种毒。

卡那霉素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

uid chromatooraphG HPLC )法*2］、免疫学检测法*3］等•其中HPLC等色谱方法虽然灵敏度高，但对技术的要求
+ 较高，并且样品处理比较复杂，测试成本高，不适合快速筛查大批量样品*4 •免疫学检测法作为一种快速、特
异和灵敏的检测技术，被广泛应用于小分子药物残留的检测•在本研究中，我们制备了卡那霉素单克隆抗体, 建立了间接竞争酶联免疫吸附试验(indirect competitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay, ciVLISA ) 方法•
2. 8X 109 L/mol,半数抑制浓度(+"0)为1-09 ng/mL,与妥布霉素(T0B)的交叉反应率为53. 4% ,与其他氨基糖苷类
化合物没有交叉反应性.利用该单克隆抗体,建立KAN间接竞争酶联免疫吸附试验(ciVLISA) ziVLISA检测KAN
在牛奶中的回收率为64. 4%~89. 6% ,最低检测限为1. 92 n/mL.
110
郑州大学学报（理学版）
第51卷
PBS （3 L）透析3次并收集于1.5 mL试管中，该方法制备的偶联物命名为KAN-BSA和KAN-OVA,放置于 -20 T冰箱保存.采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定完全抗原浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果. 1.2.2动物免疫及杂交瘤细胞的筛选将KAN-BSA作为免疫抗原,并对每只小鼠进行皮下注射 50 -g/200 -L,使用KAN-OVA作为包被抗原，通过间接ELISA测定小鼠免疫血清效价，并选择具有高效价的小鼠，将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经3轮亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞株,具体实验步骤参照文献 *5］. 1.2.3单克隆抗体的大量制备及鉴定将筛选到的杂交瘤细胞株转移至细胞培养瓶中，并用RPMI1640/ 10完全培养基在细胞培养瓶内扩大培养，当细胞达到对数增长状态时，向石蜡致敏的经产母鼠腹腔中注射每毫升1P106个细胞，约10天后小鼠腹部肿胀，此时，收集腹水，离心收取上清液，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水*6］，用SDS-BAGE鉴定纯化的单克隆抗体，并通过间接ELISA法测其效价与亲和力. 1.2.4确定最适抗原包被量及单克隆抗体稀释度采用棋盘法连续倍比稀释包被抗原KAN-OVA和卡那霉素单克隆抗体，抗原包被量分别为800、400、200、100、50 n//孔，单克隆抗体稀释倍数从1 : 800开始2倍比稀释至1 : 204 800. 1.2.5间接竞争ELISA的建立及标准曲线的绘制以KAN-OVA作为包被抗原，包被量为200 ng/孔，4 °C 孵育过夜&PBST洗6次，用封闭液37 C封闭2 h.PBST洗6次后分别将各质量浓度标准品溶液（KAN ：用双蒸馏水配制卡那霉素标准品，用0.01 M PBS倍比稀释到质量浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125 ng/mL）与最适稀释倍数的单克隆抗体等体积混合作为一抗，向各孔中加入100 -L混合液，同时设置阳性、阴性和空白对照组，二抗加入100 -L 1 : 4 000稀释的羊抗鼠IgG，TMB显色8 min，2 mmol/L H2SO4终止反应，0D450 nm条件下测定值. 1.2.6间接竞争ELISA准确度分析在同一批ELISA酶标板上进行6组竞争ELISA平行试验，作批内变异系数分析；同时，包被6批酶标板，分别各进行一次竞争ELISA检测，做批间变异系数分析，研究不同标准品浓度测定结果的准确性. 1.2.7交叉反应率的确定链霉素、妥布霉素、卡那霉素B、新霉素、新霉胺以及庆大霉素属于卡那霉素结构类似物*7］，以相同的竞争ELISA方法测定这几种药物的+50，根据式CR = +50 （ KAN） /+50 （其他）P 100%*8］计算单克隆抗体对于链霉素、妥布霉素、新霉素、庆大霉素等的交叉反应率. 1.2.8样品加标回收率的测定牛奶样品处理方法：选取牛奶，向不含卡那霉素的牛奶样品中添加卡那霉素标准品，12 000 a/min,4 C离心10 min后，除去上层脂肪层及沉淀物，用0.01 mol/L PBS将中间清液分别稀释2、4、8倍,使不同稀释倍数的牛奶中含卡那霉素终质量浓度分别为6.25、12.5、25 ng/mL.间接竞争 ELISA方法用于检测牛奶样品中的卡那霉素，根据公式（实际检测浓度/添加浓度P100%）,计算其回收率.用不同稀释倍数的牛奶，分别测定20个不含卡那霉素牛奶样品的平均值,根据其平均值加上3倍标准偏差再乘以样品稀释倍数,得到其最低检测限.

多克隆抗体制备综合性实验 - 副本

多克隆抗体制备综合性实验实验原理：抗体是在抗原刺激机体免疫系统后，活化的B淋巴细胞针对抗原决定簇产生抗体，由一个B细胞细胞克隆针对某一抗原决定簇产生的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。

若由多抗原决定簇刺激机体，相应活化多个B细胞克隆，产生多种McAb的混合物，称之为多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）。

抗体的制备包括抗原的制备和纯化、动物免疫和血清分离纯化与鉴定。

许多免疫学诊断都以抗原抗体反应为基础。

实验操作：1.抗原的制备（第一周）用抗原刺激机体可使机体产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得抗体的特异性和效价。

为了提高抗原的免疫原性以获得高水平的抗体，一般需在可溶性抗原中加入佐剂。

本实验抗原为混合人全血清（20份血清混合）。

以下步骤需无菌操作（1）混合20份人全血清。

（2）取混合人全血清，用生理盐水1:4稀释。

（3）将稀释血清按与完全佐剂1:1体积的比例混匀，制成油包水状态。

将佐剂5 ml置磁力搅拌器上，边搅拌边滴加抗原，继续搅拌使其完全乳化。

将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化。

乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果。

完全乳化标准：(1) 取1滴至冰水表面，若乳剂稳定，在冰水表面不会扩散。

(2) 振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。

2.基础免疫(1) 固定家兔(2) 剪去家兔颈背部、大腿、足底的毛，碘酒和酒精棉球消毒。

(3) 免疫方法可采用背部多点注射法。

即于家兔脊柱两旁、大腿、足掌选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，每只家兔共注射1ml。

间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。

抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。

捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中。

高一生物必修一第三章知识点总结

第一节细胞膜——系统的边界知识网络：一、制备细胞膜的方法实验原理：渗透作用将细胞放在清水中,水会进入细胞,细胞涨破,血红蛋白和无机盐等内容物流出,得到细胞膜选材：人或其它哺乳动物成熟红细胞鸟类,两栖类的不能做为实验材料原因：因为材料中没有细胞核和众多细胞器提纯方法：差速离心法细节：取材用的是新鲜红细胞稀释液血液加适量生理盐水本实验只是通过观察红细胞形态变化来理解制备细胞膜的方法和原理,不能直接观察和获得细胞膜.若想获得较纯净的细胞膜得在试管中离心和过滤二、细胞膜主要成分：脂质和蛋白质,还有少量糖类①脂质50%：以磷脂为主,是细胞膜的骨架,含两层；②蛋白质40%：细胞膜功能的体现者,蛋白质种类和数量越多,细胞膜功能越复杂；③糖类：和蛋白质结合形成糖蛋白也叫糖被,和细胞识别、免疫反应、信息传递、血型决定等有直接联系；细胞癌变过程中,细胞膜成分改变,产生甲胎蛋白AFP,癌胚抗原CEA.细胞膜上的糖蛋白减少,细胞间粘滞性下降,使得癌细胞易分散和转移三、细胞膜的结构基本骨架——磷脂双分子层基本结构镶、嵌、贯穿——蛋白质分子外侧——糖蛋白与细胞识别有关结构特点：一定的流动性．．．举例：变形虫变形运动、白细胞吞噬细菌3、细胞膜功能：①将细胞与外界环境分隔开,保证细胞内部环境的相对稳定②控制物质进出细胞控制具有相对性方式：自由扩散、协助扩散和主动运输功能特点：选择透过性．．举例：腌制糖醋蒜,红墨．．和数量．．．．．取决于载体蛋白．．．．的种类水测定种子发芽率,判断种子胚、胚乳是否成活③进行细胞间的信息交流方式：三种和细胞膜上的糖蛋白紧密相关四、细胞壁植物：纤维素和果胶用纤维素酶和果胶酶可以在不损伤细胞内部结构的前提下出去细胞壁原核生物：肽聚糖结构特点：不具有选择透过性.作用：支持和保护第二节细胞器——系统内的分工合作重点内容,需要会看细胞结构示意图⒈显微结构：光学显微镜下看到的结构；亚显微结构：电子显微镜下看到的结构；细胞质细胞质基质：胶状物质,是细胞进行新陈代谢的主要场所.细胞器：具有特定功能的各种亚细胞结构的总称.差速离心法一．细胞质基质定义：细胞质中除细胞器以外的液体部分功能：1.细胞质基质中有多种酶,是多种代谢活动的场所.2.为新陈代谢提供所需的物质和一定的环境条件如提供ATP、核苷酸、氨基酸等.成分：水、无机离子、脂类、糖类、氨基酸、核苷酸等,还有很多种酶.二、细胞器结构和功能一双层膜1.线粒体分布:动植物细胞中, 代谢旺盛的细胞中含量较多.线粒体的数量与细胞新陈代谢的强弱有关一般在细胞代谢旺盛的部位比较集中注意：蛔虫的体细胞内不含线粒体形态:呈颗粒状或短杆状结构：外膜：使线粒体与周围的细胞质分开内膜：向内折叠形成嵴意义：增大膜面积有利于生化反应地进行基质：含少量DNA、核糖体和有关酶功能：细胞呼吸和能量代谢的中心2.叶绿体——植物和藻类细胞特有1分布：能进行光合作用的真核细胞.主要是叶肉细胞,植物的根尖细胞不含叶绿体2形态:一般呈扁平的椭球形或球形比线粒体稍大3结构线粒体和叶绿体比较表线粒体叶绿体分布动植物细胞中主要存在于植物细胞形态椭球形扁平的椭球形或球形观察可以对活的动物细胞中的线粒体进行染色.线粒体+健那绿→蓝绿色叶肉细胞中的叶绿体呈绿色,可直接用高倍显微镜来观察结双层外膜与周围的细胞质基质分开双层膜基粒基质内膜外膜透明,有利于透由类囊体重叠而成,膜上液态,含少量DNA、核糖体有与光合作用有关的叶绿体内质网：①分布：动植物细胞；②结构：单层膜连接而成的网状结构；③类型：粗面内质网和滑面内质网④作用：能增加细胞内的膜面积,是细胞内蛋白质的合成加工以及脂质合成的车间,是细胞内蛋白质运输的通道高尔基体：单层膜,由扁平囊和囊泡构成其中扁平囊是判断高尔基体的依据对蛋白质进行加工、分类、包装.和细胞分泌物的形成有关；和植物细胞壁的形成有关液泡：①分布：主要在成熟的植物细胞内；②结构：单层膜液泡膜,内含细胞液细胞液中含有色素,无机盐,糖类,蛋白质等；③功能：调节植物细胞的内环境；使植物细胞保持坚挺维持细胞形态；和细胞的吸水失水相关溶酶体：细胞内的“消化车间”；①分布：动植物细胞；②结构：单层膜,内含多种水解酶③功能：分解衰老,损伤的细胞器,吞噬并杀死侵入细胞的病毒或细菌三无膜结构核糖体：细胞内生产蛋白质的机器①分布：动植物细胞；②存在状态：游离于细胞质基质,附着于粗面内质网和外层核膜上,在线粒体和叶绿体内③结构：不具膜,呈颗粒状；④功能：蛋白质合成的场所中心体：①分布：动物细胞和低等植物细胞；②结构：不具膜结构,由两组互相垂直的中心粒及周围物质组成③功能：和细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成有关发出星射线形成纺锤体四细胞亚显微结构中的相关知识点归纳1、从形态上来讲,光学显微镜下可见的结构形式有:细胞壁,细胞质,细胞核,核仁,染色体,叶绿体,线粒体,液泡. 真核细胞中细胞器的质量大小：叶绿体＞线粒体＞核糖体.2、从结构上分类：各种细胞器膜的化学成分与细胞膜相同,都含有蛋白质和脂类分子.膜的结构与细胞膜基本相同,基本骨架都是磷脂双分子层,细胞器的膜和细胞膜可称为生物膜.具有膜结构的是细胞膜,线粒体,叶绿体,内质网,高尔基体,液泡,溶酶体等.具有双层膜结构的是核膜,线粒体,叶绿体;具有单层膜结构的是内质网,高尔基体,液泡.细胞内各种膜结构在结构和功能上是密切联系的.没有膜结构的是细胞壁,中心体,核糖体.3、从生物类型上分：动、植物细胞一般均有的细胞器是高尔基体、线粒体、核糖体、内质网等. 动,植物细胞都有但功能不同的细胞器是高尔基体.高等动物细胞特有的细胞器是中心体. 低等植物细胞具有的细胞器是中心体.植物细胞特有的结构是细胞壁,液泡,叶绿体,特有的细胞器是液泡,叶绿体. 低等动物细胞具有的细胞器是液泡.原核细胞中具有的细胞器：核糖体；根尖分生区没有的细胞器：叶绿体、中心体、液泡.以下各条是从细胞器所含有的成分上分的5、含有核酸的细胞器是线粒体,叶绿体,核糖体含rRNA.6、含色素的细胞器有叶绿体叶绿素和类胡萝卜素等,有色体类胡萝卜素等,液泡花青素等.以下各条是从细胞器功能上分的8、能产生水的细胞结构有线粒体有氧呼吸的第三阶段,核糖体脱水缩合,叶绿体暗反应 ,细胞核DNA复制.高尔基体多糖合成9、与主动运输有关的细胞器是线粒体供能,核糖体合成载体蛋白.10、与能量转换有关的细胞器或产生ATP的细胞器有叶绿体光能转换:光能一电能一活跃的化学能一稳定的化学能,线粒体化能转换:稳定的化学能一活跃的化学能.产生ATP的场所：线粒体、叶绿体、细胞质基质.另外,在能量代谢水平高的细胞中,线粒体含量多,动物细胞中线粒体比植物细胞多.蛔虫和人体成熟的红细胞中无细胞核无线粒体,只进行无氧呼吸.需氧型细菌等原核生物体内虽然无线粒体,但细胞膜上存在着有氧呼吸链,也能进行有氧呼吸.蓝藻属原核生物,无叶绿体,有光合片层结构,也能进行光合作用.高等植物的根细胞无叶绿体和中心体.11、能自我复制的细胞器或有相对独立的遗传系统的半自主性细胞器是线粒体,叶绿体,中心体. 染色体能发生碱基互补配对行为的细胞器有线粒体,叶绿体,核糖体.12、参与细胞分裂的细胞器有核糖体间期蛋白质合成,中心体由它发出的星射线构成纺锤体,高尔基体与植物细胞分裂时细胞壁的形成有关,线粒体供能.13、将质膜与核膜连成一体的细胞器：内质网.14、与脂类及多糖合成有关的细胞器：内质网三．生物膜系统：1．概念：由内质网、高尔基体、线粒体、叶绿体、溶酶体等细胞器膜和细胞膜和核膜等共同构成的,组成成分和结构很相似,在结构和功能上是紧密联系的统一整体.生物膜在结构上的2.生物膜在结构上的联系3.各种生物膜在功能上既有明确分工,又是紧密联系的：如分泌蛋白的合成和运输①分泌蛋白：抗体、蛋白质类激素、胞外酶消化酶等分泌到细胞外②过程：核糖体内质网囊泡高尔基体囊泡细胞膜胞外合成肽链加工、运输加工为成熟蛋白质以上过程由线粒体提供能量4、作用：①使细胞具有稳定内部环境物质运输、能量转换、信息传递②为各种酶提供大量附着位点,是许多生化反应的场所③把各种细胞器分隔开,保证生命活动高效、有序进行第三节细胞核————系统的控制中心核膜定义：指包被细胞核的双层膜有选择透性,外层与粗面内质网膜相连.核孔：内外膜在一些位点上融合形成的环状开口,是蛋白质、RNA等大分子出入细胞的通道和信息交流的通道.1．细胞核结构染色质：细胞核中或粗或细的长丝,由DNA和蛋白质组成.携带着细胞的遗传信息.在细胞核内易被碱性染料染成深色物质.核仁：细胞核中呈圆形或椭圆形的结构,由某些染色体的片段构成.与rRNA的合成与核糖体的形成有关,在细胞分裂过程中能周期性的消失和重建.核基质：细胞核内的液体部分.2.染色质与染色体的区别和联系关系：是细胞中同一种物质在不同时期的两种形态3.细胞核功能：是遗传信息库遗传物质储存和复制的场所,是细胞代谢和遗传的控制中心4.细胞是一个有机的统一的整体,只有保持完整性,才能完成各项生命活动.⑴从结构上看：①细胞核与细胞质可以通过核孔相互沟通；②细胞器膜和细胞膜、核膜等结构相互连接构成细胞完整的“生物膜系统”.⑵从功能上看：细胞各部分结构和功能虽不相同,但它们是相互联系,分工合作、协调一致地共同完成各项生命活动.⑶从调控上看：细胞核是遗传物质贮存和复制的场所,是细胞遗传和代谢的控制中心.因此,细胞的整个生命活动主要是DNA调控和决定的,使细胞形成一个高度有序的整体调控系统.⑷从与外界环境关系上看：细胞的整体性还表现在每一细胞都要与相邻细胞进行物质交换,而与外界环境相接触的细胞都要与外界环境进行物质交换和能量转换.因此细胞与外界环境之间形成一个统一整体.⑸从细胞核与细胞质的关系看1细胞核不能脱离细胞质而独立生存,这是因为细胞核在生命活动中所需的物质和能量均由细胞质提供.2无核的细胞质也不能长期生存,这是由细胞核的功能决定的,如哺乳动物成熟的红细胞无细胞核,其寿命较短,含细胞质少的精子寿命也很短.细胞核与细胞质是相互依存、不可分割的关系,说明细胞只有保持结构的完整性,才能完成各项正常的生命活动.细胞的整体性是几十亿年进化的产物.⒓分泌蛋白形成过程中涉及的细胞器和细胞结构：①核糖体合成蛋白质→内质网初步加工,转运通道→高尔基体加工组装→细胞膜通过外排作用行成分泌蛋白；线粒体供能；②其中：从内质网到高尔基体,从高尔基体到细胞膜均通过囊泡来进行转移.19．三、生物膜系统1、概念：细胞膜、核膜,各种细胞器的膜共同组成的生物膜系统2、作用：使细胞具有稳定内部环境物质运输、能量转换、信息传递为各种酶提供大量附着位点,是许多生化反应的场所把各种细胞器分隔开,保证生命活动高效、有序进行能产生水碱基互补配对的细胞器：叶绿体、线粒体、核糖体能产生ATP 的结构：叶绿体、线粒体、细胞质基质高等植物根．中无中心体、无叶绿体体内寄生动物无线粒体,如蛔虫进行无氧呼吸总结归纳如下:2、高等植物特有的细胞器：叶绿体、液泡3、动物和低等植物特有的细胞器：中心体4、真核细胞和原核细胞共有的细胞器：核糖体6、含有DNA 的结构：线粒体、叶绿体、细胞核含有RNA 的细胞器：线粒体、叶绿体、细胞核、核糖体含色素的细胞器：叶绿体、液泡1、按有无膜结构含7、与细胞增殖有关的细胞器：中心体8、含有色素的细胞器：液泡、叶绿体9、与分泌蛋白合成和分泌有关的细胞器：核糖体、内质网、高尔基体、线粒体10.能够自我复制：线粒体、叶绿体11.与有丝分裂有关：中心体12.与能量转换有关：线粒体、叶绿体19．细胞器的协调配合：如分泌蛋白的合成和运输①分泌蛋白：抗体、蛋白质类激素、胞外酶消化酶等分泌到细胞外②过程：核糖体内质网囊泡高尔基体囊泡细胞膜胞外合成肽链加工、运输加工为成熟蛋白质以上过程由线粒体提供能量核膜定义：指包被细胞核的双层膜有选择透性,外层与粗面内质网膜相连.核孔：内外膜在一些位点上融合形成的环状开口,是蛋白质、RNA等大分子出入细胞的通道和信息交流的通道.细胞核结构染色质：细胞核中或粗或细的长丝,由DNA和蛋白质组成.携带着细胞的遗传信息.在细胞核内易被碱性染料染成深色物质.核仁：细胞核中呈圆形或椭圆形的结构,由某些染色体的片段构成.与rRNA的合成与核糖体的形成有关,在细胞分裂过程中能周期性的消失和重建.核基质：细胞核内的液体部分.染色质与染色体的区别和联系关系：是细胞中同一种物质在一同时期的两种形态细胞核的功能：是遗传信息库遗传物质储存和复制的场所,是细胞代谢和遗传的控制中心；细胞是一个有机的统一的整体,只有保持完整性,才能完成各项生命活动.⑴从结构上看：①细胞核与细胞质可以通过核孔相互沟通；②细胞器膜和细胞膜、核膜等结构相互连接构成细胞完整的“生物膜系统”.⑵从功能上看：细胞各部分结构和功能虽不相同,但它们是相互联系,分工合作、协调一致地共同完成各项生命活动.⑶从调控上看：细胞核是遗传物质贮存和复制的场所,是细胞遗传和代谢的控制中心.因此,细胞的整个生命活动主要是DNA调控和决定的,使细胞形成一个高度有序的整体调控系统.⑷从与外界环境关系上看：细胞的整体性还表现在每一细胞都要与相邻细胞进行物质交换,而与外界环境相接触的细胞都要与外界环境进行物质交换和能量转换.因此细胞与外界环境之间形成一个统一整体.⑸从细胞核与细胞质的关系看1细胞核不能脱离细胞质而独立生存,这是因为细胞核在生命活动中所需的物质和能量均由细胞质提供.2无核的细胞质也不能长期生存,这是由细胞核的功能决定的,如哺乳动物成熟的红细胞无细胞核,其寿命较短,含细胞质少的精子寿命也很短.细胞核与细胞质是相互依存、不可分割的关系,说明细胞只有保持结构的完整性,才能完成各项正常的生命活动.细胞的整体性是几十亿年进化的产物.。

医学免疫学与病原生物学(第4版)(郝钰,万红娇,邝枣园主编)PPT模板

第二篇免疫系统
第6章细胞因子
第一节概述第二节细胞因子的共同特性第三节细胞因子的生物学作用与临床意义
第二篇免疫系统
第7章白细胞分化抗原与黏附分子
第一节白细胞分化抗原第二节黏附分子第三节白细胞分化抗原和黏附分子与临床
第二篇免疫系统
第8章主要组织相容性复合体及其编码分子
第一节mhc的基因组成第二节mhc分子的结构、分布与功能第三节mhc的遗传特征第四节hla与临床医学的关系第二节MHC分子的结构、分布与功能第三节MHC的遗传特征第四节HLA与临床医学的关系
第11章固有免疫应答第12章适应性免疫应答第13章免疫耐受第14章免疫调节
第三篇免疫应答
第11章固有免疫应答
第一节固有免疫系统的构成第二节固有免疫的识别机制第三节固有免疫细胞的效应第四节固有免疫应答与适应性免疫应答的关系
第三篇免疫应答
第12章适应性免疫应答
第一节t细胞介导的细胞免疫第二节b细胞介导的体液免疫第三节适应性免疫应答的一般规律第二节B细胞介导的体液免疫第三节适应性免疫应答的一般规律
医学免疫学与病原生物学（第4版）(郝钰,万红娇,邝枣园主编)
演讲人
202x-11-11
目录
01. 第4版前言 02. 上编医学免疫学 03. 中编医学微生物学 04. 下编医学寄生虫学
01
第4版前言
第4版前言
02
上编医学免疫学
第一篇医学免疫学概论
第1章医学免疫学绪论第一节概述
第二节免疫学发展简史第2章抗原
0 2
第8章球菌
0 3
第9章肠杆菌科
0 4
第10章弧菌属
0 5
第11章厌氧性细菌

免疫组织化学检验技术

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（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物（三）方法评价
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三、非标记抗体酶免疫组化染色法（一）原理
该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。
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二、SPA法
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3.双桥PAP法该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
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免疫组化的检测原理
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免疫组化的检测原理
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第一节免疫组化检验技术基本知识
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免疫组化全过程
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一、标本制作
•
标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗
原的准确显示和定位。
（一）标本的主要来源
主要有：
在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理一、单克隆抗体的概念抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。

由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。

这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。

通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。

德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。

牛病毒性腹泻病毒E2抗体的制备

收稿日期：2021-03-09基金项目：山东省重点研发项目（2017GNC10125，2019GSF107020）作者简介：李胜文，女，硕士研究生，细胞生物学专业通信作者：何成强，E-mail：*****************.cn ·简报·牛病毒性腹泻病毒E2抗体的制备摘要：为获得牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）E2蛋白的多克隆抗体，本研究截短了BVDV E2氨基端前600个碱基，并构建原核表达载体pET28a-E2，优化E2序列并将重组载体转化到BL21感受态细胞中。

37℃、1 mmol/L IPTG 条件下诱导4 h ，SDS-PAGE 凝胶电泳观察在15 kDa 处表达目的蛋白。

Ni-NTA 亲和层析纯化E2蛋白并免疫小鼠制备鼠抗血清。

以获得的血清为一抗，Western blot 检测pET28a-E2在BL21中表达的总蛋白，证明免疫性良好。

利用BVDV 感染MDBK 细胞，Western blot 成功检测到MDBK 细胞表达的E2蛋白，证明E2抗体具有良好的特异性。

ELISA 检测E2多克隆抗体的效价达1∶128 000。

本研究成功制备出BVDV E2多克隆抗体，为进一步研究该蛋白的功能及BVDV 活载体疫苗的鉴定提供了技术和材料支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；E2基因；原核表达；多克隆抗体中图分类号：S852.65文献标志码：B文章编号：1674-6422（2023）04-0189-06Preparation of E2 Antibodies Against Bovine Viral Diarrhea VirusLI Shengwen, WANG Wei, ZHAO Wendong, DING Naizheng, WANG Hongmei,HE Hongbin, HE Chengqiang(Shandong Key Laboratory of Animal Resistance, College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China)李胜文，王炜，赵文栋，丁乃峥，王洪梅，何洪彬，何成强（山东师范大学生命科学学院山东省动物抗性重点实验室，济南250014）Abstract: In order to obtain the polyclonal antibody against bovine viral diarrhea virus E2 protein, in this study, the ﬁ rst 600 bp of the amino terminal of BVDV E2 was truncated and the prokaryotic expression vector pET28a-E2 was constructed, the E2 sequence was optimized, and the recombinant vector was transformed into BL21 capable cells. The target protein was induced at 37℃ and 1mmol/L IPTG for 4 h, SDS-PAGE gel electrophoresis was used to observe the expression of target protein at 15 kDa. Ni-NTA affinity chromatography was used to purify protein and immunize mice to prepare anti-serum. The prepared serum was used as the primary antibody, Western blot to detect the total protein expressed by pET28a-E2 in BL21, which proved that the immunity was good. Using BVDV to infect MDBK cells, Western blot successfully detected the E2 protein expressed by MDBK cells, which proved that the prepared had good speciﬁ city. The titer of polyclonal antibody against E2 was 1: 128 000 by ELISA. This study successfully prepared the corresponding E2 polyclonal antibody, which provided technical and material support for further study of the function of the protein and the identiﬁ cation of BVDV live vector vaccine.Key words: Bovine viral diarrhea virus; E2 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibodiesChinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2023,31(4):189-194牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea, BVD）是由牛病毒性腹泻病毒[1]（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引发牛产生的以腹泻、流产、持续性感染（PI）[2]为临床症状的重大疾病，对养殖业造成了严重的经济损失[1-2]。

《生理学03》教案：第三章血液

生理学03教案.doc第三章血液简介：第三章血液教学目标掌握：血量与红细胞比容、血浆胶体渗透压与晶体渗透压的组成以及生理意义。

红细胞生成及生成调节。

血小板的止血功能．内源性凝血与外源性凝血的概念， ...第三章血液教学目标掌握：血量与红细胞比容、血浆胶体渗透压与晶体渗透压的组成以及生理意义。

红细胞生成及生成调节。

血小板的止血功能．内源性凝血与外源性凝血的概念，血浆中主要的抗凝物质。

ABO血型的分型原则。

熟悉：全血与血浆的概念，血浆蛋白的分类及其生理作用。

影响红细胞生成的因素，红细胞悬浮稳定性和渗透脆性的概念及影响因素。

血小板的基本功能、交叉配血的概念及对输血的指导意义。

凝血的主要步骤。

了解：血液的组成及理化特性，白细胞的分类及功能，凝血因子与凝血，纤维蛋白溶解系统，Rh血型系统。

内容概述一、体液的概念体内的水分及溶于其中的各种物质二、体液的分布体液（占体重60％）。

包括细胞内液：为体重的40％；细胞外液：血浆，为体重的5％；组织液为体重的15％三、血液的生理功能（一）运输功能（二）调节体温（三）防御和保护功能教案第一节血液的组成和理化特性一、血液的组成（一）血液的基本组成血细胞（有形成分45％）红细胞、白细胞、血小板血浆：水和各种溶于其中的化学物质。

（二）红细胞比容（血细胞比容）血细胞在全血中所占容积百分比。

男性 40％～50％女性 37％～48％（三）血浆的化学成分：水占91％～92％；溶质占8％～9％。

1.血浆蛋白（60～80g/L）包括白蛋白40～50g/L、球蛋白20～30g/L、纤维蛋白2～4g/L，白/球＝1.5～2.5:12.非蛋白含氮化合物即非蛋白氮（NPN）-蛋白质的代谢产物：尿素、尿酸、肌苷、氨基酸、多肽、胆红素、氨等。

3.不含氮的有机化合物葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、磷脂、脂肪酸、有机酸等。

4.无机盐Na+ 、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cl+、I-、HCO3-、HPO42-、SO42-5.呼吸气体和微量物质（四）全血、血浆、血清的概念1.全血＝血浆+血细胞2.血浆＝全血-血细胞3.血清：血液凝固后析出的液体部分，不含纤维蛋白原二、血液的理化特性（一）颜色：红细胞内血红蛋白的颜色动脉血：鲜红色。