包涵体纯化液体配制

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(整理)包涵体的分离纯化.

包涵体的纯化和复性总结（二）关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

包含体纯化步骤(精)

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。

2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50MmNaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。

3、4℃12,000rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。

4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。

2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。

根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进行纯化。

2.2.3 天然条件下纯化可溶形式的目的蛋白目的蛋白的表达和收获：用3.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。

4℃下10,000 rpm离心5min弃上清，向细菌沉淀中加入4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100mL培养液加入4mL结合缓冲液，重悬菌体。

－40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。

再在冰水浴中超声10min(超声10s, 间隔10s)，破碎菌体。

4℃下10,000 rpm离心20min，保留上清液。

包涵体蛋白提取

包涵体蛋白提取纯化20070808步骤一提取包涵体1. 母菌培养后，接种20ml于2L LB液中，37℃培养至OD600=0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃继续培养3-5小时。

2. 收菌(接下去步骤都在低温下进行)，用60ml左右1×PBS悬浮，超声裂解（超6S，间隔12S，99次，300W左右）。

3. 12000rpm，30min，用玻棒将细菌碎片拨掉，washing buffer悬浮。

4. 离心后可看细菌有无完全裂解，若无可以再次超声：4S，10S，43次，300W左右，超声条件可以自行调整。

5. 12000rpm，10-20min，washing buffer洗涤，尽量去除细菌碎片。

6. 同上，称重。

7. 12000rpm，10-20min，resuspension buffer悬浮。

8. 12000rpm，10-20min，按30mg/ml用盐酸胍或尿素溶解，4℃搅拌溶解。

9. 12000rpm，10-20min，倒出上清或分装成1ml/管于-20℃或-80℃保存备用。

二包涵体复性(稀释复性法)1. 配制refolding buffer（100-1000ml等体系，视复性效果而定），于冰上或4℃预冷。

2. 用5ml或10ml注射器将溶解后的包涵体（约3-5ml，可分两次加，每次间隔8小时左右）加入注射器内，使之一滴一滴的往refolding buffer内滴下（如果用的是尿素溶解的话，包涵体应该会冻了起来，可用injection buffer溶解后再加入注射器内），慢慢搅拌8-10小时（可适当延长时间）。

（在4℃条件下进行）3. 复性后，可用浓缩杯浓缩样品换液（适合于此蛋白的缓冲液），再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管浓缩换液。

（复性后如果复性液变得浑浊，可低温离心去除沉淀后再浓缩。

）（4℃条件下进行）4. 将样品过柱子，检测复性效果，用于下一步的工作。

包涵体溶解及蛋白纯化

IFN-α包涵体溶解和蛋白纯化
操作程序
用N-十二烷基胺酸钠溶解包涵体沉淀
1.加18mL缓冲液A和2mL 20% DOC储存于包涵体沉淀中。

用组织破碎器充分重悬
沉淀，室温下静置至少10min。

2.悬液于4℃、13000r/min离心10min。

弃去上清（注意留样，样品C），为确保沉
淀得到充分洗涤，再次按步骤一的操作重悬沉淀。

将悬液分成俩个相等的部分，编号#1和#2，于4℃、13000r/min离心10min。

3.对#1管中的沉淀，加19.7mL的缓冲液A和0.3mL的20%SKL储液。

剧烈搅动使
沉淀慢慢溶解。

然后静置30min。

4.#1管中溶解的蛋白悬液，置于4℃、13000r/min离心10min。

收集上清液，弃去
沉淀。

缓冲液A（1000mL）配制：
1mol/L Tris-HCl（PH 7.9）50mL，50mmol/L
0.5mol/L EDTA 1mL，0.5mmol/L
5mol/LNaCl 10ml，50mmol/L
甘油 50mL，5%
缓冲液A+50%甘油
脱氧胆酸钠（DOC）
N-十二烷基胺酸钠（SKL）。

包涵体洗涤纯化

包涵体洗涤纯化-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One11包涵体洗涤试剂1.1裂解液50mmol/L Tris·Cl（pH7.2），10mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl.。

1.2Buffer I20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，100mM NaCl。

1.32M/4M/8M 尿素溶液分别称取2mol/4mol/8mol的尿素，用Buffer I定容至1L即可。

2工程菌的大量表达从平板上挑生长饱满的单克隆菌落接种于25ml LB（含抗生素），37℃振荡培养过夜。

将培养菌液按1:1000扩种，至装有500ml LB（含抗生素）的1000ml三角培养瓶中，培养的瓶数根据需要而定。

37℃振荡培养，至OD600nm1.0左右。

使菌液冷却，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L，25℃，诱导6hr。

收集菌体，4℃，10,000g离心4min。

以培养液体积的1/50量的裂解液悬浮。

冰浴，用超声破碎仪或高压均质机破碎菌体。

超声条件为：输出功率70%，作用2sec、间歇4sec为一个脉冲，共作用时间累计30min/100ml裂解液。

同时保留上清和沉淀部分，分别制样进行SDS-PAGE分析。

3包涵体的洗涤纯化包涵体沉淀以裂解液等体积的2% Triton X100（Buffer I溶解）重悬，37℃，振荡30min。

4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的Buffer I重悬，超声波处理5min/100ml悬浮液。

4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的2% Triton X100（Buffer I 溶解）重悬，37℃，振荡30min。

4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的Buffer I重悬，37℃，振荡30min。

4℃，8,000g，离心10min，沉淀以等体积的2mol/L尿素溶解，室温搅拌30min。

包涵体的纯化方法---张崇文

包涵体的纯化
（一）试剂配制
1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。

2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。

3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。

4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。

1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。

5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。

（二）操作步骤
1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。

2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。

3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。

4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。

将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。

包涵体蛋白纯化方法-moleciularcloning

包涵体蛋白纯化方法-moleciular cloning Purification of Expressed Proteins from Inclusion BodiesBuffers and SolutionsCell lysis buffer I50 mM Tris-Cl (pH 8.0)1 mM EDTA (pH 8.0)100 mM NaClCell lysis buffer II50 mM Tris-Cl (pH 8.0)10 mM EDTA (pH 8.0)100 mM NaCl0.5% (v/v) Triton X-100Deoxycholic acid脱氧胆酸Use a protein grade oft his bile acid胆汁酸/detergent洗涤剂HCl (12 M) (concentrated HCl)Inclusion body solubilization buffer I (prepare just before use) 50 mM Tris-Cl (pH 8.0)1 mM EDTA (pH 8.0)100 mM NaCl8 M urea0.1 M PMSFPrepare the buffer fresh just before useInclusion body solubilization buffer II50 mM KHPO (pH 10.7) 241 mM EDTA (pH 8.0)50 mM NaClKOH (10 N)<!>PMSF (100mM)<!>1× and 2×SDS gel-loading bufferStore 1× and 2×SDS gel-loading buffer lacking dithiothreitol at room temperature.Adddithiothreitol二硫苏糖醇from a 1M stock just before the buffer is used.Enzymes and BuffersDNase I (1 mg/ml )Lysozyme(10 mg/ml )prepare the solution fresh in 20 mM Tris-Cl (pH 8)GelsPolyacrylamide gels (10%) containing SDS<!>For preparation of SDS-polyacrylamide gels used in the separation of proteins,please see Appendix 8.Centeifuges and RotorsSorvall GSA rotor 转子or equivalentSpecial EquipmentpH paper (Optional, please see Step 10.) Polished glass rodVectors and Bacterial StrainsE.coli cells expressing the protein of interest .Grow 1 liter of E.coli cells that have been transformed by any of the methods in Protocols 1-4 and now expresses the protein of interest as inclusion bodies.Preparation of Cell Extract, Centrifuge 1 liter of the cell culture of E. coli expressing the protein of interest at 5000g (5500rpm in a Sorvall SLC-1500 rotor) for 15 minutes at 4?C in preweighed centrifuge bottles.IMPORTANT: Perform Steps 2-4 at 4?C., Remove the supernatant and determine the weight of the E. coli pellet. For each gram (wetweight) of E. coli, add 3 ml of Cell lysis buffer I. Resuspend the pellet by gentle vortexing 震荡or bystirring with a polished glass rod. 用抛光玻璃棒搅拌, For each gram of E. coli, add 4 µl of 100 mM PMSF and then 80 µl of 10 mg/ml lysozyme溶菌酶.Stir the suspension for 20 minutes.Other cocktails鸡尾酒 of protease inhibitors may be added at this step(please see Protocol1)., Stirring continuously不停, add 4 mg of deoxycholic acid脱氧胆酸per gram of E. coli., Store the suspension at 37?C and stir it occasionally 间或with a glass rod. When the lysate裂解液 becomes viscous粘稠, add 20 µl of 1 mg/ml DNase I per gram of E. coli., Store the lysate at room temperature until it is no longer viscous (~30 minutes). Purification and Washing of Inclusion Bodies , Purify and wash the inclusion bodies using one of the followingtwo methods.Method 1: Recover inclusion bodies using Triton X-1001 Centrifuge the cell lysate at maximum speed for 15 minutes at 4?Cin a microfuge.2 Decant the supernatant. Resuspend the pellet颗粒 in 9 volumes of Cell lysis buffer II at 4?C.3 Store the suspension for 5 minutes at room temperature.4 Centrifuge the tube at maximum speed for 15 minutes at 4?C in a microfuge.5 Decant the supernatant and set it aside for the next step. Resuspend the pellet in 100 µl of HO. 26 Remove 10-µl samples of the supernatant and of the resuspended pellet. Mix each sample with 10 µl of 2x SDS gel-loading buffer and analyze the samples by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to determine which fraction contains the protein of interest.7 If necessary, proceed with Step 8 to solubilize 溶解the inclusion bodies.Solubilization of Inclusion Bodies, Centrifuge the appropriate resuspended pellets from Step 7 at maximum speed for 15 minutesat 4?C in a microfuge and suspend them in 100 µl of Inclusion-body solubilization buffer I containing0.1 mM PMSF (freshly added).Store the solution for 1 hour at room temperature.,, Add this solution to 9 volumes of inclusion-body solubilization buffer II and incubate the mixturefor 30 minutes at room temperature. Check that the pH is maintained at 10.7 by spotting smallaliquots等分试样 onto pH paper. If necessary, readjust 微调the pH to 10.7 with 10 N KOH.,, Adjust the pH of the solution to 8.0 with 12 M HCl and store the adjusted solution for at least 30minutes at room temperature.,, Centrifuge the solution at maximum speed for 15 minutes at room temperature in a microfuge.,, Decant the supernatant and set it aside for the next step. Resuspend the pellet in 100 µl of 1xSDS gel-loading buffer.,, Remove 10-µl samples of the supernatant and resuspended pellet. Mix the supernatant samplewith 10 µl of 2x SD S gel-loading buffer. Analyze both samples by SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis to determine the degree of solubilization.Proceed with the additional protocol.。

6HIS 包涵体蛋白纯化方法

6HIS 包涵体蛋白纯化—复性方法
1．摇500ml菌至OD小于0.5时加IPTG在37℃诱导表达3小时。

2．离心，将沉淀置于-20℃冻融。

(可无)
3．用8M尿素重溶沉淀：先用0.5ml tris-cl buffer 将沉淀吹打成悬浮状，再加入20ml 8M尿素，摇匀，室温于脱色摇床上摇20分钟，充分溶解沉淀。

4．12000rpm,15℃以上离心15分钟。

5．挂柱：取上清与平衡好的镍柱柱料混合，室温于脱色摇床上摇20分钟。

6．WASH:ph8.0尿素（8M）十倍体积
7．洗脱：PH5.0
8．选浓度OD在1.0以上的来透析，透析之前加1mMDTT,两种buffer:
IB solubilization(10×):caps(3-[Cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid) 500mM PH11.0 N-lauroylsarcosine(30%)10×
Sometimes: 3M NDSB(10×)
9．先加到4M 尿素in Tris 50mM，并加DTT到1mM按PH8.5
10. 降至2M, 成分同上，并加150mMNaCl
11. 降到1M 同10
12. 最后透析液：Tris 50mM
NaCl 150mM
DTT 1mM
PH8.2
13.再透析去掉DTT。

包涵体蛋白溶解和纯化复性

IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、表达产物处理1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min6、12000g 4℃离心20min7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜二、包涵体的纯化1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用2、取样取离心上清，标记柱前3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱4、取样取柱后，标记柱后三、包涵体复性1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

用蒸馏水彻底清洗透析袋。

放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。

冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。

最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。

包涵体蛋白的纯化与复性

1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min(离心时间和速度应该都不够)。

沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶（暂时我没用）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。

破碎后的匀浆，4℃、12000 rpm离心15 min。

分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

重复一次。

再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。

12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

【备注】包涵体溶解缓冲液（即结合buffer）：20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

包涵体纯化试剂配方

✧ Buffer A 裂解液 500ml1M Tris (pH 6.8）母液 25 ml5M Nacl 母液( M:58.5) 15mlH 20 435ml5%甘油 25ml✧ 1M Tris 母液 ( M:121.14 PH:6.8 )的配置100ml称量12.114gTris 加50ml 水，PH 由浓Hcl 调节至6.8，定容至100ml✧1M Tris-HCl （M:121.14 PH 7.9）母液配置100ml称量12.114gTris 加50ml 水，PH 由浓Hcl 调节至7.9，定容至100ml✧ 5M Nacl 母液( M:58.5) 配置100ml称量29.25g Nacl 加水定容至100ml✧ 2M 尿素（M:60.06）裂解缓冲液250ml1M Tris (pH 6.8）母液12.5 ml + 5M Nacl 母液 7.5ml + 甘油 12.5ml+30.030g Urea定容至250ml✧ 1% T ri t on X-100裂解缓冲液250ml1MTris (pH6.8）母液12.5ml +5M Nacl 母液7.5ml +甘油12.5ml+Triton X-100(M:646.86 ) 2.5ml✧ 1M 咪唑（M:68.0773）母液配置称量6.80773g 咪唑定容至100ml✧ 透析袋处理液（PH8.0）500ml2%NaHCO3 称量NaHCO3 10g1mM EDTA （M:292.248 称量0.14624g ）（若为EDTA 二钠M ：372.2 称量0.1861g ）✧Binding BufferElution Buffer 各100ml ，定容至100ml 注：Elution Buffer 咪唑梯度浓度：20mM 加母液2ml ；40mM 加母液4ml ；80mM 加母液8ml ；150加母液15ml ；250mM 加母液25ml ；300加母液30ml ；500加母液50ml成分Tris-HCl （PH 7.9）咪唑 NaCl 尿素 Binding Buffer 1MTris-HCl（M:121.14 PH7.9）母液 2ml1M 咪唑（M:68.0773）母液 0.5ml 5M Nacl 母液 10ml 8M(即称48.048gUrea) Elution Buffer1MTris-HCl（M:121.14 PH7.9）母液 2ml 1M 咪唑（M:68.0773）母液 50ml 5M Nacl 母液 10ml 8M(即称48.048gUrea)。

包涵体表达蛋白的纯化方法Purification of Expressed Proteins from Inclusion Bodies

包涵体表达蛋白的纯化方法Purification of Expressed Proteins from Inclusion Bodies试剂和溶液Cell lysis buffer I : 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM NaCl;Cell lysis buffer II: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.5% (v/v) Triton X-100; 脱氧胆酸(蛋白纯); HCl (12 M) (浓盐酸);包含体溶解缓冲液I (用前准备) :50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM NaCl, 8 M urea, 0.1 M PMSF or Pefabloc SC;包含体溶解缓冲液II: 50 mM KH2PO4 (pH 10.7), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM NaCl; KOH (10 N); PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟)(17.4 mg/ml溶于异丙醇中-20°C)注：可选择PMSF或Pefabloc SC(4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐),在缓冲溶液中无毒稳定.Tris-Cl (0.1 M, pH 8.5)尿素用于第7步方法2.准备0.1 M Tris-Cl (pH 8.5)和浓度递增的尿素(e.g., 0.5, 1, 2, and 5 M). 因为尿素在水溶液中分解，用新配的尿素立即使用。

载体和寄主：表达包含体形式的目的蛋白的大肠杆菌(1L培养物)。

酶和缓冲液：DNase I (1 mg/ml in 20 mM Tris-Cl [pH 7.8]), Lysozyme(溶菌酶)Gels/Loading Buffers: 10%含SDS聚丙烯酰胺凝胶, 1×SDS 凝胶上样缓冲液：50 mM Tris-Cl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS分析纯, 0.1% (w/v) 溴酚蓝;在第13步用缓冲液前，加1 M二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)储液到终浓度100 mM.2x SDS上样缓冲液: 100 mM Tris-Cl (pH 6.8), 4% (w/v) SDS分析纯, 0.2% (w/v) 溴苯酚兰20% 甘油;在第7和14步用前加1 M二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)储液到终浓度100 mM.离心机/转子/离心管:Sorvall SLC-1500 rotor (4°C)；其他材料:玻璃棒(磨光的), pH试纸.实验步骤：1.用预称重的离心管于4°C离心1L表达目的蛋白的E. coli培养液5000g(5500rpm in a Sorvall SLC-1500 rotor) 15 min.重要：完成步骤2-4 在4°C.2.倒掉上清确定E. coli沉淀重量. 每克(wet weight) E. coli加3 ml cell lysis buffer I温和蜗旋或通过磨光的玻璃棒搅动来重悬沉淀.3.每克E. coli加4 µl 100 mM PMSF 或Pefabloc SC及80µl的10g/l lysozyme.搅动混匀20min.4.继续搅拌, 每克E. coli加4 mg脱氧胆酸.5.置于37°C悬浮,偶尔用玻璃棒搅动.当溶解产物变粘稠，每克E. coli加20µl 1mg/ml DNase I.6.室温静置溶菌产物直到不再粘稠(约30 minutes).7.纯化和洗涤包含体有下面两种方法.Method 1:用Triton X-100 复性包含体a.高速离心细胞溶解产物4°C 15 min.b.倒掉上清. 在4°C重悬沉淀于9倍体积cell lysis buffer II.c.室温静置悬浮液5min。

包涵体制备,变复性,纯化

制备包涵体1、超声破碎细胞2、4 ℃，12000rpm，离心10 m in, 弃上清收集包涵体.3、所得的包涵体加入1\10 体积的体积分数为1% TritonX-100液洗涤2 次4、4 ℃、12 000 rpm、离心2 m in, 沉淀即为包涵体,包涵体蛋白的变性复性方法一1、在上述包涵体中加入19、7 mL 缓冲液A (50 mmol\L Tris-HCl, 0.5 mmol\LEDTA , 0.5mmol\L DTT , 50mmol\L NaCl, 5 % 甘油) 和0.3mL 20% N-十二烷基肌氨酸钠贮存液2、剧烈搅动重悬，25OC下磁力搅拌2-3h使沉淀缓慢溶解3、4 ℃，12 000 rpm、离心10 m in, 弃沉淀4、加入PEG-6000 (终体积分数为0、2% )、氧化型谷胱甘肽(终体积分数为1mmol\L )、还原型谷胱甘肽(终浓度为2 mmol\L ),静置2h5、以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.方法二1、在上述包涵体中加入5mL 浓度为8mol\L 的尿素剧烈搅动, 25 ℃下用磁力搅拌器不断搅拌2～ 3 h 使沉淀缓慢溶解.2、4 ℃,12 000 rpm、离心10m in, 弃沉淀3、所得上清加入15mL pH8、0 的PBS 溶液(使尿素的浓度降低以利于复性) 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.检测1、取出30 uL 备用2、向30 uL样品中加入7、5 uL 的5 倍LSB上样缓冲液, 100℃沸水处理5～10 min, 离心后取5 uL 上清上样, SDS-PAGE 检测相关试剂Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。

包涵体纯化

1. 融合蛋白上清液及包涵体溶解液的制备1) 按照摸索出的最佳表达条件集菌400mL，6000rpm离心10min，收集菌体；2) 用40ml的缓冲液重悬菌体进行洗涤，重离心弃上清；3) 加40ml冰浴的缓冲液，重悬菌体沉淀4) 冰上超声破碎菌体，超声2s，间隔10s，功率800W，超声40次；5) 18000rpm离心30min，取上清备用；6) 向离心后沉淀中加入40ml的包涵体洗涤液，重悬沉淀，冰浴超声洗涤一次：超声2s，间隔10s，功率1200W，超声40次；7) 12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；8) 包涵体沉淀的溶解：向洗涤后的包涵体沉淀中加入20ml的包涵体溶解液，用5mL枪头吹散沉淀，室温下放置1个小时使其充分溶解，18000rpm离心30min，取上清即得包涵体溶解液；9) 将包涵体溶解液装入透析袋中（透析范围：8000-14000），置于含4mol/L尿素的透析液中，4℃透析2h，然后转入含2mol/L尿素的透析液中，4℃透析12h，最后转入含0mol/L尿素的透析液中，4℃透析24h，充分脱尿素。

2. 利用凝血酶切割融合蛋白得到目的蛋白按照10bp凝血酶/mg融合蛋白的比例加入凝血酶，25℃水浴切割12h。

3. 利用GST亲和层析纯化融合蛋白菌体破碎后上清或者透析后包涵体溶解液1) 30ml的1×PBS预平衡Glutathione-Sepharose 2ml柱（含1ml Glutathione-Sepharose亲和介质），液体的流速0.4ml/min；2) 上样：菌体破碎后上清或者透析后包涵体溶解液过Glutathione-Sepharose 2ml柱，反复过两次；3) 洗涤杂蛋白：用10ml的1×PBS洗涤杂蛋白；4) 洗脱：向柱子中加入洗脱液（10mM reduced Glutathione）进行洗脱，利用记录仪记录洗脱峰；5) 收集洗脱液，利用Bradford法检测蛋白浓度；6) 用30ml的1×PBS洗涤Glutathione-Sepharose 2ml柱；7) 用10ml的含有20%乙醇的1×PBS洗涤Glutathione-Sepharose 2ml柱，4℃保存。

包涵体变性亲和层析复性方法

包涵体变性及亲和层析复性方法实验材料裂解液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0洗涤液：20 mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 3M 尿素，pH 8.0变性液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，0.5M NaCl，20mM 咪唑，pH 8.5洗脱液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，500mM 咪唑，pH 8.5复性液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 M L-Arg, 0.5 mM GSH, 0.05 mM GSSG, 5% 甘油，1% PEG实验方法：1.包涵体的变性：收集菌体，加入裂解液，高压破碎，12000rpm离心30min，沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变性液（1g包涵体加入15ml），碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离心30min取上清。

2.包涵体的纯化：上述变性液上样至5 ml Ni柱，用变性液平衡，用pH 4.5的20 mM NaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM, 100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。

3.包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用变性液调节其浓度至0.5 mg/ml左右。

再透析至含有4M尿素的复性液中，10℃透析6 h，然后透析至含有2 M尿素的复性液中，透析8 h；再透析至含有1M尿素的复性液中，透析12h; 最后透析至储存缓冲液(20 mM Tris-HCl. 50 mM NaCl ,20 % 甘油, pH 8.0)中。

5000 rpm 离心10 min, 取上清进行还原胶及非还原胶鉴定，并进行酶学性质检测。

包涵体的处理

包涵体的处理(取自姜孝玉师兄)1、包涵体的洗涤溶液（10mM Tris-HCl（pH7.0），1mMEDTA）用于超声和洗涤，溶液（0.1M Tris-HCl （pH8.0），10mM EDTA，0.5% Triton X-100）和溶液（0.1M Tris-HCl（pH8.5），10mM EDTA，2M尿素）用于包涵体洗涤。

4.1.2.14.1 重组蛋白Src I包涵体洗涤条件的摸索离心收集经诱导表达的菌液，按1g湿菌10ml的比例加入TE缓冲液重新悬浮菌体，超声破碎细菌（参考步骤4.1.2.13.1），4℃、5,000rpm离心10min，收集沉淀（分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析）；按1g湿菌10ml的比例加入50mM PB(pH6.4),0.5MNaCl溶液，充分分散沉淀后，在磁力搅拌器上搅拌30min 以上，4℃、5,000rpm离心10min，收集沉淀（分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 分析）；按1g湿菌10ml的比例加入100mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM EDTA, 适当浓度的Triton X-100溶液，充分分散沉淀后，在磁力搅拌器上搅拌30min以上，4℃、5,000rpm离心10min，收集沉淀（分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析）；按1g湿菌10ml的比例加入100mM Tris-HCl (pH8.5), 10 mM EDTA, 适当浓度的尿素溶液，充分分散沉淀后，在磁力搅拌器上搅拌30 min以上，4℃、5,000rpm 离心10min，收集沉淀（分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析）；洗涤包涵体时，在其他条件不变的情况下，将Tris缓冲系统换成PB缓冲系统进行洗涤，SDS-PAGE分析洗涤效果。

洗涤包涵体时，在其他条件不变的情况下，改变洗涤缓冲液中Triton X-100的浓度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%）进行洗涤，SDS-PAGE分析洗涤效果。

包涵体分离纯化

包涵体分离纯化1. 2×YT 液体培养基：Tryptone 8gY east Extract 5gNaCl 2.5g定容至500ml，高压灭菌挑取单菌落接种于3 ml 2YT 液体培养基（加Amp）（不加蔗糖）中，于37℃，180rpm/min 摇床培养过夜。

取过夜培养物按1：100 接种于新鲜的2×YT 液体培养基（加蔗糖）（Amp50μg/ml）中，在37℃摇床培养，在菌种长到OD600约为0.4 时，向培养基中加入IPTG，使IPTG 的终浓度为0.5mM，诱导表达4h。

2.0．1MTris-HCL 缓冲液（PH7.5）：称取6.05gTris，水溶解，PH7.5，定容至500ml。

20mMTris-HCL 缓冲液（PH7.5）：0.1MTris-HCL 缓冲液稀释五倍。

包涵体洗涤液Ⅰ：TritonX－100 1ml NaCl 0.585g Urea 6g 0.1MTris-HCl20ml 定容至100ml，PH7.5。

包涵体洗涤液Ⅱ：将包涵体洗涤液Ⅰ稀释10 倍。

将诱导表达后的菌液离心收集菌体，，用事先预冷的20mM Tris-HCl（PH7.5）将菌体洗涤一次，将菌体重悬于20mM Tris-HCl（PH7.5）缓冲液中（或者加1mg/ml 溶菌酶），-80℃，反复冻融后，超声波破碎菌体，12000 rpm/min 离心5min，收集包涵体。

将收集的包涵体依次用洗液（溶液Ⅰ和溶液Ⅱ）洗涤，每种溶液洗涤三次。

DS-PAGE 检测洗涤效果。

洗涤后的包涵体重悬于20mMTris-HCl (PH7.5)中保存，每克湿重包涵体加入10ml 20mM Tris-HCl (PH7.5)。

3.包涵体溶解将20mM Tris-HCl溶解的包涵体离心收集沉淀，每克包涵体湿重加20ml 20mM Tris-HCl，8M 尿素，PH7.5 的包涵体溶解液，悬涡震荡2 小时，使包涵体充分溶解，12000rpm/min 离心5min，取上清，过滤除杂。

包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤?1、包涵体的洗涤问题?通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

?包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

?2、如何得到比较纯的包涵体?对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3?mM。

去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

?对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

包涵体的分离纯化.

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10K G频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。