包涵体纯化液体配制

包涵体洗涤液I

50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）

100 mmol/L NaCl

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

0.5% (v/v) TritonX-100

包涵体洗涤液II

包涵体洗涤液I 2 mol/L尿素

包涵体洗涤液III（pH9.0）

包涵体洗涤液I 4 mol/L尿素

包涵体溶解液

50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0~10.0）

100 mmol/L NaCl

1 mmol/L EDTA（pH8.0）

0.5%(v/v) TritonX-100

8 mol/L尿素

5 mmol/L DTT

包涵体复性缓冲液（pH 8.0）

1× PBS

1 mmol/L EDTA（pH 8.0）

2.2.2.6 VP1重组蛋白的纯化回收

2.2.2.6.1 包涵体洗涤

按最佳条件诱导表达基因工程重组菌400 mL，离心收集菌体。冰浴中进行超声裂解，裂解后离心收集沉淀。将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液I中，混匀后室温放置5~10 min，4℃ 12000 r/min离心20 min，分别收集上清与沉淀。接着，再将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液II中，混匀后室温放置5~10 min，同样12000 r/min离心20 min后收集上清与沉淀。最后将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液III中，混匀后室温放置5~10 min，4℃ 12000 r/ min离心20 min后收集上清与沉淀。取少量的洗涤上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的洗涤情况。

2.2.2.6.2 包涵体溶解

用包涵体溶解液溶解沉淀，初始体积为100 mL的诱导菌约用10 mL包涵体溶解液溶解，室温作用1~2 h，其间不断振荡。4℃ 12000 r/min离心20 min后收集上清和沉淀。取少量溶解上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的溶解情况。

2.2.2.6.3 包涵体的复性

将溶解的包涵体上清装入已处理的透析袋内，置复性缓冲液中4℃条件下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减4.5 mol/L、3.5 mol/L、2.5 mol/L、1.5 mol/L、0.5 mol/L和0 mol/L，（ 6M 4M 2M 0M PBS H2O）换液间隔时间为10~12 h。取出透析后的蛋白溶液于4℃ 12000 r/min离心20 min，收集上清。分别取少量的上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的复性情况。

2.2.2.6.4 SDS-PAGE电泳及电洗脱

参照分子克隆实验指南的方法配制12%的分离胶，按Bio-RAD产品说明书装好制胶板，加入分离胶（使梳子到胶面的距离约1 cm），胶面上加一层水，室温放置待胶充分聚合后吸干水份，加入配好的浓缩胶，装上梳子，胶充分聚合后拔出梳子即可上样进行电泳。收集复性后的包涵体加入等体积2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，12000 r/min离心2 min，取上清10 上样，同时设标准蛋白对照孔。恒压130 V电泳1~1.5 h，电泳完毕后用适量染色液

浸泡凝胶染色30～45 min。脱色液脱色2~4 h，其间更换新的脱色液，直至条带清晰，观察SDS-PAGE电泳后，包涵体中目的蛋白的分离情况。

SDS-PAGE电泳完成后，取出凝胶直接置于100 mmol/L的KCl溶液中4℃浸泡2 h。电泳条带清晰时参照标准蛋白从凝胶上切下表达产物所处的条带，装入透析袋中。加适量的pH 7.2的PB缓冲液，恒压30 V电泳30 min。收集电洗脱液，即纯化的目的重组蛋白。用紫外分光光度计测定样品在波长260 nm和280 nm时的光吸收值，按下式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.45×A280－0.74×A260)×稀释倍数。分装后，–20℃保存备用。