包涵体纯化
包含体纯化步骤(精)
同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。
2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50MmNaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。
3、4℃12,000rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。
4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。
2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。
根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进行纯化。
2.2.3 天然条件下纯化可溶形式的目的蛋白目的蛋白的表达和收获：用3.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。
4℃下10,000 rpm离心5min弃上清，向细菌沉淀中加入4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100mL培养液加入4mL结合缓冲液，重悬菌体。
－40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。
再在冰水浴中超声10min(超声10s, 间隔10s)，破碎菌体。
4℃下10,000 rpm离心20min，保留上清液。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤?1、包涵体的洗涤问题?通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
?包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
?2、如何得到比较纯的包涵体?对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3?mM。
去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
?对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体产物的纯化工艺
包涵体产物的纯化工艺
纯化涉及从原料中分离和去除杂质以获得纯净化合物的工艺。
对于包含有机或无机物的体产物，其纯化工艺可以根据具体情况进行调整，但以下是一般常用的几种纯化工艺:
1. 结晶：通过温度控制和溶剂选择，使目标化合物从溶液中结晶出来，然后进行过滤、洗涤和干燥等步骤，以获得纯净的产物。
2. 蒸馏：利用成分之间的沸点差异来分离和纯化混合物。
通过加热混合物，使成分按照沸点的高低逐渐蒸发和冷凝，从而分离目标化合物。
3. 萃取：利用不同物质在不同溶剂中的溶解度差异，将目标化合物从混合物中分离提取出来。
常见的萃取方法包括溶剂萃取、液液萃取和固相萃取等。
4. 色谱：利用样品成分在移动相和固定相之间的差异，通过一系列分离和纯化步骤来分离和纯化产物。
常见的色谱方法包括薄层色谱、柱层析、高效液相色谱和气相色谱等。
5. 活性炭吸附：通过将目标化合物吸附在活性炭上，去除混合物中的杂质物质，从而纯化产物。
这种方法常用于水处理、空气净化和溶剂回收等领域。
6. 晶体化学：通过对化合物晶体结构的解析和再合成，消除晶体中的杂质，实
现产物纯化。
以上是一些常见的纯化工艺，具体选择哪种工艺取决于产物性质、目标纯度要求、经济性和实际应用等因素。
包涵体纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握包涵体纯化的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用离子交换层析法对包涵体进行纯化。
3. 评估包涵体纯化效果，并探讨优化纯化条件的方法。
二、实验原理包涵体是细菌表达外源蛋白时形成的一种不溶性蛋白质聚集体。
由于包涵体中的蛋白质缺乏生物活性，因此需要通过一系列操作将其溶解、复性，并最终纯化得到具有生物活性的蛋白质。
本实验采用离子交换层析法对包涵体进行纯化，通过改变缓冲液中的离子强度和pH值，使包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合，从而实现蛋白质的分离和纯化。
三、实验材料1. 包涵体样品2. 离子交换层析柱3. 标准蛋白样品4. 标准缓冲液5. 蛋白质浓度测定试剂盒6. 超声波破碎仪7. 离心机8. 荧光分光光度计9. 数据处理软件四、实验步骤1. 包涵体样品的处理将包涵体样品用超声波破碎仪处理，使包涵体溶解。
然后将溶液离心，取上清液作为后续实验的样品。
2. 样品预处理将样品用缓冲液稀释，调整离子强度和pH值，使包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合。
3. 离子交换层析将预处理后的样品上柱，用缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
4. 蛋白质纯化效果评估采用蛋白质浓度测定试剂盒对洗脱液进行蛋白质浓度测定，比较不同洗脱液中的蛋白质浓度，评估纯化效果。
5. 数据处理与分析利用数据处理软件对实验数据进行统计分析，探讨优化纯化条件的方法。
五、实验结果1. 包涵体样品经过超声波破碎后，溶液变得清澈，说明包涵体已成功溶解。
2. 通过离子交换层析法，成功将包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合，实现了蛋白质的分离和纯化。
3. 通过蛋白质浓度测定，发现洗脱液中的蛋白质浓度明显高于未处理的样品，说明纯化效果良好。
4. 通过数据分析，发现改变缓冲液中的离子强度和pH值对包涵体纯化效果有显著影响。
在一定范围内，增加离子强度和降低pH值有利于提高蛋白质的纯化效果。
六、实验结论1. 本实验成功实现了包涵体的纯化，并获得了具有生物活性的蛋白质。
包涵体的纯化和复性总结__最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备重组蛋白在大肠杆菌、酵母、哺乳动物中的表达可分为三种形式：胞外分泌表达、胞内可溶性表达和胞内不溶性表达（即产物以包涵体形式存在）。
以包涵体形式存在的重组蛋白是无生物活性的，需要进行复性处理，然后再进行分离纯化。
包涵体纯化与传统生物大分子的分离纯化方法相似，即以分子的等电点、溶解性、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等特征为基础进行纯化。
一、常用的包涵体纯化方法1. 金属亲和层析该方法主要利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和金属离子之间的相互作用来进行蛋白纯化。
我们在载体构建时可以加上一些亲和性标签（如His标签、GST标签、Flag标签等），以便采取亲和纯化的方式纯化蛋白。
利用Ni2+和6×His tag之间的亲和性，通过在蛋白的N端或C端加上6～10个组氨酸，在一般或变性条件下借助它与Ni2+螯合柱的紧密结合能力，采用咪唑洗脱，或降低PH使组氨酸充分质子化，使其不再与Ni2+结合，从而分离纯化出带有6×His tag的融合蛋白，纯度通常能达到90%以上。
2．离子交换层析离子交换层析是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离的方法。
常用的离子交换剂有羧甲基纤维素（阳离子交换剂，弱酸型）和二乙基氨基乙基纤维素（阴离子交换剂，弱碱型）。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，需要通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将其洗脱下来。
根据蛋白质结合能力不同，洗脱的速度会存在差异，通常结合较弱的蛋白质先被洗脱。
反之，阳离子交换基质会结合带有正电荷的蛋白质，可以通过提高洗脱液的PH或增加洗脱液中的盐浓度将蛋白洗脱下来。
3．凝胶过滤层析凝胶过滤层析通常又称为分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状达到分离和纯化的目的。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
此方法的优点在于层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷并且吸附力弱，可较广的温度范围内进行。
基因工程包涵体的纯化方法
基因工程包涵体的纯化方法基因工程可真是个神奇的领域，像是现代科技的魔法师，把DNA这个小家伙们玩弄得团团转。
在这片神秘的土地上，包涵体就像是隐藏的宝藏，得先把它们找出来，再通过纯化的方法把这些小宝贝洗净，才能让它们为我们所用。
今天，我们就来聊聊基因工程包涵体的纯化方法，让这趟旅程轻松愉快。
1. 什么是包涵体？首先，包涵体可不是某种古怪的生物，它们其实是细胞在生产某些蛋白质时，形成的一种颗粒。
就像是做饭时，锅里油烟聚集的那些小油滴，虽然它们看起来不太好，但里面可藏着好东西。
你要知道，包涵体里面有大量的目标蛋白质，但通常它们会和其他杂质混在一起，像是大海捞针，得费点功夫才能捞出来。
1.1 包涵体的形成当细胞用上基因工程的技术，强行让某种蛋白质“上班”时，有时候它们就会不太乖，聚集成包涵体。
这就像你在做作业时，有的题目就特别难，结果一堆答案写错了，最后只好把它们堆到一边。
虽然包涵体一开始可能看起来像个废物，但其实它们是生产特定蛋白质的一种“副产品”。
1.2 包涵体的用途那包涵体有什么用呢？别小看了它们，它们可是制药、疫苗开发的重要角色。
有的包涵体能转化为活跃的蛋白质，成为我们需要的药物，甚至可以用于研究新治疗方法，简直就是科研界的“黑马”。
所以，找到它们、纯化它们，那可是相当重要的任务。
2. 包涵体的纯化步骤接下来，我们就要聊聊如何把这些包涵体给纯化出来，步骤其实不复杂，但得有点耐心。
2.1 细胞裂解首先，得把细胞给撬开，就像剥开一个鸡蛋，才能见到里面的蛋黄。
这里我们通常会用一些裂解缓冲液，像是加盐的水，帮助细胞膜变得松软。
然后，咱们可以用超声波处理、化学试剂或者冷冻融化的方式把细胞打散，让包涵体慢慢浮出来。
2.2 离心分离一旦细胞裂解，包涵体就会在液体中游荡。
这时候，就要用离心机来大显身手了。
离心机就像是一位厨师，用强大的“旋转功力”把细胞残骸和包涵体分开。
你可以想象，把一大锅汤放进离心机，旋转后，沉淀物就会在底下，清汤会在上面。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。
包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。
小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。
根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤引言：包涵体蛋白纯化是生物技术和生物制药领域中重要的工艺步骤之一。
通过纯化包涵体蛋白，可以获得高纯度的目标蛋白，为后续的研究和应用提供了基础。
本文将介绍包涵体蛋白纯化的一般步骤，包括细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等。
一、细胞破碎：细胞破碎是包涵体蛋白纯化的第一步。
通常使用机械方法（如超声波破碎或高压均质）或化学方法（如洗涤剂破碎）来破碎细胞，释放包涵体蛋白。
需要注意的是，破碎条件应该使得包涵体蛋白能够充分溶解而不会发生蛋白质降解。
二、包涵体回收：包涵体蛋白通常以包涵体的形式存在于细胞裂解液中。
包涵体回收是将包涵体从其他细胞成分中分离出来的过程。
一种常用的方法是通过离心将细胞碎片和其他细胞成分与包涵体分离。
此外，还可以使用过滤、沉淀或超滤等技术来实现包涵体的回收。
三、包涵体溶解：包涵体蛋白在还原条件下通常以不溶性的形式存在。
为了使包涵体蛋白能够溶解，通常需要添加变性剂（如尿素或胍氯酸）和还原剂（如二硫醇）。
通过调节溶解条件，可以使得包涵体蛋白迅速溶解为可溶性蛋白。
四、亲和层析：亲和层析是包涵体蛋白纯化的关键步骤之一。
通过将目标蛋白与亲和层析介质上的亲和配体结合，可以实现目标蛋白的富集和纯化。
亲和配体可以是金属离子、抗体或亲和标签等。
在亲和层析过程中，需要注意选择合适的亲和配体和适宜的洗脱条件，以实现对目标蛋白的高效纯化。
五、蛋白质再折叠：由于包涵体蛋白在还原条件下溶解，其折叠状态通常不完整。
为了使得目标蛋白具有正确的结构和功能，需要对其进行再折叠。
常用的再折叠方法包括逐渐降低变性剂浓度、添加折叠辅助剂和调节pH 值等。
通过适当的再折叠条件，可以使得目标蛋白恢复到天然的折叠状态。
结论：包涵体蛋白纯化是一项复杂的工艺步骤，需要经过细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等步骤。
通过这些步骤的有序进行，可以得到高纯度和高活性的包涵体蛋白。
随着生物技术和生物制药的不断发展，对包涵体蛋白纯化技术的要求也越来越高，希望通过不断的研究和创新，能够进一步提高包涵体蛋白纯化的效率和纯度，为生物医药领域的研究和应用提供更好的支持。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。
包涵体蛋白纯化
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体纯化
1. 融合蛋白上清液及包涵体溶解液的制备1) 按照摸索出的最佳表达条件集菌400mL，6000rpm离心10min，收集菌体；2) 用40ml的缓冲液重悬菌体进行洗涤，重离心弃上清；3) 加40ml冰浴的缓冲液，重悬菌体沉淀4) 冰上超声破碎菌体，超声2s，间隔10s，功率800W，超声40次；5) 18000rpm离心30min，取上清备用；6) 向离心后沉淀中加入40ml的包涵体洗涤液，重悬沉淀，冰浴超声洗涤一次：超声2s，间隔10s，功率1200W，超声40次；7) 12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；8) 包涵体沉淀的溶解：向洗涤后的包涵体沉淀中加入20ml的包涵体溶解液，用5mL枪头吹散沉淀，室温下放置1个小时使其充分溶解，18000rpm离心30min，取上清即得包涵体溶解液；9) 将包涵体溶解液装入透析袋中（透析范围：8000-14000），置于含4mol/L尿素的透析液中，4℃透析2h，然后转入含2mol/L尿素的透析液中，4℃透析12h，最后转入含0mol/L尿素的透析液中，4℃透析24h，充分脱尿素。
2. 利用凝血酶切割融合蛋白得到目的蛋白按照10bp凝血酶/mg融合蛋白的比例加入凝血酶，25℃水浴切割12h。
3. 利用GST亲和层析纯化融合蛋白菌体破碎后上清或者透析后包涵体溶解液1) 30ml的1×PBS预平衡Glutathione-Sepharose 2ml柱（含1ml Glutathione-Sepharose亲和介质），液体的流速0.4ml/min；2) 上样：菌体破碎后上清或者透析后包涵体溶解液过Glutathione-Sepharose 2ml柱，反复过两次；3) 洗涤杂蛋白：用10ml的1×PBS洗涤杂蛋白；4) 洗脱：向柱子中加入洗脱液（10mM reduced Glutathione）进行洗脱，利用记录仪记录洗脱峰；5) 收集洗脱液，利用Bradford法检测蛋白浓度；6) 用30ml的1×PBS洗涤Glutathione-Sepharose 2ml柱；7) 用10ml的含有20%乙醇的1×PBS洗涤Glutathione-Sepharose 2ml柱，4℃保存。
包涵体的纯化
根据不同用途，采用相应溶剂溶解包涵体。
①如用于免疫注射，用1.5倍沉淀体积旳PH8.0， 8M尿素溶解，并于4℃保存。
②如用于纯化，用2倍沉淀体积旳PH8.0旳PBS， 2%SKL（十二烷基肌氨酸钠）孵育过夜，溶解 包涵体沉淀，10000rpm，7min离心，搜集上清， 4℃保存。
5、复性
包涵体旳复性是一种复杂旳过程，我们企 业生产旳融合蛋白用作抗原免疫兔子，所以不需 要作复性处理。
白水解酶活性，在包涵体旳溶解和复性过程中 可造成重组蛋白质旳降解。
试验室用旳是低浓度旳变性剂—2M尿素在 50mM Tris pH8.0，1mM EDTA中洗涤和用温 和去垢剂1% TritonX-100洗涤清除膜碎片和膜 蛋白。
4 、溶解
变性蛋白只有空间构象旳破坏，一般以为蛋白质 变性本质是次级键、二硫键旳破坏，并不涉及一级 构造旳变化。包涵体旳溶解主要任务是拆开错配旳 二硫键和次级键 。
5、以包涵体形式体现旳重组蛋白丧失了原有旳生物 活性，必须经过有效旳变性复性操作，才干回收得到 具有正确空间构象（因而具有生物活性）旳目旳蛋白， 体外复性蛋白质旳成功率相当低，一般不超
1 、破菌
基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用： 机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规 模下且菌量较少旳情况下效果很好，因为能量 传递和局部产热等原因，极难用于大致积细胞 悬液旳破碎，这么部分未破碎细胞与包涵体混 在一起，给后期纯化带来困难。所以，在较大 规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌旳细胞膜，再 结合超声破碎措施，可明显提升包涵体旳纯度 和回收率。
累，轻易形成包涵体沉淀。
5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH
旳环境下，其本身固有旳溶解度对于包涵体旳形成比较
关键，即是说，有旳体现产率很高，如Aspartase和
包涵体的纯化
包涵体的纯化关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体纯化
最近在做原核表达，包涵体。
以前也做过，但经验不多。
从园子里也学到不少。
一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正1. 首先介绍一下背景。
载体是novagen公司的pET22b，Amp抗性。
菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。
第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。
PCR，酶切都正确。
但没等测序结果出来就开始做了。
失败了。
曾在园子求助。
后来证明是引物错误。
我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。
这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。
引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。
后来重新构建，转化，诱导。
第一次诱导时根本就没带。
见附图（图片质量太差了，sorry，下面几个帖会逐渐好转。
我们都在失败中提高，进步，不是吗）然后开始找闷头原因。
周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。
这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp。
对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。
到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。
一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。
当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。
所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。
转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。
包涵体(inclusion body)的纯化
包涵体（inclusion body）的纯化包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。
包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、R NA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制1、缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100mM NaCl。
2、缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA，100 mM NaCl，1% NP-40。
3、缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100（V/V），4M脲素。
4、缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，3% Triton X-100 。
5、缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0. 5%Triton X-100，2M 盐酸胍。
6、缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
包涵体蛋白的分离纯化
包涵体蛋白的分离纯化赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。
包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关.细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型.包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。
包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%~95％,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
1. 包涵体的形成重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时，都可形成包涵体.通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体，一般含有50%以上重组蛋白，其余为核糖体组分、RN A聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分］。
由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。
包涵体形成的原因主要有以下几点：⑴蛋白合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠.蛋白折叠的动力学模型表明：蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。
中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应，因此，折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等) ，致使中间体大量积累，容易形成包涵体；⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成，如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等；⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成；⑸包涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白.包涵体蛋白虽然不具有天然结构、没有活性，但在基因工程中生产重组蛋白，包涵体的形成有一定优势,主要表现在: ⑴重组蛋白高水平表达,有时候可达细胞总蛋白的30％；⑵包涵体密度高（约1. 3mg/m l)[ 12 ］，重组蛋白相对较纯，很容易与细胞成分分离，可减少后续纯化步骤；⑶包涵体结构致密,因而在一定程度上避免了大肠杆菌蛋白酶的降解; ⑷易于毒性蛋白和膜蛋白表达;⑸包涵体的形成降低了重组蛋白在胞质中的浓度,有利于目的基因的进一步表达。
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包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
破菌：1、机械破碎2、超声破碎3、化学方法破碎分离：1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
溶解：常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。
其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。
问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。
极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。
如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。
有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。
这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。
有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。
增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。
还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。
还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。
在较粗放的条件下，可以使用5ml/l 的浓度。
还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。
对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
复性：通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。
对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
复性中常采用的方法有：稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF 复性据说是通过柱上复性进行的。
常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。
还原剂的去除：还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。
但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。
常用的氧化方法有：空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。
复性的效率：复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。
一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。
复性时的蛋白浓度：一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。
复性效果的检测：根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
几个复性的实例：1、MHCII JBC 269（47）：1994增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.复性：10倍稀释到10mMDTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。
纯化：一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC 纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。
从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。
当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。
蛋白复性（二）-基因重组蛋白质的体外复性(推荐！)(2007-05-02 10:25:02) 转载标签：专业助手分类：专业学习志摘要基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。