质粒DNA提取方案(碱裂解法)
SDS碱裂解法制备质粒DNA
SDS碱裂解法制备质粒DNA步骤（1）挑取转化后的单菌落，接种到2ml的含有适当抗生素的丰富培养基中，37℃振摇培养过夜（培养物的体积小于溶液体积的1/4，否则容器不易盖紧，剧烈振摇培养）（2）收菌，将菌液倒入离心管中，4℃，12500r/min，3min。
（离心后将上清液倒入费废液缸中，倒扣在吸水纸上，若还有液体残留，用移液枪吸出）（3）将细菌沉淀重悬于100μl的预冷的碱性裂解液I（Glu, EDTA, Tris-Hcl）中，涡旋振荡。
（4）加200μl新配置的碱性裂解液II(0.2M NaOH,1%SDS)于每管细菌重悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，切勿振荡，将离心管放置在冰上3-5min. （5）加150μl预冷的碱性裂解液III（CH3COOH,CH3COONa），盖紧管口，反复颠倒数次，使得溶液在粘稠度额细菌裂解物中分散均匀。
冰上防止3-5min。
（6）离心（4℃，12000r/min，6min），并将上清转移到另一个离心管中。
（7）在通风橱内加400μl的氯仿：异戊醇（24:1）（8）抽提：将管放在漂浮板上，划8字8min，后离心（4℃，12000r/min,7min），吸取上清液300μl到另一个离心管中。
（9）加无水乙醇600μl，混匀放置在-20℃沉淀15min，后离心（4℃，12000r/min,15min）（10）小心吸去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，加70%乙醇700μl洗涤沉淀，弹起沉淀，浸泡一会，离心（4℃，12000r/min,4min），洗涤两次。
（11）倒掉上清，甩一下，吸去上清，晾干。
（12）TRE溶解（1mlTE，1μlRNA酶）20μl/管。
（13）65℃15min，后4℃冰箱保存。
碱裂解法提取质粒DNA的研究
碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。
以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。
首先，进行实验前的准备工作。
实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。
准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。
将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。
碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。
通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。
在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。
为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。
此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。
接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。
首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。
在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。
利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。
最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。
最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。
为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。
这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。
如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。
此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。
通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。
总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取方案一常规小量提取(碱裂解法)【实验目的】(1)掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理及操作过程。
(2)掌握微量加样器的使用方法。
【实验原理】在NaOH存在的碱性环境(pH值12.0～12.6)中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA由于分子量小且缠绕紧密，仍为自然状态。
将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复可溶状态的。
通过离心，去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质等物质，上清液中的质粒DNA可用酚/氯仿抽提。
【实验试剂】(1)溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH值8.0)10mmol/LEDTA(pH值8.0)溶液I可成比配制，每瓶约100ml,在6.9×10°Pa(10lbf/in²)高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃下。
(2)溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS(3)溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml(4)酚(pH值7.8～8.0)。
(5)氯仿。
(6)TE缓冲液。
(7)6×DNA上样缓冲液。
(8)0.8%琼脂糖。
(9)无水乙醇。
【实验器材】(1)低温高速离心机。
(2)旋涡振荡器。
(3)Eppendorf管(EP管)。
(4)微量移液器。
(5)移液器头。
(6)电泳仪与电泳槽。
(7)紫外透射仪。
【实验样本】细菌(含某种质粒)。
【实验步骤】(1)将5ml菌液分次装入同一1.5mlEP管中，3000r/min离心5min,以收集菌体。
(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡5min。
(3)加200μl新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不可强烈振荡，放置于冰上3min左右。
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒DNA的提取碱裂解法
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
碱裂解法提取质粒DNA
葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS
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破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
加入溶液Ⅱ之后必须温柔混合，不然基因组DNA会物理断裂；
停留的时间不能过长，因为强碱性条件下基因组DNA会慢慢化学断裂
溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；
SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀
自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDDNA时，多数情况下能看到三条带，按电泳速度由快到慢排序，
分别是 超螺旋带、开环带 和 复制中间体带（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA溶液 I ： 50 mM Glu / 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA （pH 8.0）；重悬菌体，供应缓冲环境。
（pH 很重要）。
葡萄糖：最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加粘稠度，削减 摇摆时对DNA 的机械剪切力。
如缺了葡萄糖对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以 说溶液I 中葡萄糖是可缺的。
EDTA ：它是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制 DNase 的活性和抑制微生物生长。
在溶液1中加入高达10 mM 的EDTA,就是要把E.coli 细胞中 的全部二价金属离子都螯合掉。
若不加EDTA,只要是在短时间里完成质粒抽提，也不怕DNA 会快速被降解，由于最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA 。
假如哪天你手上正好缺了溶液I,只要用等体积的水，或LB 培育基来悬浮菌体就可以了。
留 意菌体肯定要悬浮匀称，不能有结块。
NaOH ：用新奇的NaOH,是为了保证NaOH 没有汲取空气中的CO2而减弱了碱性。
裂解细 胞的主要是碱，而不是SDS,所以才叫碱法抽提。
NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠 杆菌还是哺乳动物细胞，遇到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双 层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。
用了不新奇的NaOH,即便有SDS 也无法有 效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
只用SDS 也能抽提得到少量质粒，由于SDS 也是弱碱。
加SDS 是为下一步操作做铺垫。
留意：一，时间不能过长,在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会渐渐断裂；二，必需温 顺混合,不然基因组DNA 也会断裂。
溶液III ： 3M KAc∕2M HAc o 加入后就会有大量的沉淀消失，与SDS 的加入有关系。
假如在溶液II 中不加SDS 时也会有很少量的沉淀，明显是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
碱裂解法抽提质粒DNA
实验一碱裂解法抽提质粒DNA[实验原理]质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。
宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。
质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。
质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。
制备质粒载体是分子生物学的常规技术。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
[实验目的]1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。
2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。
[实验步骤]1、试剂配制（1）LB培养液10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
实验一碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。
质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。
一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。
在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。
通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。
在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。
通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。
三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。
2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。
3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。
5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。
6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。
7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。
8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。
9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。
10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。
四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。
通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。
2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。
质粒DNA提取方案
质粒DNA提取方案碱裂解法的原理是利用碱性溶液来打断细菌细胞壁和细胞膜，从而释放质粒DNA。
以下是一种常用的碱裂解法质粒DNA提取方案：材料和试剂：1.细菌培养物（含有质粒的细菌株）2.稀释缓冲液（例如TE缓冲液，pH8.0）3.碱性溶液（例如10%SDS和0.2NNaOH的混合液）4.中和缓冲液（例如3M醋酸和5MNaCl的混合液）5.离心管和离心机6.微量移液器和离心管管盖7.筛网或滤纸（用于分离细菌细胞碎片）步骤：1.将适量的细菌培养物加入离心管中。
2.离心管离心，收集细菌细胞沉淀。
3.弃去上清液。
4.加入适量的稀释缓冲液，悬浮细菌细胞。
5.离心管离心，收集细菌细胞沉淀。
6.弃去上清液。
7.加入适量的碱性溶液，充分混匀。
8.将离心管放入70°C水浴中，孵育5分钟。
9.在离心机中以最大转速离心10分钟，以沉淀细菌细胞碎片。
10.弃去上清液。
11.加入适量的中和缓冲液，充分混匀。
12.在离心机中以最大转速离心10分钟，收集质粒DNA沉淀。
13.弃去上清液。
14.用适量的冷稀释缓冲液溶解质粒DNA沉淀。
15.使用微量移液器将溶解的质粒DNA转移到干净的离心管中。
16.使用筛网或滤纸分离细菌细胞碎片。
17.将离心管盖盖好，储存质粒DNA在-20°C冰箱中。
注意事项：1. 操作过程中尽量保持洁净和细菌污染的最小可能性，并勿让细菌接触到DNase。
2.在所有步骤中尽量避免剧烈振荡和搅拌，以防止DNA的破坏。
3.稀释缓冲液、碱性溶液和中和缓冲液的配方可以根据实验需求进行调整。
以上是一种常用的碱裂解法质粒DNA提取方案，该方法简单可行，适用于实验室中常见的质粒DNA提取需求。
在实际操作过程中，可以根据实验要求和具体样本进行一定的调整和优化。
质粒dna的提取方法
质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。
下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。
实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。
在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。
接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。
实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。
将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。
缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。
3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。
4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。
5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。
6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。
7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。
8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。
9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。
10. 再次离心，弃去上清液。
11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。
12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。
实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。
2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
碱裂解法提取质粒DNA
溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。
二、操作步骤1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×30S，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0））中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。
4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
质粒的小量提取(碱裂解法)
质粒的小量提取(碱裂解法)材料与设备E.coli 菌株；冷冻离心机，高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台试剂：试剂与配制1)质粒DNA碱裂解法试剂：溶液I：葡萄糖50 mmol/LEDTANa2 10 mmol/LTris-HCl （pH8.0）25 mmol/L溶液II：（临用时新配制）（是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
）NaOH 0.4 mol/LSDS（w/v）2%0.4mol/L NaOH 和2% SDS（w/v）对半混匀即可。
溶液III： 5 mol/L 醋酸钾60 mL冰醋酸11.5 mLDDW 28.5 mL溶液I、III都须高压灭菌。
2) 氯仿:异戊醇=24:13) 无水乙醇；70%乙醇；异丙醇4) TE（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA操作步骤：（1）取菌液1.5mL, 4000 rpm离心5min,弃上清。
（2）加入预冷的100μl 溶液I。
震荡混匀。
室温放置5min。
（3）加入200μl溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次（不要剧烈震荡）, 冰浴放置5min。
（4）加入预冷的150μl 溶液III。
温和震荡混匀，冰浴5min。
（5）12000rpm离心5min。
（6）取400ul上清至另一干净的EP离心管中，加入400μl 氯仿:异戊醇，混匀。
12000rpm 离心5min。
（7）轻轻取350ul上清至另一干净的EP离心管中，加入700μl无水乙醇充分混匀后，室温静置沉淀5~10min。
（8）12000rpm离心5min，弃上清。
（9）用500μl 70%的乙醇漂洗沉淀1次，5000rpm离心5min。
（10）沉淀物自然干燥后加入30μl 含RNAase的TE(pH8.0)，以溶解质粒DNA。
（11）电泳检测实验结果。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA二、实验原理先以低速离心从培养液中收集菌体，带有质粒的细菌经EDTA破坏外膜后，由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性崩解而使胞内DNA全部释放出来。
利用染色体DNA与质粒DNA在强碱条件下变性与复性的差异分离质粒DNA。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液将pH值调节至中性时，变性的质粒DNA 会恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
用等体积饱和酚或氯仿使沉淀变性的蛋白质和染色体分离，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA。
②氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
③溶液I(pH8.0)：终浓度需称/量取葡萄糖 50mmol/L； C6H12O6.H2O 1.982 gEDTA 10mmol/L； 0.5mol/L 4 mLTris-HCl（PH8.0） 25mmol/L； 1mol/L 5 mL 加DDW定容至200ml，高压灭菌后于4℃保存备用。
④溶液II(pH12.5)：NaOH 0.4mol/L；称取1.6g，加DDW定容至100mlSDS 2%（W/V）；称取2.0g，加DDW定容至100ml室温存放，临用时将二者对半混匀即可。
⑤溶液Ⅲ(pH4.8)：100ml5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5mlDDW 28.5ml高压灭菌后于4℃保存备用。
⑥TE(pH8.0)：Tris-HCl（PH8.0） 10mmol/LEDTA（PH8.0） 1mmol/L⑦TE+R:1mlTE+5ulRNase⑧溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl (pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃⑨ 3mol/ L NaAc (pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
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质粒提取原理
采用碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异不同而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开，DNA变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，留在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
Solution I：葡萄糖可增加溶液的年度，维持渗透压，防止染色体DNA受机械剪切作用而被降解，污染质粒DNA；溶菌酶（可省略）水解菌体细胞壁的化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，具有溶菌的作用。
当pH<8.0时，溶菌酶受到抑制；EDTA有两个作用：(1)螯合Mg2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解。
(2) EDTA的存在有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度环境；Tris-HCl作为缓冲溶液维持适当的浓度和pH值。
Solution II：NaOH，DNA在5.0<pH<9.0时时稳定的，但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而使DNA变性。
加Solution II后系统的pH高达12.6，线性染色体DNA和环型质粒DNA氢键均发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键只发生部分断裂，且其两条链不会发生完全分离，待pH调至中性闭合环型质粒DNA很快复性恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性。
SDS 是阴离子表面活性剂，它有溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中核蛋白，能与蛋白质结合成为R-O-SO3-···R+-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但SDS能抑制RNase的作用，所以在以后提取中必须将其除干净。
Solution III：KAc-HAc缓冲体系pH约为4.8，一方面要将整个溶液体系调至中性，使变性质粒DNA能够复性并稳定存在；另一方面加入高浓度盐会导致SDS—蛋白质复合物，变性大分子染色体DNA、RNA 等凝聚沉淀，因为SDS (十二烷基硫酸钠)遇K+后变成PDS (十二烷基硫酸钾)，PDS是不溶于水的。
SDS喜欢和蛋白质结合成为SDS—蛋白复合物，而遇K+后形成PDS—蛋白复合物便凝聚沉淀下来，同时长长的染色体DNA部分和部分RNA也被PDS共沉淀下来。
酚-氯仿：都是非极性分子，而水是极性分子，当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时，蛋白质分子间的水分子被酚-氯仿挤出去，使蛋白失去水合状态而变性。
变性蛋白质的密度比水的密度大，经过离心，与水相分离，沉淀在水相下面，而酚-氯仿比重更大，保留在最下层。
作为表面变性剂的酚-氯仿，在除去蛋白质的作用中，也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失；酚很容易氧化，变成粉红色，氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris-HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。
饱和酚中加上8-羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂，可抑制DNase。
由于有颜色，溶解在酚中后，使酚带上颜色，便于酚相与水相的分离，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。
(2)氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水相溶，不会带走DNA，所以在抽提中混合使用。
异戊醇可以降低分子表面张力，减少抽提过程中泡沫的产生；同时，异戊醇有助于分相，使离心后的上层是水相，中层变性成蛋白相，下层为有机溶剂相。
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细菌的培养
●将5 ml含相应抗生素的液体培养基加入到容量
50 ml，且通气良好的Coning管中，然后接入
含质粒的细菌200 μl，于37℃振荡培养过夜；●取培养的菌液1.2 ml加入EP管中，4℃12000
rpm离心1 min；
●弃去上清液体培养基残液，使细菌沉淀尽可能
干燥，收集细菌。
碱裂解法提取质粒DNA
●在细菌沉淀中加入150 μl预冷的Solution I，剧
烈振荡重悬菌液至无颗粒沉淀，细菌完全悬浮；
●加入300 μl新鲜配制的Solution II，盖紧管盖，
温和快速的颠倒离心管数次，至溶液完全混匀；
●置于冰浴2 min使细胞完全裂解，染色体DNA
充分变性；
●加入225 μl预冷的Solution III，盖紧管盖，反
复颠倒EP管并轻轻振荡使溶液混匀，冰浴10 min，使质粒DNA复性；
●于4℃12000 rpm离心10 min，沉淀细胞碎片
和破碎的染色体DNA，将含质粒DNA的上清移入另一EP管；●加入与上清等体积的酚-氯仿，手指轻弹混匀，
4℃12000 rpm离心5 min，以沉淀变性蛋白；
●小心吸取上层水相至另一EP管，加入上清液2
倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，于-20℃静置20 min沉淀质粒DNA；
●于4℃12000 rpm离心10 min，弃去上清液；
●加入1 ml70%的预冷乙醇，充分洗涤质粒DNA
沉淀，以达到洗盐目的；
●于4℃12000 rpm离心10 min，弃去上清液；
●将EP管倒置于滤纸上使乙醇充分流尽，并于
室温静置15 min让乙醇完全挥发；
●加入20 μl无菌超纯水，充分溶解质粒DNA，
-20℃储存备用。
试剂配制
●Solution I
✓葡萄糖50 mmol/L
✓Tris-HCl (pH8.0) 25 mmol/L
✓EDTANa2 10mmol/L
●Solution II
✓NaOH 0.2 mmol/L
✓SDS 1%
✓可先制成NaOH 0.4 mmol/L、SDS 2%，临用时1:1混合现配●Solution III
✓KAc(5 mmol/L) 60 ml
✓冰乙酸11.5 ml
✓ddH2O 28.5 ml
✓溶液配置成100 ml，pH调至4.8，配好后S-III 溶液含3 mol/L钾盐、5mol/L乙酸。
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