肌营养不良症DMD基因检测
DMD基因检测
实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： DMD 基因检测 实验类型： 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果 二、操作步骤 四、讨论分一、 实验目的 及原理掌握Duchenne 型肌营养不良症基因DMD 检测的简便方法。
本实验采用多重PCR 法检测。
PCR 是一种体外由引物介导的特定DNA 序列的酶扩增方法，全过程由“变性”、“退火”、“延伸”三部曲若干次循环组成。
一般的PCR 反应通常只有一对反应引物，而多重PCR 则是用几对引物在同一个PCR 反应体系中进行扩增，这样可以同时扩增出多个不同专一靶区域的片段。
Duchenne 型肌营养不良症是由于DMD 基因变异引起的。
DMD 基因由79个外显子组成，通常选择DMD 基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。
为节省经费，本实验设计为扩增DMD 基因中4个外显子。
二、 操作步骤1、 正常对照DNA 样本、DMD 患者DNA 样本，分别进行PCR 扩增。
PCR 操作如下：每一个薄壁PCR 管中加入（反应总体积为25µL）DMDmix 22µLPrimer R+F 1.5µLDNA 模版 1.5µLDMD-e8、DMD-e19、DMD-e45、DMD-e48、DMD 对照组石蜡油 1滴放置在PCR 循环仪上，循环参数设置为：Step1 （1个循环） 94℃ 5分钟Step2 （30个循环） 94℃ 30s56℃ 30s72℃ 30sStep3 （1个循环） 72℃ 7分钟2、PCR扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
（1）配制2%的琼脂糖凝胶配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4g的琼脂糖粉放入后，沸水锅加热熔化，冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5µg/ml,混匀凝胶，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。
（2）向电泳槽中倒入1×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。
MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因突变
【 关键 词】 假肥 大性肌 营养不 良症 ；多重连接 依赖式探针扩增 ；多重 Ｐ Ｒ； 失／ Ｃ 缺 重复 突变
假肥大性肌营养不 良症是一种严重的神经肌 肉疾 病， 为 Ｄ 分 ＭＤ（ ｕｈｎ ｅｍ ｓｕａ ｄｓ ｏｈ ）和 Ｂ Ｄ ｄｃｅ ｎ ｕｃｌ ｙｔ ｐｙ ｒ ｒ Ｍ （ ｅｋｒｍ ｓｕａ ｄｓ ｏｈ ） 均 是 由 于 Ｄ ｂｃｅ ｕｃｌ ｙｔ ｐ ｙ ， ｒ ｒ ＭＤ 基 因 （ ｐ １２ 突变所 致 。它是人类 已知 的最长 的基 因， Ｘ ２． ）
ｃＮ Ｄ Ａ长 达 １ ｋ ， ７ ４ ｂ 含 ９个 外 显 子 ， 码 ３ ８ 编 ６ ５个 氨 基 酸 。
度计测定 Ｄ Ａ纯度和浓度 。将 Ｄ Ａ浓度控制在 ５ Ｎ Ｎ ０～
２ ０ ｒ／ｔ ０ ｇ ｘ ｉ Ｌ。
１２ ２ Ｍ Ｐ ． ． Ｌ Ａ检 测
所 有 反 应 在 标 准 的 盖 温 为 １５Ｉ ０ ｃ ＝
中 国 医科 大 学盛 京 医 院 儿科 就 诊 的 ５ 例 Ｄ ｌ ＭＤ患 者 和 ８例 Ｂ ＭＤ 患 者 。 采 用 Ｍ Ｐ 法 对 经 多重 Ｐ Ｒ 法检 测 过 的 ＬＡ Ｃ 患者 的 Ｄ ＭＤ基 因 的缺 失 ／ 复 突 变 进 行 突变 筛查 ， 时 对 先 证 者 的 母 亲 进 行 基 因的 缺 失 ／ 复 突 变检 测 。 结 果 重 同 重
的 Ｐ Ｒ仪上进行 。（ ） Ｎ Ｃ １ Ｄ Ａ变性 和 Ｓ Ｌ Ａ Ｍ Ｐ Ａ Ｓ Ｌ Ａ探针 杂 交 ， 应 体 系 如 下 ： 释 Ｄ Ａ 样 品 （ ０～ ０ ｇ 加 反 稀 Ｎ ５ ２０ ｎ ） Ｔ Ｅ至 ５ Ｌ ８ 。９ ℃加 热 ５ｍ ｎ 开 盖之 前冷 却 到 ２ ￣ ｉ， ５Ｃ。 分别 加 入 １５ ｔ ０ ４ Ｐ ３ ． ｘ Ｐ ３ ／ ０ ５探 针 混 合 物 和 １５ Ｌ Ｌ ． ＭＬ Ａ ｂｆ ｒ Ｐ ｕ ｅ。小 心 混 匀 ，５【孵 育 １ｍ ｎ ６ ℃ ３ １卷第 １ ６期
假肥大型进行性肌营养不良2个核心家系DMD基因分析
外显子的杂合缺失突变 ； 先证者 ２为 Ｄ ＭＤ基 因 ２ ０— ３ ４号外显 子缺 失 ， 其母亲为 ２ ０—３ ４号外显子 的杂合 缺失 突变。 结论 ＭＬ Ｐ Ａ进行 Ｄ ＭＤ基因检测是确诊 Ｄ ｕ ｃ ｈ ｅ ｎ ｎ ｅ ／ Ｂ ｅ ｃ ｋ ｅ ｒ 肌 营养不 良的快速方法 ， 同时可进行 携带者筛查 ， 为遗 传咨询 提供准确 信
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｓ ｕ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ Ｄ ｕ ｃ ｈ ｅ ｎ ｎ ｅ ｍ ｕ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｄ ｙ ｓ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｙ（ Ｄ Ｍ Ｄ） ／Ｂ ｅ ｅ ｋ ｅ ｒ ｍ ｕ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｄ ｙ ｓ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｙ （ Ｂ ＭＤ） ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｃ ａ ｒ ｒ ｉ ｅ ｒ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｆ ｅ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ｏ ｆ ２ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｆ ａ ｍ ｉ ｌ ｉ ｅ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ． Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ｗ ａ ｓ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｄ
杜氏肌营养不良症(DMD)与遗传
Dystrophin 抗肌萎缩蛋白
• 全长型dystrophin 是一种427 kDa的棒状蛋白, 长约150 nm, 分为4 个区域 ，
• 氨基端区域 • 中央棒状区 • 富含半胱氨酸区域 • 羧基端区域
Dystrophie musculaire de Becker
• le gène de la dystrophie • Beaucoup plus atténué 缓和
• Après l’âge de 16 ans • 之后多年也可行走
parvient à marcher
DMD与BMD的差异
• DMD——致死 • BMD——存活率非常高(70%),易产生 新的突变
用力逐渐减弱，最终被洗脱下来 • 检测柱洗脱液在260 nm处的吸光度，样品中各成分在色谱图中显示为不同的吸收峰
• 优点: 灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析
Merci de votre attention !
参考文献
• DMD／BMD基因诊断研究进展，徐晓雪 张朝东 李嘉姝
• DMD 患者骨骼肌抗肌萎缩蛋白表达与临床病理改变，陈琳 郭玉璞 邹丽萍 赵燕环 任海涛
； • （4）由于男性患者的子女都正常，故可见隔代遗传； • （5）女性患者的父亲一定是患者,母亲一定是携带者。
DMD —男女差异
• 男性致死
Duchenne, un neu•rol1og/ist3e frnanéçaois,ma dounntéautneiodensc,ri2pt/io3n commplèèterdee 1p3 moalratdieesuatstaeints
怎么看懂dmd基因检测报告
怎么看懂dmd基因检测报告
DMD基因检测报告是一份关于Duchenne肌营养不良症（DMD）的基因
检测结果的文件。
要读懂DMD基因检测报告，可以按照以下步骤进行：
1. 了解报告的结构：一份完整的DMD基因检测报告通常包括以下几个部分：样本信息、检测方法、基因变异解读等。
2. 查看样本信息：这部分内容通常包括被检测者的姓名、年龄、性别、样本来源等信息。
这些信息有助于确保报告与正确的个体匹配。
3. 关注检测方法：这部分描述了基因检测所采用的技术和流程。
了解检测方法有助于理解结果的可靠性和准确性。
4. 查看基因变异解读：这是报告的核心部分，其中列出了被检测基因的所有变异，并对每个变异进行了解读。
每个变异都会被注明其在基因中的位置、可能的影响以及是否为已知的疾病相关变异等信息。
5. 关注结论与建议：报告的结论部分通常会总结被检测者的基因变异情况，并给出是否携带DMD相关变异的判断。
同时，还会提供与被检测者情况相关的医学建议或下一步的诊疗建议。
6. 注意异常指标：如果报告中出现了异常的指标，如特定的基因变异或生化指标，这可能意味着被检测者存在患DMD的风险。
这种情况下，应寻求医生的进一步咨询和评估。
7. 保存并备份报告：为了方便查阅和保存相关数据，建议将基因检测报告保存在安全可靠的地方，如电子设备或云存储。
总的来说，阅读DMD基因检测报告需要具备一定的生物医学知识背景，以便准确理解和解释检测结果。
如果你对报告的内容有任何疑问或不确定的地方，建议咨询专业的医学遗传学专家或医生进行解读和评估。
怎么看懂dmd基因检测报告
怎么看懂dmd基因检测报告全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：怎么看懂dmd基因检测报告近年来，随着医学科技的不断进步，基因检测逐渐成为一种重要的健康管理工具。
在基因检测中，dmd基因的检测尤为重要，因为这个基因与杜克内尔肌肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）有密切关联。
而要正确理解和解读dmd基因检测报告，则需要一定的专业知识和技巧。
本文将为大家介绍如何看懂dmd基因检测报告，帮助大家更好地了解自身的基因状况。
要了解dmd基因检测报告，首先需要了解一些基本的知识。
dmd 基因位于X染色体上，是编码一种叫做dystrophin的蛋白质的基因。
这种蛋白质在肌肉细胞中起着非常重要的作用，能够维持肌肉细胞的结构和功能。
如果dmd基因发生突变或缺失，就会导致肌肉细胞受损，最终导致DMD疾病的发生。
在进行dmd基因检测时，实验室通常会对样本中的dmd基因进行测序分析，从而检测出有无突变或缺失。
检测报告通常会包括以下几个方面的信息：1. 基因突变类型：检测报告会详细列出检测到的突变类型，比如缺失、插入、错义突变等。
不同类型的突变会对疾病的发病风险和临床表现产生不同的影响。
2. 突变位置：报告还会指明突变发生的具体位置，有时还会提供基因组坐标或AA序列号。
这有助于进一步研究突变的影响和机制。
3. 突变的临床意义：报告通常会对检测到的突变进行解读，说明该突变对DMD的风险或临床表现有何影响。
一些高风险的突变可能会导致患者早期发病或病情严重。
4. 检测结果：报告会总结出是否检测到了dmd基因的突变，以及检测结果所带来的风险或建议。
要正确理解和解读dmd基因检测报告，需要具备一定的专业知识和技能。
以下是一些建议：1. 寻求专业指导：如果您对dmd基因检测报告不理解，可以咨询专业遗传顾问或医生帮助解读。
他们有经验和专业知识，可以为您解释报告中的复杂内容。
2. 关注突变类型和位置：要仔细研究报告中关于突变类型和位置的信息，了解突变的具体影响和可能风险。
dmd诊断标准
dmd诊断标准Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一种罕见的肌肉疾病，它会影响男性的肌肉功能，导致肌肉萎缩和无力。
以下是DMD的诊断标准，包括临床特征、家族史、基因检测、肌肉活检和其他辅助检查等方面。
1. 临床特征DMD患者在儿童期或青少年期出现进行性肌肉无力，通常首先出现在腿部和背部肌肉，然后逐渐影响到其他肌肉群。
随着病情的发展，患者可能会出现呼吸肌无力、脊柱侧弯、关节挛缩等症状。
在检查患者时，医生会特别注意观察患者的步态、姿势和肌肉状态。
2. 家族史DMD是一种遗传性疾病，通常在家族中有遗传史。
医生会询问患者的家族史，了解患者的亲属是否患有DMD或其他神经肌肉疾病。
如果患者的家族中有DMD患者，那么患者患有DMD的风险会更高。
3. 基因检测基因检测是诊断DMD的金标准。
医生可以通过提取患者的血液或其他组织样本进行基因检测，寻找与DMD相关的基因突变。
如果检测到特异的基因突变，例如缺失或重复的X染色体，可以确诊DMD。
4. 肌肉活检肌肉活检是一种通过手术获取患者肌肉样本的检查方法。
通过观察肌肉样本的显微结构，可以发现DMD患者肌肉中的异常变化，例如肌肉纤维萎缩、坏死和修复等。
肌肉活检对于DMD的诊断和与其他神经肌肉疾病的鉴别诊断具有重要意义。
5. 其他辅助检查其他辅助检查包括心电图、肌肉功能测试、神经传导速度等。
这些检查可以帮助医生评估患者的肌肉功能和神经传导功能，从而协助诊断DMD。
总结：DMD的诊断需要结合临床特征、家族史、基因检测、肌肉活检和其他辅助检查结果。
医生需要根据患者的具体情况进行综合评估，以确定最终的诊断结果。
如果您有任何疑问或需要更多信息，请咨询专业医生。
怎么看懂dmd基因检测报告
怎么看懂dmd基因检测报告全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：随着生物技术的不断发展，基因检测已经成为一种常见的方式来了解个体的遗传特征和疾病风险。
DMD（Duchenne muscular dystrophy）基因检测是一种用于检测患有杜兴氏肌萎缩症（Duchenne muscular dystrophy）遗传性疾病的检测方法。
了解如何看懂DMD 基因检测报告对于患者和家属来说是非常重要的，可以帮助他们更好地了解患病风险和未来的治疗方向。
要理解DMD基因检测报告，我们需要了解一些基本的遗传知识。
杜兴氏肌萎缩症是一种由于DMD基因突变导致的遗传性疾病，通常会导致肌肉无力和进行性肌肉萎缩。
DMD基因位于X染色体上，因此主要影响男性。
检测报告中通常会包含基因突变的具体信息，包括发生的位置、类型和对应的致病性。
当阅读DMD基因检测报告时，需要注意以下几个方面：1. 检测结果：报告中会显示具体的检测结果，包括是否患有DMD基因突变。
一般来说，如果检测结果为阳性，即表示携带有致病性突变，存在患病的风险。
如果检测结果为阴性，则表示未发现有相关的致病性突变，较少患病的可能性。
2. 遗传风险：DMD基因遗传疾病通常呈X连锁显性遗传。
男性携带有致病性DMD基因突变的患病风险较高，女性携带1个突变的患病风险较低，但有可能成为携带者并传递给下一代。
3. 患病风险评估：报告中可能会包含有关患病风险的具体评估，包括患病的可能性、发病年龄、疾病的临床表现等信息。
这些评估可以帮助患者和家属更好地了解疾病风险和预防措施。
4. 与医生沟通：在阅读DMD基因检测报告时，如果有任何疑问或不明白的地方，建议及时与医生进行沟通。
医生可以根据具体的检测结果为患者提供个性化的建议和治疗方案。
了解如何看懂DMD基因检测报告对患者和家属来说是非常重要的。
通过对报告中的信息进行逐步分析和理解，可以帮助患者更好地了解自己的遗传特征和患病风险，从而制定有效的预防和治疗方案。
DMD的基因诊断-进修生-给学生
将采集的血液样本进行离心分离， 提取出白细胞中的DNA，并进行纯 化处理，以提高检测的准确性。
基因检测与数据分析
基因扩增
使用聚合酶链式反应（PCR）技术对DMD基因进 行扩增，以便更准确地检测基因突变。
序列分析
对DMD基因的编码区进行序列分析，检测是否存 在基因突变，如缺失、插入、倒位等。
隐私保护问题
基因信息属于个人隐私，如何在诊断 过程中保护患者隐私是一个重要问题 。
临床应用与普及推广
临床应用范围有限
目前DMD基因诊断主要应用于特定人群或特定医疗机构，临床应 用范围有限。
普及推广难度大
由于技术、成本和认知等多方面原因，DMD基因诊断的普及推广 难度较大。
政策支持不足
目前政府对DMD基因诊断的投入和政策支持相对较少，不利于其 普及推广。
dmd的基因诊断
• DMD基因诊断概述 • DMD基因诊断技术 • DMD基因诊断流程 • DMD基因诊断的应用 • DMD基因诊断的挑战与展望 • DMD基因诊断案例分享
01
DMD基因诊断概述
DMD基因简介
DMD基因
01
DMD基因位于X染色体上，是导致杜氏肌营养不良（DMD）的
主要原因。
基因结构
治疗方案
了解患者的DMD基因突变类型有助于制定针对性的治疗方案和 临床试验。
DMD基因诊断的历史与发展
01
02
03
早期检测
早期DMD基因诊断主要 依赖于肌肉活检和生化检 测，具有创伤性和局限性。
分子诊断
随着分子生物学技术的发 展，DMD基因诊断逐渐 转向分子诊断，检测更加 准确和诊断提供了更高通量 和更低成本的选择，有助 于更多患者获得精准诊断。
DMD疾病的诊断策略
01
DMD/BMD疾病概述
1. 杜氏肌营养不良症（DMD,OMIM:310200)也称 假肥大性肌营养不良，为X-连锁隐性遗传。
2. 是由于DMD基因缺陷导致肌细胞膜上的抗肌萎 缩蛋白功能异常，肌细胞受损伤，出现进行性 坏死、萎缩等，临床出现肌无力的症状与体征。
3. 一般男性发病，占出生男婴的20-30/10万例发 病。我国的发病率约为1/3853，估算全国患者 约70000人。
确诊需基因检测发现 DMD 基因致病性缺陷或肌肉活检发现 Dystrophin 蛋白异常。 基因检测对 DMD/BMD 诊断具有重要价值。基因检测有多种不同方法，疑诊 DMD/BMD，一般先用多重
连接探针扩增技术（MLPA）检测 DMD基因大片段缺失和重复，如果未发现此类拷贝数异常，再用高通 量测序技术（NGS）检测微小突变。 随着 NGS 技术和生物信息学分析的发展，目前可用高通量测序一步法同时检测拷贝数变化和微小突变。
DMD基因变异类型
缺失重复突变为主，其次为无义突变
DMD/BMD的诊治策略
NGS检测助力DMD/BMD的临床诊断与鉴别
02
DMD/BMD的诊断
幼儿期运动发育轻度迟滞，儿童期（5～6 岁）运动能力开始下降，并出现步态异常、跟腱挛缩、腰椎前 凸等变化，查体可见明显双腓肠肌假肥大现象。结合血肌酶谱明显升高、肌电图呈肌源性损害，可临床 疑诊DMD。
https:///disease/duchenne-muscular-dystrophy/causes-inheritance
女性X染色体失活机制
X染色体失活，属于表观遗传学研究内容。在胚胎发育过程中，哺乳动物雌性细胞的两条X染 色体中有一条会通过X染色体失活机制随机失活。失活染色体又称巴氏小体，呈异染色质状 态，其CpG岛高度甲基化，组蛋白H4不被乙酰化；而在另一个细胞中同一条染色体又可以是 活化的呈常染色质状态。
孩子出现进行性肌营养不良症症状家长应该怎么办
01
03
05
07
02
04
06
添加标题
肌肉萎缩：孩子的肌 肉可能会出现萎缩，
导致身体瘦弱。
添加标题
呼吸困难：孩子可能 会出现呼吸困难，影
响正常呼吸。
添加标题
消化问题：孩子可能 会出现消化问题，影
响正常饮食。
遵循医生的诊断和治疗方案
添加标题 添加标题 添加标题 添加标题 添加标题 添加标题
带孩子去医院进行详细检查，了解病情 遵循医生的诊断结果，不要盲目猜测或自行诊断 配合医生的治疗方案，按照医生的建议进行治疗 定期带孩子复查，及时调整治疗方案 保持与孩子的沟通，了解孩子的感受和需求 寻求专业医生的帮助，不要盲目相信偏方或非正规治疗方法
家庭护理和日常照顾
第三章
心理支持
保持积极态度：鼓励孩子 保持乐观，积极面对疾病
0 4
关注孩子的心理状态
第四章
关注孩子的情绪变化
观察孩子的情绪波动，如焦虑、抑郁、烦躁等 倾听孩子的心声，了解他们的内心世界 鼓励孩子表达自己的感受，给予他们支持和理解 帮助孩子建立积极的心态，增强他们的自信心和自尊心
提供心理支持和安慰
保持积极的态度， 鼓励孩子面对困 难
倾听孩子的感受， 理解他们的困扰 和恐惧
诊断方法
基因检测：检测DMD基因突 变
肌电图：检测肌肉电活动异 常
肌肉活检：检测肌肉组织病 变
临床表现：肌肉无力、肌肉 萎缩、行走困难等
其他辅助检查：如血清酶学、 心电图等
治疗和康复方法
药物治疗：使用 激素、维生素等
药物进行治疗
物理治疗：进行 适当的运动和按 摩，帮助肌肉恢
进行性肌营养不良
临床表现
01
女性为基因携带者，所生男孩约50％发病，女孩患病者罕见；
02
有些携带者可有肢体无力、腓肠肌肥大、血清CK增高等临床表现。患儿多呈明确家族性，另有1／3患儿由新的基因突变所致病。
01
临床表现是：
02
患儿均为男性，多在3～5岁发病；
03
起病隐袭，开始症状多为行走慢，不能正常跑步，容易跌倒；
逐步出现轻度面肌力弱，咬肌无力和萎缩，吞咽困难，构音不清；CK正常或轻度升高。
3
2
1
4
5
远端型肌营养不良症（Gower型）
Gower（1902）首先报告，通常10～60岁之间起病，自肢端开始，主要影响手部和小腿肌肉，但较少见。
2
Kiloh－Nevin型
3
慢性进行性核性眼肌麻痹
1
眼肌型肌营养不良症
03
02
01
人胚肌细胞注入治疗仅见短期效果；
基因治疗正在研究中。
应用“序贯式干细胞移植术”治疗进行性肌营养不良症，日前在解放军463医院投入临床，疗效明显。开辟了从基因层面根治这种疾病的新路。
PMD主要预防措施：
01
检出携带者和产前检查
02
检出携带者可采取家谱分析：
03
DMD女性亲属可能是携带者，可分为：
EMG为肌原性损害，肌肉活检表现疾病特征，但组织学改变较轻；
血清CK、LDH等可正常或轻度增高，EEG正常。
01
02
肢带型肌营养不良症
病变主要累及肢体近端。
Erb型：包含一组肌营养不良症的变异型，属常染色体显性或隐性遗传，散发病例也不少见。
通过遗传模式、基因突变位点、受累蛋白的自然结构等，可将此型与其他类型肌营养不良症相区别。
肌营养不良DMD与脊髓型肌萎缩SMA基因检测
DMD-基因功能
Prochniewicz et al.(2009)指出，utrophin和dystrophin结合 actin的亲和力相似，但分子接触不同。肌营养不良蛋白利用2个低 亲和力的肌动蛋白结合位点，而肌营养不良蛋白利用一个连续的肌 动蛋白结合域。
利用瞬时磷光各向异性，他们发现这两种蛋白质都限制了肌动蛋白的 振幅，并增加了肌动蛋白弯曲和扭曲的速率。然而，在降低肌动蛋白 扭转刚度方面，肌营养蛋白的作用比肌营养不良蛋白大得多，尤其是 在肌动蛋白饱和度高的情况下。
杜氏肌营养不良与脊髓型肌萎缩 DMD/SMA致病机制与基因检测
• DMD • SMA
杜氏肌营养不良 脊髓性肌萎缩
杜氏肌营养不良（DMD）
➢ Duchenne/Becker 型肌营养不良的病因是维持肌肉细胞在伸缩过程中保持肌膜完整性的 重要结构蛋白Dystrophin 的编码基因（DMD 基因）发生致病缺陷，从而导致功能异常， 最终造成肌肉进行性破坏。
内容
对常见缺失的18个位点 通过PCR+电泳的方法进 行检测
对79个外显子和启动子 区域进行缺失重复检测
对79个外显子和启动子 区域进行测序检测
对79个外显子和启动子 区域进行高通量测序检 测
优点
成本低，费用约 500元左右
费用约1000元左 右，可以检测缺 失和重复型突变
可检测点突变
可检测几乎所有 类型的突变
与肌营养不良蛋白一样，Utrophin对肌动蛋白聚集或捆绑没有影 响。Prochniewicz等人(2009)假设，除了稳定肌动蛋白丝免于解 聚外，肌营养不良蛋白和营养不良蛋白对肌动蛋白丝因拉伸或扭曲 而断裂提供更大的抵抗力.
DMD-基因功能
Genotype definition of the dystrophin gene in patients with dystrophinopathies has taught us much about functionally important domains of the protein itself and has provided insights into several regulatory mechanisms governing the gene expression profile.
杜氏肌营养不良DMD的基因检测与治疗方方案详解
DMD患者体征
➢走路时肩膀和手臂不正常后压 ➢背部下凹 ➢臀部肌肉无力 ➢膝盖可能会习惯弯曲 ➢小腿肚肌肉肥大（多数为肌肉肥大，不强壮） ➢足弓部位痉挛，小孩可能用脚尖走路 ➢腿前肌肉无力导致足部下垂和脚尖挛缩 ➢走路样子笨拙 ➢平衡性差，常常跌倒 ➢大腿单薄，尤其是前面 ➢由于腹部肌肉的薄弱导致腹部突出，小孩通常站立困难
Genotype definition of the dystrophin gene in patients with dystrophinopathies has taught us much about functionally important domains of the protein itself and has provided insights into several regulatory mechanisms governing the gene expression profile.
Novel mutation in exon 56 of the dystrophin gene in a child with Duchenne muscular dystrophy .
DMD基因突变概况
一个 DM
或多
D 基因
个外 突变 显子
缺失的缺重复 68%失和11%
无义 突变
重复 10%
小的片 突段变的 插入 和缺
➢ 基因治疗和其它小分子药物依旧处于 研发阶段……
➢ 发现了DMD疾病产生 的小部分原因。
1986年
➢ PTC公司的终止子跳 跃药物Ataluren ，得 到了欧盟医药局EMA 的批准，并且在欧盟 的多个国家上市。
2017年--
1861年
进行性肌营养不良症
进行性肌营养不良症DMD为X连锁隐性遗传病，致病基因已定位于X染色体短臂2区1带2～3亚带(Xp21.2～21.3)，其基因的cDNA 已经被克隆，全长为14kb，有60～65个外显子，基因表达产物为抗肌萎缩蛋白(dystrophin，Dys)，当基因出现大片段缺失，重复或其他形式变异如点突变时，导致Dys缺如或结构功能异常是DMD致病的根本原因，BMD基因与DMD处于同一区域，互为等位基因，Dys位于肌纤维膜的内层，是一种细胞骨架蛋白，有稳定肌纤维膜的作用，在DMD患者中，由于肌纤维缺乏Dys，肌膜结构的完整性受到破坏，大量富含钙离子的细胞外成分流入肌细胞内，最终导致肌纤维变性，坏死而发病，Emery-Dreifuss肌营养不良的致病基因定位于xq28，其编码蛋白为emerin，近年来发现肢带型肌营养不良(LGMD)的发生与附着于肌纤维膜上的抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(DGC)的遗传缺陷有关，DGC在维持肌纤维膜的稳定和防止膜损伤坏死起着十分重要的作用，面肩肱型肌营养不良(FSHD)为成年人最常见的常染体显性遗传肌病，其基因定位存4q35，基因尚未克隆，编码蛋白尚未分离，但已证明FSHD与4号染色体长臂末端3.3kb串联重复序列拷贝数的缺失有关，其他如远端型肌营养不良不同亚型的分子机制也有新的认识。
二)发病机制与肌营养不良发病有关的膜结构蛋白是由多种蛋白质组成的一个大复合物，称抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(DGC)，包括抗肌萎缩蛋白(dystrophin)，肌营养不良聚糖复合物(由α，β-dystroglycan组成)，肌聚糖复合物(α，β，γ，δ-sarcoglycan)和营养合成蛋白复合物(syntrophin complex)，dystrophin的一端与肌动蛋白相联结，另一端与β-dystroglycan相联结，再通过α-dystroglycan与基底膜上的细胞外基质蛋白α2-Laminin相联结，在结构上起到了连接肌肉细胞内肌动蛋白和细胞外基质的桥梁作用，DGC的各组成分紧密结合，相互关联可维护肌膜的稳定性和完整性，当相应的基因位点发生突变，使DGC某一组份发生缺陷时，如dystrophin或任一型sarcoglycan的缺乏，都会影响整个膜结构的稳定，引起肌膜损伤，进而发生一连串反应并导致肌纤维坏死。
DMD的基因诊断
DMD疾病介绍
• Duchenne muscular dystrophy （DMD） 假肥大型（进行性）肌营养不良 杜氏肌营养不良
• 儿童最常见的致死性肌肉疾病 • 遗传方式：X连锁隐性遗传
• 发病率：1/3500 活产男婴
DMD临床特征
• 3～5岁隐袭起病，病情进行性加重，9 ～12岁 不能行走，多于20岁左右死亡。
A组：4、8、17、19、44、45、48、51、60 号外显子 B组：Pm 、3、6、12、13、43、47、50、52号外显子
• 突变检出率：60%左右。
mPCR 反应体系
试剂（Reagents） 10Buffer MgCl2 dNTPs(10 mM) Gold Taq（5 U/l） Primers (100ng/l） DNA模板 (30 ng/l) ddH2O
• 大多数伴心肌损害，少数可出现充血性心力衰竭。 • 30%患儿有不同程度的智力障碍。 • 腱反射减弱，直至消失 • 肌酶：CK等活性明显升高 • 肌电图：肌源性损伤 • 免疫组化：蛋白消失或减少。 • 晚期多因呼吸道感染，心力衰竭死亡。 • BMD：贝氏肌营养不良，临床特征同DMD，发病
年龄较晚，进展缓慢，病情较轻，存活期长。
• 乙腈 将核酸从TEAA上洗脱下来，其浓度越大洗脱 立力越强
DHPLC的检测类型
• 外显子缺失的检测 • 外显子点突变的检测 • 女性携带者的检测
外显子缺失的DHPLC检测
原理：
• 大小和序列不同的片断与分离柱的结合力不同 • 随着乙腈浓度的增高不同的片断将先后从分离
柱上洗脱下来 • 用紫外分光仪检测洗脱液浓度的连续变化，有
• 学步较晚，不愿意行走或跑、行走缓慢，活力 下降、易于跌倒、不能跳跃、上楼困难。
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• DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显 子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD 的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这 种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。
• 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形 式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD 基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺 失突变中的90%。
Step 1 (1个循环)
94C
5分钟
Step 2 (30个循环) 94C
30秒
56C
30秒
72C
30秒
Step 3 (1个循环)
72C
7分钟
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis ):
① 配制2%的琼脂糖凝胶
配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化,冷却至60℃，加入溴乙锭(EB)，倒 入电泳槽中，插入梳子，待凝固。
45
547
aaacatggaacatccttgtggggac
48
506
ttgaatacattggttaaatcccaacatg
引物R ggcctcattctcatgttctaattag gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc cattcctattagatctgtcgccctac cctgaataaagtcttccttaccacac
PCR操作如下：
每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）：
双蒸水
17.8 l
10XBuffer
2.5 l
MgCl2 dNTPs
2 l 0.5 l
Primer R+F (混合)
1.4 l
DNA 模板
0.5 l
Taq-DNA聚合酶
0.3 l
石蜡油
1滴
放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：
② 向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。
③ 取PCR扩增样品15l加入3l的6×载样缓冲液，混匀后，加入 样品孔内。
④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由 负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左 右。
⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准 PUC19/MspⅠ(marker)比较。
3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓 度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩 增产物的特异性差，有非特异性条带。
4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25-30次 循环后，PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提 下，应尽量减少循环次数。
mutations are deletions, and about 6% are duplications , • Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.
Duchenne Muscular Dystrophy, DMD
• 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子， 其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分 别为26%和48%。
DMD基因4个外显子的引物顺序见表：
外显子 PCR产物大小
Байду номын сангаас引物F
8
360
gtcctttacacactttacctgttgag
19
459
ttctaccacatcccattttcttcca
实验四 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测
• 进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特点 是进行性加重的肌肉萎缩和无力。
• 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。
Genetics of DMD OMIM# 310200
• occurring in about 1 in 3500 males, • X-linked recessive, lethal in males, • 1/3 of patients are new mutants; • 2/3 have carrier mothers, • Gene location Xp21, • large gene (more than 2000 kb), 79 exons. • High mutation rate, 60% to 65% of the
10l PCR产物
2 l 6*loading buffer
混匀 加样 电泳(140V,2hr) 紫外灯下观察
注意事项：
1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～ 60%。
2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特 异性好；温度低，有时会有非特异性条带。
聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外 由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要 求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应 用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。 依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物 退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶 催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可 扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。