肌营养不良症DMD基因检测

Step 1 (1个循环)
94C
5分钟
Step 2 (30个循环) 94C
30秒
56C
30秒
72CLeabharlann Baidu
30秒
Step 3 (1个循环)
72C
7分钟
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis ):
① 配制2%的琼脂糖凝胶
配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化,冷却至60℃，加入溴乙锭(EB)，倒 入电泳槽中，插入梳子，待凝固。
10l PCR产物
2 l 6*loading buffer
混匀 加样 电泳(140V,2hr) 紫外灯下观察
注意事项：
1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～ 60%。
2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特 异性好；温度低，有时会有非特异性条带。
PCR操作如下：
每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）：
双蒸水
17.8 l
10XBuffer
2.5 l
MgCl2 dNTPs
2 l 0.5 l
Primer R+F (混合)
1.4 l
DNA 模板
0.5 l
Taq-DNA聚合酶
0.3 l
石蜡油
1滴
放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：
• 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子， 其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分 别为26%和48%。
DMD基因4个外显子的引物顺序见表：
外显子 PCR产物大小
引物F
8
360
gtcctttacacactttacctgttgag
19
459
ttctaccacatcccattttcttcca
3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓 度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩 增产物的特异性差，有非特异性条带。
4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25-30次 循环后，PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提 下，应尽量减少循环次数。
实验四 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测
• 进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特点 是进行性加重的肌肉萎缩和无力。
• 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。
Genetics of DMD OMIM# 310200
• occurring in about 1 in 3500 males, • X-linked recessive, lethal in males, • 1/3 of patients are new mutants; • 2/3 have carrier mothers, • Gene location Xp21, • large gene (more than 2000 kb), 79 exons. • High mutation rate, 60% to 65% of the
45
547
aaacatggaacatccttgtggggac
48
506
ttgaatacattggttaaatcccaacatg
引物R ggcctcattctcatgttctaattag gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc cattcctattagatctgtcgccctac cctgaataaagtcttccttaccacac
② 向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。
③ 取PCR扩增样品15l加入3l的6×载样缓冲液，混匀后，加入 样品孔内。
④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由 负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左 右。
⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准 PUC19/MspⅠ(marker)比较。
mutations are deletions, and about 6% are duplications , • Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.
Duchenne Muscular Dystrophy, DMD
聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外 由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要 求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应 用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。 依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物 退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶 催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可 扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。
• DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显 子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD 的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这 种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。
• 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形 式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD 基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺 失突变中的90%。