大肠杆菌的保存和培养
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40％甘油，—80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）:10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5g/L；NaCl：10g/L；pH7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10。
0g酵母粉 5。
0g氯化钠10。
0g水 1000mlpH 7。
4固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5%－2。
0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10。
0g，酵母粉5。
0g，NaCl 10.0g,加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7。
4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7。
4，用1mol/L HCl回调）.2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂)。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干,待锥形瓶的封口纸干燥后取出.液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10—15mL（直径90mm),在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上,放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈,最后中间划之字;接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上,用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字,涂布平板。
大肠杆菌的复壮
二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌 落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
2.3.2稀释涂布平板法
操作方法
•梯度稀释
•涂布分离
问题：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系 列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
实验一 大肠杆菌的复壮 (培养、分离与提纯)
实验目的
1.了解菌种的保藏与复壮。 2.掌握大肠杆菌固体平面培养基的配制。 3.进行大肠杆菌的培养、分离（复壮），
用固体平面培养基进行细菌的划线培养。
1. 基础知识 1.1.菌种的保藏与复壮 1.2.细菌培养基 1.3无菌技术
2. 微生物实验所需的操作技术
纯化分离 培养保存
放斜面 倒平板
培养接种用菌种
固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却 超净台和双手消毒 点燃酒精灯创造无菌环境
倒平板操作
倒平板操作
倒平板操作中的问题讨论
倒平板操作中的问题讨论
（1）培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒 平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温 度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了 （2）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 （3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿 度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好 地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
（4）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿 底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生， 因此最好不要用这个平板培养微生物
大肠杆菌如何培养
大肠杆菌如何培养
一、大肠杆菌如何培养1. 大肠杆菌如何培养2. 大肠杆菌的保存方法 3. 大肠杆菌菌种的复苏二、大肠杆菌对人体益处和危害三、什么是大肠杆菌
大肠杆菌如何培养
1、大肠杆菌如何培养1.1、称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。
1.2、加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。
1.3、调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。
若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
1.4、过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察。
但是供一般使用的培养基,这步可省略。
1.5、分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
2、大肠杆菌的保存方法
2.1、常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。
实验一大肠杆菌的培养和分离
操作时右手无名指和小指 夹住封口膜，另外三指持 三角瓶，左手拿培养皿并 打开上盖的一边，在酒精 灯火焰旁操作。
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（三）大肠杆菌的接种
将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液 体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。
注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手 无名指和小指夹住斜面的棉塞和 三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原.
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，
氯化钠10g/L。
（可用于大肠杆菌的扩大培养）
配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g，加50mL水溶解。
LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液 体培养基中再加入1g琼脂制得。（可用于大肠杆菌的划线分离） 固体培养基可根据需求制成平面或斜面。
培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用
后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
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大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
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• 实验器材
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（四）大肠杆菌的扩大培养
三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
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（五）大肠杆菌的划线分离
1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。
大肠杆菌实验总结
分离划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。
涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml（配固体培养基再加琼脂20克）2、流程计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板培养基配制(特)培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。
1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。
待灭菌。
①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。
②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。
③包扎：用_牛皮纸__或报纸④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _.2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。
再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀。
4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。
5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。
灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。
⑤倒平板、制斜面操作平台：超净台灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外线 _和_过滤风，灭菌30min.倒平板：待培养基冷却至__60_ ℃时，将每只培养皿倒入_10~12_ml未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
大肠杆菌培养步骤方法
大肠杆菌培养步骤方法大肠杆菌是一种重要的细菌，它在实验室中被广泛用于分子生物学研究和基因工程。
下面是大肠杆菌的培养步骤方法，共50条，并展开详细描述：1. 准备所需的培养基及试剂，包括琼脂、培养基粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾等。
2. 将琼脂及培养基粉加入适量蒸馏水中，搅拌均匀后加热至沸腾，然后灭菌。
3. 将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，使其凝固成固体琼脂。
4. 取出实验室保存的大肠杆菌菌种，用无菌吸管从存储容器中取出适量菌液。
5. 将菌液均匀地涂布在琼脂培养皿表面，待其吸收后轻轻晃动培养皿使其均匀分布。
6. 将涂布好的培养皿倒置放入孵化箱中，以37℃恒温孵育。
7. 每隔一段时间观察培养皿上的菌落形成情况，选择合适的菌落进行分离和培养。
8. 在培养过程中，注意观察是否有任何异常，如细菌变异、污染等情况。
9. 定期检查培养基的PH值和温度，保持在适宜的范围内。
10. 当需要保存大肠杆菌菌株时，可以将单一菌落悬浮在无菌离心管中，并添加10%甘油保藏在-80℃低温库中。
11. 每次操作前要做好无菌操作，以避免外源菌的污染。
12. 大肠杆菌培养时，应严格控制氧气供应，可以选择静态培养或者摇瓶培养。
13. 在摇瓶培养中，要保持培养液的充分通气，防止细菌缺氧而死亡。
14. 对于含氧厌恶的大肠杆菌菌株，可以选择在含葡萄糖并定期通氮气的缺氧箱中进行培养。
15. 大肠杆菌培养皿观察时，可使用显微镜进行观察，观察菌落形态、大小和颜色等特征。
16. 对于选择性培养基的应用，可以根据需要添加抗生素或者其他选择性物质来筛选感兴趣的菌株。
17. 在进行大肠杆菌培养时，要注意控制培养基的含盐量和碳源，以及其他微量元素的添加。
18. 可以通过PCR或者其他分子生物学方法快速鉴定大肠杆菌的种属和亚种属。
19. 在大肠杆菌的培养中，要注意排放生物危害废弃物，并采取相应的安全防护措施。
20. 大肠杆菌培养时，要做好相关记录，包括菌种信息、培养条件、观察结果等。
大肠杆菌的保存和培养
大肠杆菌的保存和培养大肠杆菌, 培养, 保存一．菌种的保存重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后vf fv 的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
大肠杆菌的保存与培养
大肠杆菌的保存与培养大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌，在许多实验室中用作模型生物。
为了长期保存和使用大肠杆菌，需要进行保存和培养。
本文旨在介绍大肠杆菌的保存和培养方法。
大肠杆菌的保存方法冻存法冻存法是保存大肠杆菌最常用的方法之一。
它使用冻干法或液氮法将菌株保存在低温下，以避免菌株变异或污染。
冻干法冻干法是将菌株在液氮下冷冻后进行干燥。
这种方法需要使用冻干器。
冻干器通过减压将菌株冻干，并将其保存在低温下。
液氮法液氮法是将菌株在液氮中冷冻后进行保存。
菌株存储在液氮罐中，使用时取出并解冻。
非冷冻法非冷冻法也可以用于保存大肠杆菌，例如保存在琼脂板上或制备干粉剂。
不过，这些方法缺乏长期保存和使用的稳定性，更适合短期保存。
鉴定编码大肠杆菌可以根据不同的基因、菌株和形态进行分类。
为了便于记忆和识别，每个菌株都有一个独特的编码。
这些编码可以在数据库中查找，以便进行鉴定和分类。
大肠杆菌的培养方法培养基培养基是生长大肠杆菌的基本食物。
常用的培养基包括肉汤培养基、三蔗糖培养基和Luria Broth培养基。
这些培养基提供大量的营养物质和水分，以支持细菌的生长和繁殖。
培养条件大肠杆菌的生长需要适当的环境条件。
最适宜的温度为37°C，pH值为7.0到7.5。
此外，大肠杆菌需要氧气和适当的紫外线照射。
分离和纯化分离和纯化是从混合菌群中收集大肠杆菌的过程。
这些步骤有助于在单独的培养皿中产生纯种大肠杆菌，并减少混杂菌群带来的影响。
分离大肠杆菌的常用方法是麻醉稀释法，也称为涂片法。
涂片法将混合菌群分散到琼脂板的表面上，并等待菌落生长和扩散。
选出大肠杆菌的单一菌群后，可以将其移植到另一培养皿中进行纯化。
大肠杆菌是实验室常见的菌株之一。
为了存储和使用大肠杆菌，需要使用冻存法或其他方法保存，使用培养基提供必要的营养物质支持生长，根据适宜的生长条件进行培养，加强分离和纯化步骤可以提高培养质量。
这些步骤可以帮助实验人员快速高效地进行大肠杆菌的保存和培养。
分子操作基本技术实验报告LB培养基的配制和大肠杆菌的培养
实验一LB培养基的配制和大肠杆菌的培养第一部分理论知识一．生物工程所需的微生物学原理基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。
下面着重讲述大肠杆菌。
1.大肠杆菌的一般特性大肠杆菌（Escherichia coli，简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也能在固体培养基上很好地生长。
在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。
因此，用于培养的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。
遗传上的异质性发生在培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。
其原因可能是天然突变的结果；或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。
据目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。
2. 抗生素抗性抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。
抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死亡。
一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。
例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。
然而，结合着四环素的核糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。
这种抑制的可恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。
当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。
细菌有三种抗生素抗性的机制：（1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。
例如蛋白质合成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（2）组织药物进入细胞。
如对四环素的抗性是由于细菌合成了阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（3）改变或钝化药物。
大肠杆菌的培养与分离
五、大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
小结
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
三、大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项:
1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;
2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
【课堂练习】 例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
FeSO4 CaCl2 H 2O
0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O）， 该培养基可用于培养 固氮微生物。 （4）表中营养成分共有 3 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都 溶化后分装前，要进行的是 调整pH 。 （6）右表中各成分重量确定的原则 是 依微生物的生长需要确定 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应 该增加的成分 琼脂（或凝固剂） 。
大肠杆菌扩大培养操作规程
大肠杆菌扩大培养操作规程大肠杆菌是一种常见的肠道菌，被广泛应用于分子生物学和生物工程领域。
扩大培养是培养大肠杆菌以获得足够量的细菌供实验使用的过程。
以下是大肠杆菌扩大培养的一般操作规程。
1. 需准备的试剂和设备：- LB培养基- 大肠杆菌菌株- 震荡器- 培养瓶- 离心机- 恒温培养箱- 输液器、移液器等实验室常用器材- 高压蒸汽灭菌器2. 扩菌前的准备工作：- 将所需实验器材清洗干净，并用高压蒸汽灭菌器处理消毒。
同时准备好所需的培养基和菌株。
- 根据实验需要准备相应数量的培养瓶。
3. 扩菌操作步骤：- 取一支冷冻菌株或已有菌液，用移液器取适量菌株滴入一瓶LB培养基中。
- 使用移液器或输液器将培养物均匀混合。
- 将带有培养物的培养瓶放入震荡器中，设置合适的震荡速度和时间，一般为200rpm，37摄氏度，16小时。
- 将震荡培养的培养瓶移至离心机中，以12000rpm 离心5-10分钟，使得菌体沉淀到培养瓶底部。
- 弃去上清液，用移液器将上清液吸走，尽量不吸走菌体沉淀。
- 加入适量的无菌PBS缓冲液，使用移液器进行充分悬浮，使得沉淀的菌体均匀分散在PBS中。
- 取适量的悬浮液进行菌液的浓度测定，一般使用菌液光密度测定法（OD600）。
4. 菌液保存：- 如果需要长期保存，将菌液分装到无菌冻存管中，添加10%的甘油保护菌株，竖立冻存管放入-80摄氏度冷冻保存。
- 如果需要短期保存，菌液可存放于4摄氏度冷藏保存。
5. 培养基和器材处理：- 培养瓶清洗后进行高压蒸汽灭菌处理。
- 培养基处理：将未使用完的培养基加热至沸腾，然后冷却后放置冷藏保存，以备下次使用。
总结：通过以上操作规程进行大肠杆菌的扩大培养，可以得到足够量的细菌供后续实验使用。
在操作过程中要注意无菌操作、掌握培养基的配制和菌液的保存，保证实验的可靠性和重复性。
大肠杆菌的冷冻干燥保存
步骤：1各种物品的准备与高温蒸汽灭菌2 菌种的培养:LB液体培养基24h3离心4有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
5真空冷冻干燥。
大肠杆菌的冷冻真空干燥法【试剂与器材】1．菌种: 保存的大肠杆菌2．培养基：LB液体培养基3．溶液或试剂:脱脂奶粉4．仪器或其他用具1ml枪头、无菌滴管，冻干管（青霉素瓶），普通冰箱，低温冰箱(-30℃)、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等。
【操作步骤】1．准备冻干管：青霉素瓶（5ml）用蒸馏水冲洗1～2次，加四层纱布封口后，121℃灭菌30min备用。
配制保护剂：将脱脂奶粉配成10%乳液, 115℃，灭菌10min,随机抽样进行无菌检查,确认无菌后方可使用。
2．培养菌种：将要保存的菌种接入LB斜面培养基中，36±1℃培养24h后，镜检后转接LB液体培养基36±1℃培养24h。
3．离心（细胞收集）：将长好菌的液体培养基分装灭过菌的离心管，6000r/min离心10min。
4. 加保护液：每100ml 培养基离心出的细胞加入5-10ml 保护液混匀。
5、分装样品：用灭过菌的1ml枪头吸取加过菌的保护剂，注入到冻干管中（2mL）。
6．预冻：将加好保护剂的冻干管盖上胶盖封上纱布放于饭盒中，置于-30℃冰柜冷冻24h-48h 即可。
7．冷冻真空干燥: 启动冷冻真空干燥机制冷系统。
当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的样品在无菌条件下打开胶盖（不拿下来，留一个缝隙即可）封好纱布，迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥（约24h）。
8．取出样品：先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。
大肠杆菌
大肠杆菌的菌种保存
一.目的:保存大肠杆菌菌种
二.原理:大肠杆菌为革兰氏阴性菌,单在或成对排列,可以在普通肉汤培养基(形成菌落边缘整齐湿润),麦康凯培养基上(形成红色菌落), 兼性厌氧培养.
甘油可以保护大肠杆菌在低温环境中存活,可以防止菌体在超低温环境中水分形成冰粒,起到保护作用.
三.实验器材及材料:麦康凯培养基(分离细菌),普通肉汤培养基(扩增细菌),超低温冰箱,恒温震荡培养箱,操净台,试管1000ul移液枪,离心杯,甘油.
四.实验步骤
1、培养基：配制营养肉汤培养基
配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml．(高压灭菌备用)
2、分离大肠杆菌
3、染色观察,做细菌生化鉴定,确认为大肠杆菌
4、扩增培养：在液体培养基中接入大肠杆菌菌落（总量约为试管的
1/3），37℃恒温震荡培养箱中培养18-24h
5、保存方法：在离心杯中加入300ul菌液+700ul甘油(80%甘油+20%
生理盐水)－70℃培养
6、验菌:取出离心杯验菌,看是否有细菌生长。
大肠杆菌的培养和分离
以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再
进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始 处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后 再洗涤（特别是培养基）；使用后的废 弃物也要高压灭菌后再抛弃
5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的 大肠杆菌所污染?
转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经 过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列， 所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进 行培养。
划线分离法注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次. 2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可
五、菌种的保存
1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。 2、长期保存： 甘油冷冻管藏法
课后思考题
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌，
在基因工程技术中被广泛采用。
例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
常用培养基概念及配方
LB培养基：是微生物学实验中最常用的培养基，用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
用于培养大肠杆菌、枯草杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。
宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。
改良MC培养基：用于乳酸菌饮料中乳酸菌的菌落计数；原理：大豆蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖和乳糖为可发酵糖类提供碳源；乳酸菌发酵糖产酸使菌落周围碳酸钙溶解，以辨别乳酸菌；琼脂是培养基的凝固剂；中性红为pH指示剂。
MRS培养基：乳酸菌培养基，由多种成分组成，适用于乳酸菌的生长，用来分离培养乳酸菌的一类培养基，一种常用的培养基，宜培养分离乳酸菌。
由于该培养基十分适于乳酸菌的生长，而且抑制其他菌的生长，因此具有分离乳酸菌的功能。
当乳酸菌长成后在培养基上显黄色，之后会变淡黑色。
以此分离乳酸菌。
乳酸菌：凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。
这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。
除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。
目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
常见菌种有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌等自配高浓度污水：葡萄糖5550 mg／L+(NH4)2SO4,1170 mg／L+KH2PO4，170 mg／L+COD为5000 mg／L。
自配污水：葡萄糖555 mg／L+(NH4)2SO4，117mg／L+KH2PO417 mg／L+CaC12 0，08 mg／L+MgSO4，1，534 mg／L+NaHCO3 550．8 mg／L+FeC13·6H2O 0．25 mg／L+C0D 500 mg／L+氨氮为30 mg／L．一、LB培养基配制1升LB培养培养基需：蛋白胨10g/L；酵母粉5 g/L、Nacl10 g/L、单/双去离子水、琼脂15~20g/L（配制液体培养基不需要加，配制固体培养基时加入）。
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大肠杆菌的保存和培养
1菌种的保存
菌种的保存通常采用甘油低温保存法
1.1基本原理：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
1.2使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后液氮速冻，然后放入-70度超低温冰箱贮存。
2菌种的复苏
复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。
甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。
切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。
3大肠杆菌培养
3.1培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。
根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。
3.1.1 LB（Luria-Bertain)液体培养基配制
蛋白胨 1.0%
酵母提取物0.5%
氯化钠 1.0%
称重后搅拌使之完全溶解，用5M NaOH调pH至7.0，高压灭菌20min。
3.1.2含琼脂的固体培养基配制
（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板
（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。
(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度50μl/ml)。
然后4℃保存备用。
3.2 液体细菌培养
3.2.1小量培养:
(1) 取灭菌16 或18mm 口径培养管，加3-5mlLB 培养基，再加50mg/ml 氨苄青霉素3-5ul（宿主菌不加抗生素）
(2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液5-10ul，转入培养液中，封好管口
(3) 37℃摇床培养100-200r/min 至生长饱和，约6-12 小时
3.2.2大量培养: 取500ml 培养瓶内装培养基100-200ml，及相应抗生素。
以0.5-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。
3.3 固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。
方法：采用划痕接种法。
用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。