核酸检验基本技术

第六章核酸检验基本技术

第一节分子生物学基本知识

一、DNA和RNA

DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。

DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。

在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。

DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。

它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。

因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。

在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。

DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。

RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。

RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。

二、DNA的复制和修复

细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。

DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。

在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。

DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。

在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。

在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。

在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。

在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。

该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。

逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。

三、转录

在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。

它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。

合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。

大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。

四、翻译

再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。

构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。

4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。

3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。

在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。

元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。

在核糖体上，有2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何

一种氨基酸的tRNA与其对应，这说明合成蛋白质结束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。

合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲呈一定的空间形状。

第二节分子生物学基本技术

一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表示所携带的遗传信息。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如致病的能力和对抗生素的抗性等。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖和表达的工具叫载体。

细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必须序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

一个理想的克隆抗体大致应有下列一些特性：

①分子量小、多拷贝、松弛控制型；

②具有多种常用的限制性内切酶的单切点；

③能插入较大的外源DNA片段；

④具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1~10kb，如PBR322、PUC序列、PGEM序列和pBluescript（pBS）等。

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：

①培养细菌使质粒扩增；②收集和裂解细胞；③分离和纯化质粒DNA。

含有治理细菌应在能够保存质粒的条件下培养，生长到足够数量时，加入抑制蛋白质合成的抗生素，在细菌停止繁殖后质粒仍然还在复制，这样就可以提高质粒的收获量。

采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton X-100可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断呈不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而质粒的共价闭合环状DNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片产然在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在也液相中。

离心除去断裂的染色体DNA和细胞的碎片，使用酚处理等方法除去包括核酸酶等的蛋白质，在使用乙醇沉积等方法将质粒DNA从上清液中沉积下来，就可以获得高浓度的质粒溶液。

细胞在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其他形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA；

如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。

二、记忆组DNA的提取

基因组DNA的提取是研究各种生物，包括病原微生物遗传特征的基本条件。

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及地步，从而达到提取的目的。

在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组的DNA时应量在温和条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。

一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效