第五章 分子发光分析分解
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五章分子发光分析法
第一章 绪论
二、磷光分析法
4、 室 温 磷 光 固 胶 体 束 表 增 面 稳 磷 室 光 温 磷 光 5、 磷 光 分 析 仪 器 磷 试 光 样 镜 室 → 消 除 荧 光 的 干 扰
6、应用：与荧光分析法相互补充。
化学与化学工程学院分析化学精品课程组制
第一章 绪论
三、化学发光分析法
强
度
的
因
素
化
学
环
境
溶 剂 的 极 性 (大
温度( pH值
低
)
，↑
表
面
活
性
剂
，↑
顺 磁 性 物 质 ，↓
) If ↑，
λ f↑
化学与化学工程学院分析化学精品课程组制
第一章 绪论
一、荧光分析法
6、荧光分析仪器：
⑴2个单色器(激发光、荧光) ⑵吸收池(四面透明) ⑶检测器方向与激发光成直角
②间接化学发光：
C* +F → C+F*， F*→F+hv
③气相化学发光：
2O3+C2H4 →2HCHO*+2O2 ↓CH2O+hv(435nm)
化学与化学工程学院分析化学精品课程组制
第一章 绪论
三、化学发光分析法
④液相化学发光：
a、鲁米诺(发光效率0.01～0.5)
3-氨基苯二甲酸肼测 测H生 2O 物2物 质 拓 宽 ( 有 机 金物 属)离子 鲁米诺+H2O2 金 属 离子 催化 产物+hv(425nm) 氨基酸+O2 氨 基 酸氧 化酶 酮酸+NH3+H2O2
化学发光是由化学反应激发物质所产 生的光辐射。 1、产生条件：
第5章分子发光分析法PPT课件
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
第五章 分子发光分析法PPT课件
菏泽学院化学与化工系
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(二) 荧光效率及其影响因素 1. 荧光效率 发射荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。
荧光效率（f）=
发荧光的分子数 激发态分子总数
也可以各种跃迁的速率常数表示
f
Kf K f Ki
式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，∑Ki为非辐射跃迁的 速率常数之和。一般来说，Kf决定于物质的化学结构；∑Ki 主要决定于化学环境，同时也与化学结构相关，有分析应用
长；
‘ 2
>
2
>
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2020/10/31
的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”
。
系间跨越(intersystem conversion)：不同多重态,有重叠的转动
能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋
—轨道耦合进行。
2020/10/31
❖ 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种 现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是 由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
2020/10/31
第五章_分子发光分析
基态单重态 S0
激发单重态 S1, S2, S3分别表示第 一, 二, 三激发单重态
激发三重态 T1,T2,T3分别表示第 一,二,三激发三重态
内转换
S
2
振动弛豫 内转换 系间跨越
S1 能 量 吸 收 T1 T2 发 射 荧 光 外转换 发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
<二>去活化过程
F l
荧光共振能量转移 （FERT，fluorescence resonance energy transfer）
七、溶液荧光猝灭
荧光猝灭：引起荧光减弱甚至消失的现象 荧光猝灭（Q，quencher）：引起荧光猝灭的物质
类型
1.碰撞猝灭
M* + Q 激发单重态
碰撞 M + Q + 热量
2. 静态猝灭（组成化合物的猝灭）
发射的光量子数 I f 荧光量子产率： f 吸收的光量子数 I a
f
k f ki
kf
kf
：荧光发射过程的速率常数， 决定于分子的化学结构
i
k
:其它相关过程的速率常数之和 。主要决定于化学环境，同时 也与化学结构有关。
四、荧光强度If与溶液浓度C的关系
I0 Ia If It
（2）荧光发射光谱的形状与激发波长lex无关
If l ex1 l ex2 l ex3 l em
荧光都是从第一
激发态的最低振
动能级向基态跃 迁所产生
（3）荧光的激发光谱和发射光谱呈镜像对称
三、荧光量子产率
分子发射荧光的条件： （1）分子的结构必须激发光的频率相适应。 （2）必须具有一定的量子产率。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
第五章分子发光分析法讲义
⑵、内转换（ic）
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
05 分子发光分析
联苯
O OH C COOH
O
芴
O OH C COOH
酚酞
荧光素
N N OH HO O
N N O Al
2，2’-二羟基偶氮苯
形成配合物后有荧光
1、荧光强度和溶液浓度的关系 荧光强度If 正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率 。
If = Ia
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
Ia = I0 - It = I0(1- e - l c)
5、 内滤光和自吸：
体系内存在可以吸收荧光的物质称为内滤光； 当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。
碰撞猝灭 静态猝灭
6、荧光猝灭：
转入三重态的猝灭 电子转移猝灭
自猝灭
光源 第一单色器 或滤光片 激发 荧光 第二单色器 或滤光片
记录仪
样品池
能量色散型x射线荧光分析仪
1）光源：氙灯、高压汞灯、激光；
Icl （t）= cl dc/dt
三、化学发光的类型
按反应体系 的状态分类
气相化学发 光
液相或固相 化学发光
异相化学发 光
三、化学发光的类型 （1）气相化学发光 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于 监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2 等。 臭氧与乙烯的化学发光反应； 一氧化氮与臭 氧的化学发光反应。
这些过程包括： 1、 振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）
分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的
分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程。
2、内转换（Internal Conversion，IC）
对于具有相同多重度的分子，若较高电
子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动 能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通 过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1 ； T2-T1 。
第五章_分子发光分析法(好)
固定待观测的发射波长，改变激发光（入射光）波长， 根据化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系得激 发光谱曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大。
2.荧光发射光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长 ( 选 最大激发波长),扫描发射 光波长，根据化合物发射 的荧光(或磷光)强度与发 射光波长关系得到的曲线 (图中曲线II或III)。
使荧光减弱。如：硝基苯为非荧光物质。
（iii）卤素取代基随原子序数的增加，物质的荧光减弱， 而磷光增强 （重原子效应：重原子取代促进了荧光体中的电子自旋 -轨道的偶合作用，系间窜越S1—T1概率大）。
三、影响分子发光的环境因素
1．溶剂的影响
荧光体的基态与激发态的偶极矩不同，与溶剂分子的 偶极之间存在的静电相互作用也不同； 激发时发生π→π ＊ 跃迁，激发态的极性更大，若溶
S1 磷光发射 T1
S2
Phosphorescence
S0 l2 l1 l3
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为
S1→ S0跃迁），发射波长为 l ′2的荧光 10-8～10
> l > l ；
-10
s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l ′2
l2
l 2
l3
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1： 当S＝0时，即M=2S＋1＝1，称为单重态 当S＝1时，即M=2S＋1＝3，称为叁重态 大多数基态分子处于单重态，表示为S0（基态单重态）
S0→T1 为 禁 阻 跃 迁
；必须通过其他途 径(系间窜越)进入 ，进入的几率小； 根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三 重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。
2.荧光发射光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长 ( 选 最大激发波长),扫描发射 光波长，根据化合物发射 的荧光(或磷光)强度与发 射光波长关系得到的曲线 (图中曲线II或III)。
使荧光减弱。如：硝基苯为非荧光物质。
（iii）卤素取代基随原子序数的增加，物质的荧光减弱， 而磷光增强 （重原子效应：重原子取代促进了荧光体中的电子自旋 -轨道的偶合作用，系间窜越S1—T1概率大）。
三、影响分子发光的环境因素
1．溶剂的影响
荧光体的基态与激发态的偶极矩不同，与溶剂分子的 偶极之间存在的静电相互作用也不同； 激发时发生π→π ＊ 跃迁，激发态的极性更大，若溶
S1 磷光发射 T1
S2
Phosphorescence
S0 l2 l1 l3
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为
S1→ S0跃迁），发射波长为 l ′2的荧光 10-8～10
> l > l ；
-10
s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l ′2
l2
l 2
l3
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1： 当S＝0时，即M=2S＋1＝1，称为单重态 当S＝1时，即M=2S＋1＝3，称为叁重态 大多数基态分子处于单重态，表示为S0（基态单重态）
S0→T1 为 禁 阻 跃 迁
；必须通过其他途 径(系间窜越)进入 ，进入的几率小； 根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三 重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。
第五章分子发光分析法
二 分子发光分析法：
以分子发光现象建立起来的分析方法称为分子发光分析 法。
三 分子发光的类型:
光致发光: 物质因吸收光能而激发发光的现象。 电致发光：吸收电能后的发光现象。 化学发光：吸收化学反应能激发发光。 生物发光：发生在生物体内有酶类物质参与的化学发光
2019/10/10
第七章
分子发光分析法 一 分子荧光和磷光的产
200
2019/10/10
250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
（2） 荧光强度与浓度的关系： 当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间 的关系式为
If=Kc
即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。该式为荧光定量 分析的基本依据。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。对 于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间的 相互作用引起荧光强度下降的物理或化学作用过程。
2019/10/10
第七章 分子发光分析法
一 基本装置及主要构件 二 荧光分光光度计
第三节 荧光分析仪器
2019/10/10
一 基本装置及主要构件：
荧光分析仪器（荧光计和荧光分光光度计）由光源、 单色器、样品池、狭缝和光电倍增管等构件组成。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 1 光源： 高压汞灯 ：常使用365nm、 405nm 和 4 3 6 nm 三 条 谱 线 ， 平均寿命是1500-3000h 氙弧灯：波长范围是250800nm，寿命大约为2000h
分子发光分析法 一 工作曲线法
二 比较法
第四节
三 多组分混合物的荧光
分子荧光定量 分析
分析方法
以分子发光现象建立起来的分析方法称为分子发光分析 法。
三 分子发光的类型:
光致发光: 物质因吸收光能而激发发光的现象。 电致发光：吸收电能后的发光现象。 化学发光：吸收化学反应能激发发光。 生物发光：发生在生物体内有酶类物质参与的化学发光
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第七章
分子发光分析法 一 分子荧光和磷光的产
200
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250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
（2） 荧光强度与浓度的关系： 当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间 的关系式为
If=Kc
即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。该式为荧光定量 分析的基本依据。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。对 于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间的 相互作用引起荧光强度下降的物理或化学作用过程。
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第七章 分子发光分析法
一 基本装置及主要构件 二 荧光分光光度计
第三节 荧光分析仪器
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一 基本装置及主要构件：
荧光分析仪器（荧光计和荧光分光光度计）由光源、 单色器、样品池、狭缝和光电倍增管等构件组成。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 1 光源： 高压汞灯 ：常使用365nm、 405nm 和 4 3 6 nm 三 条 谱 线 ， 平均寿命是1500-3000h 氙弧灯：波长范围是250800nm，寿命大约为2000h
分子发光分析法 一 工作曲线法
二 比较法
第四节
三 多组分混合物的荧光
分子荧光定量 分析
分析方法
第五章分子发光分析法(化学师范、应化)
34
35
I F F Ia I a I 0 I 0 10klc I 0 (1 e 2.303klc )
x2 xn ex 1 x 2! n! e 2.303klc ( 2.303klc) 2 ( 2.303klc) 3 1 2.303klc 2! 3!
H C C H
1-二甲胺基-8-磺酸盐 ΦF=0.03
C H
C H
27
取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合 物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。 给电子基团，如−OH、−OR、−CN、−NH2 、 −NR2等，使 荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度， 使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。 吸电子基团，如−COOH、−NO、−C=O、卤素等，会减弱 甚至会猝灭荧光。 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。如氟苯、氯苯、 溴苯、碘苯的荧光效率分别为0.16、0.05、0.01，碘苯则无荧 光。
23
能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭 体系化合物除外)。
24
共轭效应使荧光增强的原因 ： 主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生 更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的有机 分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了 碰撞去活的可能性。
19
20
荧光物质的最大激发波长( ex，excitation)和最大荧光波长 (em，emission)是鉴定物质的根据，也是定量测定时最灵敏的 条件。
21
(三)荧光效率及其影响因素 1、荧光效率
分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构； ② 吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率 (ΦF)。
第05章分子发光分析
一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行
定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在
0.10.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光 强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍 性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率 影响大、干扰测量的因素较多。
10-9s内完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是
一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的 较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通 过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。 这是产生延迟荧光的机理。
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能
荧光分析 法 磷光 分 析
化 学 发光分 析 法
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、 化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激 发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。 发光分析 包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。
第一节 荧光分析法
吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素 等，会减弱甚至会猝灭荧光。
（5）重原子效应 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。
这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增 加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严 重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由 单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍 对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显 著的影响。
定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在
0.10.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光 强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍 性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率 影响大、干扰测量的因素较多。
10-9s内完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是
一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的 较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通 过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。 这是产生延迟荧光的机理。
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能
荧光分析 法 磷光 分 析
化 学 发光分 析 法
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、 化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激 发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。 发光分析 包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。
第一节 荧光分析法
吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素 等，会减弱甚至会猝灭荧光。
（5）重原子效应 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。
这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增 加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严 重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由 单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍 对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显 著的影响。
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
第五章分子发光分析分解
S0 通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态
的最低振动能级。
l3
l1
l 2 l ?2
(二)荧光效率及其影响因素
1、荧光效率：又称荧光量子产率， 就是指激发
态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用 ? f表示， ? f为0~1，即
发射的光量子数
发荧光的分子数
? f ? 吸收的光量子数 ? 激发态分子总数
单重态与三重态的区别
? 电子的自旋方向不同
? 三重态的能量稍低于单重 态
2.荧光的产生
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
非辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转移 外转移 振动弛豫
激发态 →基态：多种途径和方式 (见下页能级图 )；速度 最 快、激发态寿命最短的途径占优势；
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1 T2
发
射
磷 光
振动弛豫
S0
l3
l1
l 2 l ?2
磷荧外光光转发发换射射：：：电激电子发子由由分第第子一一与激激溶发发剂三单重或重态其态的他的最最分低低子振振之动动间能能产级级→生→基基态
态（相（T互1多→作为S用0S跃而1→迁转S）内0移跃转；换能迁）量，的发非射辐波射振长动跃为弛豫迁l ；‘2的荧内光转换； 10-7～ 1荧S发S02 光0-光9→的s速电激。外发度子发由转射很由→图波换慢SS振可长01使：进动见比荧入1弛，吸0T光-豫发41收～的→或射波1可0内荧磷长s能转光光。要过移的长减光程→能；弱照：系量停l（或间比‘止“S跨分2系0后>猝越→子间l，窜→吸灭2T可跃>1振收禁”l持动的阻1。续；弛能跃一豫量迁段→小）时，T间1
第五章 分子发光分析法
效率的定义，则: If ＝ Ff×Ia If ＝ Ff×（I0－I） I0为入射光强度，I为透射光强度。
根据比尔定律：A＝logI0/I可得
I＝I0×10-A
东 北 师 范 大 学 分 析 化 学 精 品 课
I＝I0×10-A＝ I0× 10-ebc If ＝ Ff×（I0－I）＝ Ff× I0 （1－ 10-A ）
N(CH3)2
Ff＝0.75
Ff＝0.03
扭转离开了平面构型，影响了p-p共轭作用
东 北 师 范 大 学 分 析 化 学 精 品 课
（v）立体异构现象
C C H H
C H
C
H
无荧光
强荧光
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3、环境因素对荧光的影响：
（1）溶剂的极性：电子激发态比基态的极性大，溶剂 的极性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。
l2
l1
l3
东 北 师 范 大 学 分 析 化 学 精 品 课
l2 l3> l1 > l2
Only l3 l1 l3
东 北 师 范 大 学 分 析 化 学 精 品 课
S2
Intersystem Crossing 系间窜跃
S1 T1
磷光发射 Phosphorescence S0
l2
l1
东 北 师 范 大 学 分 析 化 学 精 品 课
但在高浓度时，If ＝ KC不成立 If 原因： （1）高次项 （2）自熄灭现象， 自吸收现象
C
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（3）荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间
发生的导致荧光强度下降的物理化学过程叫荧光猝灭。
根据比尔定律：A＝logI0/I可得
I＝I0×10-A
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I＝I0×10-A＝ I0× 10-ebc If ＝ Ff×（I0－I）＝ Ff× I0 （1－ 10-A ）
N(CH3)2
Ff＝0.75
Ff＝0.03
扭转离开了平面构型，影响了p-p共轭作用
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（v）立体异构现象
C C H H
C H
C
H
无荧光
强荧光
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3、环境因素对荧光的影响：
（1）溶剂的极性：电子激发态比基态的极性大，溶剂 的极性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。
l2
l1
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l2 l3> l1 > l2
Only l3 l1 l3
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S2
Intersystem Crossing 系间窜跃
S1 T1
磷光发射 Phosphorescence S0
l2
l1
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但在高浓度时，If ＝ KC不成立 If 原因： （1）高次项 （2）自熄灭现象， 自吸收现象
C
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（3）荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间
发生的导致荧光强度下降的物理化学过程叫荧光猝灭。
第5章-分子发光分析法(新
样品室
样品池
光检测器
放大器
信号 处理系统
稳压电源
5.3 3.4 化学发光分析技术的应用 2．气相化学发光体系
3．固相化学发光体系
液相化学发光体系分为两类：
(1)经典化学发光体系，如鲁米诺、光泽精、过氧化草酸 酯、洛粉碱萤火虫荧光素等化学发光体系；
(2)无机氧化剂直接氧化一些物质产生化学发光的新体系， 如高锰酸钾、铈(IV)、过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸 盐和铁氰化钾等。
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
1. 分子荧光光谱的产生 2. 荧光的产生 3. 激发光谱与发射光谱 4. 分子结构与荧光的关系
③ 外部条件对荧光强度的影响
320 448
强 度
激发320nm 硫酸奎宁
350
448
激发350nm 硫酸奎宁
(a)
λ/nm
强
320 激发320nm
度
0.1mol/LH2SO4
蒽的激发光谱和荧光光谱
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
1. 分子荧光光谱的产生 2. 荧光的产生 3. 激发光谱与发射光谱 4. 分子结构与荧光的关系
溶液荧光的特征： ① 斯托克斯位移 ② 荧光发射光谱的形状与激发光波长无关 ③ 荧光光谱的形状与激发光光谱呈镜像关系
/nm
蒽乙醇溶液激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
1. 分子荧光光谱的产生 2. 荧光的产生 3. 激发光谱与发射光谱 4. 分子结构与荧光的关系
分子能级与电子的多重性：基态、单重态、多重态
图5-1 单重态和三重态的电子分布 A基态；B激发单重态；C激发三重态
5.2 荧光分析 5.2.1 基本原理
分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
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② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
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如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
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四、 定量分析方法
1 定量依据
当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之 间的关系式为 If=2.3φfI0εbc 式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。 在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成 If =K c 即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀（A<0.05）的 溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
(四)荧光的激发光谱和发射光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发 射波长)，化合物发射的荧光 强度与照射光波长的关系曲 线 (图中曲线I ) 。 2.荧光(磷光)的发射光谱曲线 固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光与 发射光波长关系曲线(图中曲线 II)。
3.激发光谱与发射光谱的关系
再如 苯胺在pH7～12溶液中有蓝色荧光，而在pH小于2大于
13的溶液中都不发荧光。 另外金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受到溶液的
pH影响
(4)表面活性剂的影响
表面活性剂的存在，使得处于激发单重态的的 荧光物质分子起到保护作用，减少了非辐射跃迁几 率，提高荧光效率。
(5)顺磁性物质的影响
顺磁性物质的存在，使得处于激发单重态分子 向三重态的体系间穿越速率增大， 荧光效率降低。 如O2 。
磷光测定。
（2）磷光镜 有些物质同时会发生荧光和磷光，为了能在同时有
荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器
和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个斩 波片，并由一个同步马达带动，这种装置称作磷光镜。
三、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少， 它主要用于测定有机化合物。 (1) 稠环芳烃分析
第二节 磷光分析法
磷光是从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射
分子磷光分析法是依据分子磷光光谱进行定性，以 磷光强度进行定量的一种分析方法。
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长 （2）磷光的寿命比荧光长
一、基本原理
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系 当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质
21.5
38.8
405
410
0.055
0.064
(2)温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，一般来说，溶液的荧光强度 随着温度升高而降低。
(3) 溶液pH
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一
般都与溶液的pH有关，因此在荧光分析中要严格控制溶液的
pH值。 如苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性溶液中，无荧光
π a
π b
π c
单重态与三重态的区别 电子的自旋方向不同 三重态的能量稍低于单重 态
单重态和三重态的 电子分布图
2.荧光的产生
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 非辐射跃迁
荧光
磷光Biblioteka 系间窜越 内转移外转移
振动弛豫
激发态 → 基态：多种途径和方式 ( 见下页能级图 ) ；速度最 快、激发态寿命最短的途径占优势；
a.斯托克斯(Stokes)位移 指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光 谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
荧光发射光谱 荧光激发光谱 磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如
(6)溶液荧光的猝灭
荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引
起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低
的物质称为猝灭剂。 （1）碰撞猝灭 （2）静态猝灭 （3）转入三重态的猝灭 （4）发生电子转移反应的猝灭 （5）荧光物质的自猝灭 M+hγ—M*,M*+Q—M+热 M+Q—MQ 非荧光 三重态O2 M+Q—发生电子转移 荧光物质浓度较高
能级图l
2
,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单
重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的 荧光(如l ‘2 )。
S2
能 量 内转换 振动弛豫 系间窜跃 发 射 荧 光 发 射 磷 光 内转换
S1
吸 收
T1
T2
外转换
振动弛豫
S0
l1
l2
l 2
l3
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。
（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂 的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞 有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
（4）取代基效应：芳环族化合物苯环上不同取代基 对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可 归为下列几种类型： 第一 给电子基团使荧光增强 -OH、-NH2、-NR2、-OR； 第二 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光-COOH、 -NO2 ； 第三 卤素等重原子取代基，常导致荧光减弱和磷光 增强。 第四 将一个高原子序数的原子引入，常常增强磷光 而减弱荧光； 第五 双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的 平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环
芳烃和杂环化合物（致癌物质）
(2) 农药、生物碱、植物生长激素的分析
(3) 药物分析 见下表
检出限：比分光光度法低2～4个数量级；
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围较分光光度法小。
二、基本原理
(一)分子荧光光谱的产生 1.分子能级与电子能级的多重性
能 量 π* π* π*
a. 基态 S0 b. 激发单重态 Sn c. 激发三重态 Tn 2S+1=1 2S+1=3
3、环境因素对荧光的影响
(1) 溶剂的影响
由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质
在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同 如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂
四氯化碳 氯仿
介电常数
2.24 5.2
荧光峰λ/nm
390 398
荧光效率
0.002 0.041
丙酮
乙腈
第五章 分子发光分析
分子发光
基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，
当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回
基态时，便产生分子发光。
分类：依据激发模式不同
光致发光，场致发光，热致发光，化学发光等
光致发光：按激发态的类型分
荧光和磷光
第一节
一、概述
荧光分析法
分子荧光分析法是依据分子荧光光谱进行定性， 以荧光强度进行定量的一种分析方法。 特点：（1）灵敏度高
3.重原子效应
使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入 重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度， 这种效应称作重原子效应。 机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级 交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合 作用，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有 利于增大磷光效率。
4.室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择 的限制，发展了以下几种室温磷光法： （1）固体表面室温磷光法 基于测量室温下吸附于固体基质(载体)上的 有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能 将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加 刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活 化过程，而本身又不产生磷光背景。
内转换
振动弛豫 系间窜越
内转换
S2 S1
能 量 吸 收 发 射 荧 光
T1
外转换 发 射 磷 光
T2
振动弛豫
S0
l1
l2
l 2
l3
荧光发射： 电子由第一激发单重态的最低振动能级 → 基 磷光发射： → 基态 外转换：电子由第一激发三重态的最低振动能级 激发分子与溶剂或其他分子之间产生 ‘ 的荧光； 10-7～ 态（ 多为 S → S 跃迁），发射波长为 l （ T → S 跃迁）； 内转换 内转换 1 0 1 0 相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 振动弛豫 2 S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S2 -9 s 电子由 10 。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小， 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间窜跃
浓度c之间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc
式中： φp 为磷光效率， I0为激发光的强度， ε磷光物
质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。 在一定条件下， φp 、 I0 、 ε 、 b 均为常数，所以 上式可写成： 浓度c成正比。 Ip=Kc 即磷光强度与磷光物质的
2.温度对磷光强度的影响
随着温度的降低，磷光逐渐增强。 低温磷光:用液氮作冷却剂
(二)荧光效率及其影响因素
1、荧光效率：又称荧光量子产率，就是指激发
态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用f表示， f为0~1，即
发射的光量子数 发荧光的分子数 f 吸收的光量子数 激发态分子总数
荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大， 物质发射的荧光也就越强。 Kf f K f Ki
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越 振动弛豫 → T1 荧光的发射波长比吸收波长要长； l ‘2 > l → > l ； 2 1 -4 发光速度很慢： S1 10 ～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间 T T2 能
内转移
量
1
系间窜跃
系间窜跃。 S0 通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态 l3 的最低振动能级。 l 2 l1 l2