细胞自噬与神经疾退行性疾病

测
Western Blot
检
测
染色技术
标记自噬溶酶体结构是以往应用
较为广泛的活体检测技术。 MDC 和
AO 是常用的嗜酸性染料，用于标记 酸性细胞器。当溶酶体内容物为酸
性时，可获得阳性染色信号。
检
测
MDC染色
检
测
自噬标志物的检测在自噬研究中发挥了 巨大的作用，使得人们可以简便、动态、实 时并定量地检测细胞内自噬水平。然而单独 检测每一种自噬标志物都有一定的局限性和 影响因素，在研究自噬时必须慎重考虑研究 条件，适当设置阴性与阳性对照，使用多种 自噬抑制剂或者基因沉默等技术，多方面、 多层次进行实验以确认细胞的自噬水平。
自噬与HD
• 细胞自噬
– – – – – 自噬的基本概念 自噬的发生过程 自噬的调控 自噬的特点 自噬的检测
• 自噬与神经退行性疾病
– AD – PD – HD
谢谢!!!
调
控
mTOR通路
mTOR 对细胞自噬起到负调控作用。在正常生
长条件下,mTOR处于激活状态, 细胞自噬受到抑
制;当细胞处于饥饿或受到雷帕霉素刺激时,mTOR
被抑制,细胞自噬被诱导增强。
丝裂原刺激信号 能量感受信号 胰岛素信号 氨基酸信号 p53通路
调
控
PI3K Ⅲ 通路
Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K Ⅲ)是一个正 调控蛋白，它能够磷酸化磷脂酰肌醇(PI),生 成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，而后PI3P利用 胞质中的蛋白质形成自噬体膜。 PI3K Ⅲ也能与Beclin-1形成复合体，该复
细胞自噬
及其在神经退行性疾病中的作用
目 录
细胞自噬
神经退行性疾病
基本概念
自噬
Autophagy 一词来源于希腊语，auto指自
身、phagy是吃的意思，autophagy意为自体 吞噬，简称自噬。
溶酶体
基本概念
自噬
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器 并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自
噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉
2h后自噬溶酶体基本降解消失
• 保守性：自噬相关基因
• 可诱发性：饥饿、微生物感染、缺氧、生长因子缺
乏、放疗、化疗等条件都可以诱导自噬的活化
• 批量降解：清除受损细胞器、错误折叠蛋白、冗余
的蛋白以及代谢产物
检
测
1电镜技术
• 普通透射电镜技术 • 免疫电镜技术 2化学和免疫化学染色法
• 基于自噬标记蛋白的检测方法 • 标记自噬溶酶体结构的检测技术
(AMP2A)
基本概念
分子伴侣介导的自噬
分类
小自噬
大自噬
发生过程
1 2
自噬流
3
起始
延伸
闭合
4
成熟
自噬前体 自噬体 溶酶体
5
降解
自噬溶酶体
调
控
模式图
自噬上游调控
自噬过程调节
调
控
上游调控
生理条件下, 细胞自噬受到严格的调控。
现在了解得比较多的细胞自噬调控通路主要
有两条: mTOR通路和Ⅲ型PI3K通路。很多
检
测
电镜技术
普通透射电镜技术
• 在超薄切片上可清晰地观察到自噬结构的形态和构 造，实验指标包括细胞自噬水平和自噬结构的变化， 前者是指发生自噬的细胞出现率，后者以自噬细胞 内自噬结构数目或自噬结构与细胞质的断面面积之 比衡量 免疫电镜技术
• 可标记位于自噬前体和自噬体内外膜上的LC3，该方 法可用于鉴别自噬前体，自噬体和自噬溶酶体
检
测
普通透射电镜技术
吞噬泡：新月状或杯状，双层或多层膜，有包
绕胞浆成分的趋势
自噬体：由包裹未吞噬降解的胞浆物质、细胞
器的双层膜结构组成。
自噬溶酶体：由单层膜结构组成，其中包裹着 处于不同降解阶段的胞浆成分。
检
测
普通透射电镜技术
检
测
普通透射电镜技术
检
测
普通透射电镜技术
检
测
化学和免疫化学染色法
神经退行性 疾病
在该疾病的早期阶段自噬起保护性作用，激活自噬可加速变性蛋 白的清除来阻止疾病的进一步发展。然而，随着疾病的进展，蛋 白质聚积物越来越多，对溶酶体蛋白酶降解的敏感性下降，自噬 的持续性激活最终引发自噬性细胞死亡，这样自噬又促进了神经 元的死亡。
阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s）、亨廷顿氏病（Huntington’s）和 帕金森氏病（Parkinson’s）等神经变性性疾病两个最主要的特征 是：胞浆中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解体系活性的改变。
其他细胞自噬调控信号直接或间接的通过这
两条通路发挥作用。
调
控
营养丰富 mTOR被激活 磷酸化Atg13
mTOR通路
与Atg1的结合能 力降低 自噬水平低 Atg1的活性低 与Atg17作用弱
mTOR 饥饿或雷帕 霉素刺激
mTOR被抑制
反之
.......
自噬水平高
在mTOR通路中，mTOR复合体通过与Atg13的作用，间接 地影响了Atg1-Atg13-Atg17蛋白复合体的形成，进而影响了 自噬水平的高低，Atg13在蛋白复合体中起到了介导作用。
合物在自噬体形成的起始阶段起重要作用。
调
控
自噬过程调节
起始:Atg1复合体
膜的扩增与底物识别选择: Atg12-Atg5和
Atg8分别泛素化修饰
自噬体成熟与降解
自噬过程中的其他重要成员:分泌与内吞途
径和细胞骨架
调
控
自噬的调控
泛素化修饰
调
控
特
点
• 双重性：细胞存活&细胞死亡
• 半衰期短：自噬体只能维持8min，与溶酶体融合，
此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更
新，在细胞发育、细胞免疫、组织重塑及对环
境适应等方面有着十分重要的作用。
基本概念
自噬相关基因
自噬在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎
动物和人都可以找到参与自噬的同源基因。目前至少已
经鉴定出33种参与酵母自噬的特异性基因。其命名从最
初称为APG，AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬 相关基因ATG(autophagy-related gene，ATG)。哺乳 动物自噬基因的命名和酵母相似，但也有个别差异，如 酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母晦ATG6在哺乳
自噬与AD
• 细胞自噬
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• 自噬与神经退行性疾病
– AD – PD – HD
自噬与PD
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– AD – PD – HD
大自噬
自噬底物
分子伴侣自噬 线粒体自噬
p62
LAMP2A HSC70 Atg32 BNIP3
检
测
阴性对照
GFP-LC3指示技术
雷帕霉素处理
பைடு நூலகம்
NDV感染
检
测
GFP-LC3指示技术
荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪HeLa cells自噬的形成
检
测
免疫荧光染色-LC3B
对照组
氯奎处理组
检
分类
基本概念
根据自噬的过程分类
• 大自噬(Macroautophagy)—主要
分类
• 小自噬(Microautophagy):指溶酶体膜直接内陷包裹底
物并降解的过程。
• 分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，
CMA):热休克蛋白70(Hsp70)与溶酶体相关膜蛋白2A
动物则称为Beclin 1。
基本概念
自噬相关蛋白
主要自噬相关蛋白（ Atg ）
基本概念
根据其降解底物的特异性分类
• 非选择性自噬：随机 • 选择性自噬：专一
– 线粒体自噬 (Mitophagy) – 内质网自噬 (ER-phagy) – 过氧化物酶体自噬 (Pexophagy) – 细胞核自噬 (Nucleophagy)
1基于自噬标记蛋白的检测方法
• 自噬体数量检测—免疫荧光/组织化学技术
• 蛋白表达量检测—Western-blot
2标记自噬溶酶体结构的检测技术
• 单丹磺酸戊二胺（MDC）染色
• 吖啶橙（AO）染色
检
自噬类别
测
相关环节
标志物
LC3 (Atg8)
自噬标记蛋白 Beclin 1 (Atg6)
Atg5-Atg12 自噬体的形成 Atg 16L Atg9 Atg14 DRAM1 ZFYVE1/DFCP1 溶酶体 LAMP-1 LAMP-2