物理方法构建肝细胞自噬模型 朱学敏

ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ． Ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ６ － １２ － １８ － ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｌｉｎ １ Ａｔｇ５ ａｎｄ ＬＣ３ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ ＲＴ － ｑＰＣＲ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ
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３２ 卷 ８期 ２０１６ 年 ８月 ㊀ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌ， Ｖｏｌ． ３２ Ｎｏ． ８， Ａｕｇ． ２０１６ 临 床 肝 胆 病 杂 志 第 第
ÿ6}~ *+ $ÔÕ ,-. »
１０００６９ ） （首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 佑 安 医 院 重 症 肝 病 科 ，北 京
自 噬 是 真 核 细 胞 用 于 清 除 细 胞 内 聚 物 以 及 损 伤 ［ 细 胞 器 而 维 持 细 胞 稳 态 平 衡 的 一 种 蛋 白 降 解 途 径］。 细 胞 自 噬 包 括 方 式 ， 即 巨 自 噬 、 微 自 噬 以 及 伴 侣 ３种 ［ ］， 分 子 介 导 的 自 噬 通 常 提 及 的 自 噬 泛 指 巨 自 噬 ， 本 研 究 中 均 是 指 巨 自 噬 。通 常 自 噬 在 受 到 氧 化 应 激 、 营
：
，
（ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ ＹｏｕＡｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００６９， Ｃｈｉｎａ） ， ，ａｎｄ ａｎ Ｏ （ ）
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ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｏｎ ｌｉｖｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ Ｔｈｅ ７７０２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ９５％ ａｉｒ ａｎｄ ５％ ＣＯ２ ａｔ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ３７ ħ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ． Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｅｒ ｔｈｒｅｅ － ｇａｓ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ３７ ħ ａ ＣＯ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５％
ＺＨＵ Ｘｕｅｍｉｎ ＭＥＮＧ Ｑｉｎｇｈｕａ．
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ７７０２ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ ａｎｄ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｌａｙ
㊀ 应用物理方法构建正常人肝细胞株 ７７０２ 细胞的低氧饥饿自噬模型，为研究细胞自噬对肝脏功能的影响机制奠定 摘 要 ： 目 的 ㊀ 选用 ７７０２ 细胞，使用完全 ＤＭＥＭ 培养基，在 ３７ ħ 和 ５％ ＣＯ 培养箱中培养（ 正常对照组） ，使用 Ｂｉｎｄｅｒ 三气培养箱， 方 法
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朱 学 敏 ，孟 庆 华
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． 物 朱 学 敏 ， 等 理 方 法 构 建 肝 细 胞 自 噬 模 型
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［ ］， 养 不 足 、 损 伤 等 刺 激 信 号 时 被 触 发 由 游 离 双 层 膜 将 细 胞 液 或 者 受 损 的 细 胞 器 包 裹 起 来 形 成 自 噬 体 ， 并 与 溶 酶 体 结 合 形 成 自 噬 溶 酶 体 ， 把 内 容 物 降 解 为 核 苷 酸 、 氨 基 酸 以 及 游 离 脂 肪 酸 ， 然 后 合 成 三 磷 酸 腺 苷 和 新 的 大 分 子 ， 从 而 维 持 细 胞 自 稳 态 的 过 程 。细 胞 自 噬 是 生 物 体 中 相 当 保 守 而 且 非 常 重 要 的 代 谢 途 径 ， 可 以 作 为 细 胞 保 持 稳 态 的 管 家 机 制 ， 调 控 过 氧 化 酶 体 、 线 粒 ［ ］ 体 及 内 质 网 的 不 断 更 新 ， 调 控 脂 质 内 稳 态 及 代 谢， 此 外 还 能 清 除 细 胞 质 内 受 损 的 细 胞 器 和 代 谢 产 物 ， 进 行 亚 细 胞 水 平 的 重 构 ， 从 而 保 护 受 损 细 胞 。许 多 研 究 已 表 明 细 胞 自 噬 对 维 持 细 胞 生 存 以 及 细 胞 生 物 学 功 能 来 说 十 分 关 键 ， 另 外 ， 细 胞 自 噬 与 机 体 的 多 种 生 理 和 病 理 ［ ］ 过 程 密 切 相 关。目 前 普 遍 采 用 电 镜 、 免 疫 荧 光 、 蛋 白 质 印 迹 等 方 法 检 测 自 噬 体 及 其 标 志 蛋 白 。参 与 自 噬 调 ＵＬＫ 复 ＰＩ３Ｋ 复 Ａｔｇ１２ － Ａｔｇ５ 合 物 、 合 物 、 控 的 复 合 物 有 白 复 合 物 及 合 物 等 ， 其 中 － Ａｔｇ１６ 蛋 Ａｔｇ８（ ＬＣ ） － ＰＥ 复 涉 及 多 种 自 噬 标 志 性 分 子 ，而 通 常 将 Ａｔｇ５、 Ａｔｇ７、 作 为 自 噬 观 察 指 标 。本 研 究 通 过 低 氧 Ｂｅｃｌｉｎ － １、 ＬＣ 等 饥 饿 的 物 理 方 法 来 构 建 肝 细 胞 自 噬 模 型 ， 为 进 一 步 研 究 细 胞 自 噬 对 肝 衰 竭 的 影 响 奠 定 实 验 基 础 。 料 与 方 法 １㊀ 材 料 与 试 剂 １． １㊀ 材 ㊀ 正 ７７０２ 细 常 人 肝 细 胞 株 （ 胞 株 ） 和 ＧＦＰ － ＬＣ 质 ＤＭＥＭ 培 粒 由 北 京 市 肝 病 研 究 所 提 供 ； 养 基 ＨｙＣｌｏｎｅ， 美 国 ） ； 胎 牛 血 清 （ 四 季 青 ） ； 青 霉 素 、 链 霉 素 双 （ 抗 （ 北 京 索 莱 宝 公 司 ） ； 体 （ Ｂｅｃｌｉｎ － １、 Ａｔｇ５ 抗 Ｃｅｌｌ － Ｓｉｇｎａ ｌｉｎｇ 公 司 ， 美 国 ） ； 体 （ 司 ， 美 国 ） ； 羊 抗 兔 ＬＣ 抗 Ｓｉｇｍａ 公 体 根 过 氧 化 物 酶 （ 北 京 中 山 公 司 ） ； ＩｇＧ 抗 －辣 ＰＶＤＦ 膜 （ 司 ， 美 国 ） ； 转 录 试 剂 盒 、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公 ＲＴ － ９ＰＣＲ 反 Ｔａｋａｒａ 宝 生 物 工 程 （ 大 连 ）有 限 公 司 ］ ； ＳＹＢＲ［ Ｔｒｉｚｏｌ （ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ， 美 国 ） ；Ｂｅｃｌｉｎ － １、 物 ［ 生 工 生 物 工 程 （ 上 海 ） Ａｔｇ５ 引 有 限 公 司 ］ ； 司 ， 美 国 ） ； 质 粒 大 提 取 试 剂 盒 ＰＥＩ （ Ｓｉｇｍａ 公 （ 康 为 世 纪 公 司 ） 。 １． ２㊀ 方 法 用 胞 培 养 皿 ， 应 用 含 胞 培 养 １． ２． １㊀ ７７０２ 细 ㊀ 使 １０ ｃｍ 细 有 牛 血 清 、 霉 素 和 霉 素 １０％ 胎 １００ μｇ ／ ｍｌ 青 １００ μｇ ／ ｍｌ 链 的 高 糖 养 液 ， 在 培 养 箱 中 培 ＤＭＥＭ 培 ３７ ħ 、 ５％ ＣＯ 的 养 ， 每 代 。 ２４ ２８ ｈ 传 １次 粒 转 染 （使 用 板 进 行 转 染 ） １． ２． ２㊀ ＧＦＰ － ＬＣ 质 ２４ 孔 （ 转 染 前 ， 将 细 胞 接 种 于 含 抗 生 素 的 １） １日 ５００ μｌ 不 培 养 基 中 ， 使 其 在 转 染 时 长 至 ３０％ ５０％ 融 ２） 合 。（ 血 清 ５０ μｌ 无 转 染 液 制 备 ， 每 孔 细 胞 用 量 如 下 ： ①用
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ｄｏｉ １０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００１ － ５２５６． ２０１６． ０８． ０２７ ２０１６ － ０２ － １９ ２０１６ － ０４ － ０１ ８１４７０８７７ １９９０ －
： 收 稿 日 期 ： ； 修 回 日 期 ： 。 基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （ ） 作 者 简 介 ： 朱 学 敏 （ ）， 女 ， 主 要 从 事 病 毒 性 肝 炎 及 肝 衰 竭 方 面 的 研 究 。 通 信 作 者 ： 孟 庆 华 ， 电 子 信 箱 ： ｍｅｎｇ＿ｑｈ＠ １２６． ｃｏｍ。
， ， ，ａｎｄ ２４ － ｈｏｕｒ ｈｙｐｏｘｉａ － ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ． Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ， ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｌｉｎ １ ａｎｄ Ａｔｇ５ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＬＣ ｐｌａｓｍｉｄ，ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ． Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄａｔａ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔ － ｔｅｓｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｙ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ；ｔｈｅ ｃｈｉ － ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃａｔｅ ｇｏｒｉｃａｌ ｄａｔａ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｕｐｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ Ｔｈｅ ６ － ｈｏｕｒ ｈｙｐｏｘｉａ － ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｌｉｎ １ ，Ａｔｇ５ ，ａｎｄ ＬＣ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｌ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ ６ － ｈｏｕｒ ｈｙｐｏｘｉａ － ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｌｉｎ １ ａｎｄ Ａｔｇ５ ， ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｇｒｅａｔｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｌｉｎ １ ａｎｄ Ａｔｇ５ （ ａｌｌ Ｐ ＜ ０． ０５ ） ． Ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ － ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ａｎｄ ｔｈｅ ６ － ｈｏｕｒ ｈｙｐｏｘｉａ － ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ （ ａｌｌ Ｐ ＜ ０． ０５ ） ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ Ｈｙｐｏｘｉａ ａｎｄ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ａｔ ６ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ ａｎｄ ｓｔａｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃａｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ，
３
，
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０． ３％ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｈｙｐｏｘｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ － ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ ｗａｓ
，Hale Waihona Puke Baidu
，
， ，
３
ｖａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍｏｄｅｌｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
基础。
设置温度为 ３７ ħ ，ＣＯ２ 浓度为 ５％ 、Ｏ２ 浓度为 ０． ３％ 来提供缺氧环境，使用无血清 ＤＭＥＭ 培养细胞来诱导饥饿，将其分为低氧饥饿 ６ 、１２ 、１８ 和 ２４ ｈ ４ 个时间组。 用 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 检测正常对照组和不同时间点实验组的 Ｂｅｃｌｉｎ － １ 、 Ａｔｇ５ 以及 ＬＣ３ 蛋白表达水平的变 化；通过实时荧光定量 ＰＣＲ 法检测各组 Ｂｅｃｌｉｎ － １ ｍＲＮＡ、Ａｔｇ５ ｍＲＮＡ 的表达；转染 ＬＣ３ 质粒后利用免疫荧光法观察各组细胞发生 自噬的情况。 计量资料多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用 ＬＳＤ － ｔ 检验；计数资料组间比较采用 χ２ 检验。 饥饿处理 ６ ｈ 组的 Ｂｅｃｌｉｎ － １ 、Ａｔｇ５ 及 ＬＣ３ 的蛋白表达量高于正常对照组及其他处理组；低氧饥饿 ６ ｈ 组较其他各组的 Ｂｅｃｌｉｎ － １ ｍＲＮＡ 和 Ａｔｇ５ ｍＲＮＡ 的表达量显著增高，且其增高最显著，差异均有统计学意义（ Ｐ 值均 ＜ ０． ０５ ） ；低氧饥饿组自噬小体数量均高于 正常对照组，其中低氧饥饿 ６ ｈ 组的自噬小体数量最高，差异均有统计学意义（ Ｐ 值均 ＜ ０． ０５ ） 。 饿可以诱导 ７７０２ 细胞发生自噬，并且在低氧饥饿 ６ ｈ 时，细胞发生自噬最为明显。 ㊀ 通过物理方法构建的低氧饥 结 论 ㊀ 低氧 结 果
关 键 词 ： 肝疾病； 自噬； 模型， 生物学 中 图 分 类 号 ： 献 标 志 码 ： Ｒ５７５㊀ ㊀ ㊀ 文 Ａ㊀
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文 章 编 号 ： １００１ － ５２５６ （ ０８ ）－ １５６６ － ０５
Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍｏｄｅｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ