噬菌体展示技术常见问题与解答
“噬菌体侵染细菌的实验”常见问题释疑
噬菌体侵染细菌的实验 常见问题释疑祝远超!!湖北省天门市岳口高级中学!1"%T$."摘!要!对高中生物学教学中-噬菌体侵染细菌的实验.常见的疑难和易错问题进行归纳和解析$包括为何要用".D 和"#C 分别标记噬菌体$如何标记$以及如何理解在离心后的上清液和沉淀物中分别有放射性物质等#关键词!噬菌体侵染细菌!实验!常见问题!释疑!"证明34%是遗传物质的实验为何要选用噬菌体和细菌作为实验材料众所周知$一个实验能否成功$首先在于其实验材料的选择是否合理#本实验用噬菌体和细菌作为实验材料是因为两者具有以下优点'%个体很小$结构简单$容易看出因遗传物质改变而导致的结构和功能的变化#噬菌体无细胞结构$仅由G E F 和蛋白质组成$而细菌是单细胞生物#&繁殖快#噬菌体短时间内可大量繁殖!K .噬菌体在"Tm 下只需1$>;,就可以产生%$$U "$$个子代噬菌体%%&"$细菌.$U "$>;,就可繁殖一代##"为何要用$#6和$,(而不用!+7 $8 !9-或!,4标记噬菌体用".D 和"#C 分别标记噬菌体的目的就是要将其G E F 和蛋白质间接分开$单独地)直接地去观察它们的作用#因为硫仅存在于K .噬菌体的蛋白质中$磷几乎都存在于其G E F 中$而@)Q )Z )E 是G E F 和蛋白质共同含有的元素#因此$若用%1@)"Q )%&Z 或%#E 标记噬菌体$则无法将其G EF 和蛋白质-分开.#$"能用$#6和$,(标记同一噬菌体吗该实验标记噬菌体时分了两组'一组仅用"#C 标记$另一组仅用".D 标记$即有的噬菌体仅含"#C $有的噬菌体仅含".D$没有既含"#C 又含".D 的噬菌体#为何不用".D 和"#C 标记同一噬菌体呢0因为放射性检测时只能检测到部位$不能确定是何种元素的放射性$故"#C !标记蛋白质"和".D !标记GEF "不能同时标记在同一噬菌体上$应将两者分别标记#+"如何标记噬菌体因为噬菌体是严格的寄生微生物$只能在活细胞内才能生存和繁殖$故不能用含".D 或"#C 的普通培养基培养噬菌体#因此$欲标记噬菌体$必先标记其宿主细胞///大肠杆菌!因为K .噬菌体专门寄生在大肠杆菌体内"#所以$首先在含有".D 或"#C 的培养基中培养大肠杆菌$得到含有".D 或"#C 的大肠杆菌#然后$再用上述大肠杆菌培养K .噬菌体$得到G E F 含有".D 或蛋白质含有"#C 的K .噬菌体#,"噬菌体侵染细菌的大致过程如何噬菌体侵染细菌的第一步是-吸附.$即噬菌体的尾部附着在细菌的细胞壁上#然后$噬菌体释放溶菌酶$在细菌的细胞壁上打开一个缺口$噬菌体将其头部的G E F 注入细菌细胞内!其蛋白质外壳留在细菌的细胞壁外"#噬菌体的G E F 进入细菌后$细菌的G E F 合成停止#在噬菌体G E F 的控制下$利用细菌体内的氨基酸和脱氧核苷酸来合成子代噬菌体的蛋白质外壳和G E F $然后将两者组装成子代噬菌体$组装完成后$在溶菌酶的作用下溶解细菌细胞壁$促使细菌裂解$从而释放出成熟的子代噬菌体#:"用仅被$,(标记的噬菌体侵染细菌的实验中 离心后沉淀物为何有放射性正常情况下$亲代噬菌体的蛋白质外壳在上清液中$大肠杆菌在沉淀物中#因此$用仅被"#C 标记的噬菌体侵染细菌$理论上离心后上清液具有很高的放射性$沉淀物应该没有放射性#而实际上上清液的放射性比理论值略低$沉淀物有一定的放射性#出现误差的原因何在呢0离心后沉淀物有放射性$说明沉淀物中含有亲代噬菌体的蛋白质外壳#而离心之前用搅拌器搅拌过$其目的是使吸附在细菌上的噬菌体与细菌分离#若亲代噬菌体外壳均与细菌分离$则沉淀物是不可能有放射性的#因此$沉淀物有放射性的唯一可能就是搅拌不充分$有少量含"#C 的噬菌体外壳吸附在细菌表面$随细菌离心到沉淀物中#1"用仅被$#6标记的噬菌体侵染细菌的实验中 离心后上清液为何有放射性用仅被".D 标记的噬菌体侵染细菌$理论上离心后上清液应该没有放射性$沉淀物有很高的放射性#而实际上上清液有一定的放射性$沉淀物的放射性比理论值略低#上清液有放射性说明其中含有亲代噬菌体的GEF 链$其原因有两种可能'一是保温时间过短$有部分亲代噬菌体尚未侵染到大肠杆菌细胞内$经离心后其分布于上清液中(二是保温时间过长$噬菌体在细菌内完成增殖后$子代噬菌体从细菌内释放出来$经离心后其也分布于上清液中#由于G E F 的复制方式是半保留复制$亲代噬菌体的G E F 链保留在子代噬菌体的G E F 中$导致上清液有放射性#主要参考文献%%&朱正威$赵占良N .$$TN 生物.N 遗传与进化!教师教学用书"N 第.版N 北京'人民教育出版社$T#"*.T *生物学教学.$%&年!第1"卷"第1期。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术1985年，Smith G P第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。
另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。
1 噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。
所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
2 噬菌体展示系统2.1 单链丝状噬菌体展示系统（1）PⅢ展示系统。
丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。
每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。
其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。
PⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术第一篇：噬菌体展示技术介绍噬菌体作为一种针对细菌的病毒，与我们生活息息相关。
除了作为抗生素的发现者，噬菌体还可以被利用于噬菌体展示技术。
这种技术利用噬菌体表面展示的蛋白质，实现对目标蛋白质的快速筛选和鉴定。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、优缺点，以及在生命科学研究和工业生产中的应用。
一、原理噬菌体展示技术是将目的蛋白或肽插入噬菌体表面的一种方法。
噬菌体表面组分主要有三种：1）编码质粒的pIII蛋白质；2）编码细胞毒素E的pVIII蛋白质；3）编码专一结合的pV蛋白质。
它们在噬菌体的组成和结构上有不同的作用。
其中，pIII和pVIII蛋白质被广泛地应用于蛋白质展示，pV 蛋白质则被用于病毒特异性分离。
噬菌体展示技术的基本步骤为：首先，在噬菌体pIII或pVIII蛋白质基因的外侧区域中插入目的蛋白的DNA序列；然后使用这些噬菌体感染大肠杆菌。
噬菌体在感染过程中就会将目的蛋白展示在其表面。
最后，可使用具有亲和力的配体或抗体选择目的蛋白并纯化。
二、优缺点噬菌体展示技术的优点主要集中在以下几个方面：1）大容量：噬菌体可以在感染过程中表达众多的外表面蛋白，其中每个蛋白均可成为一个展示物，针对多种噬菌体展示技术。
2）直接鉴定：在已知多肽的情况下，可以使用特定的抗体直接鉴定噬菌体表面的展示蛋白。
3）高灵敏度：噬菌体展示技术对目标蛋白的识别灵敏，并且可以使用大量病毒颗粒进行检测。
4）高效率：噬菌体展示技术可将展示蛋白直接表达在噬菌体的表面，无需进行分离提纯，从而加快了蛋白纯化过程。
噬菌体展示技术的缺点主要有以下几方面：1）分子大小限制：目前仅适用于直径小于1/3噬菌体直径的蛋白分子。
2）生物安全：组装成噬菌体后，展示蛋白无法及时得到更新，可能会导致噬菌体的生物安全风险。
3）抗原性：由于目的蛋白常常被表达在噬菌体的表面，因此它们可能会被视为异物而引起免疫反应。
三、应用由于噬菌体表面蛋白质的展示，噬菌体展示技术已经被广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
噬菌体展示技术的原理和方法
噬菌体展示技术的原理和方法噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表面展示特定肽段或蛋白的技术。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已在许多领域显示出广阔的应用前景，包括药物研发、疫苗设计、蛋白质相互作用研究等。
本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理和方法，并探讨其优缺点和发展趋势。
噬菌体展示技术利用的是噬菌体的特性，噬菌体是一种病毒，专门感染细菌等微生物。
它们由蛋白质外壳和内部遗传物质组成，其中蛋白质外壳又由多个蛋白亚基组成。
噬菌体展示技术利用噬菌体表面展示特定的肽段或蛋白，这些肽段或蛋白可以来自天然蛋白质，也可以是人工合成的。
展示在噬菌体表面的这些肽段或蛋白能够与特异性受体结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示技术的关键之一是选择合适的展示载体。
载体通常是一种丝状噬菌体，其基因组可以容纳较小的外源基因片段。
常用的载体包括M filamentous phage等。
这些载体具有一些共同的特性，如对外源蛋白质的容纳能力较强，能在体内和体外环境中稳定存在等。
在噬菌体展示技术中，需要筛选出能感染特定细菌的噬菌体。
这些噬菌体可以是自生的，也可以是通过基因工程改造得到的。
在筛选过程中，可以利用不同细菌的特性，如受体类型、细胞壁结构等，来选择合适的噬菌体。
还需要考虑噬菌体的毒性、繁殖能力等因素。
在噬菌体展示过程中，需要反复感染以积累足够数量的展示肽段或蛋白。
这个过程中，通常需要使用超滤或凝胶过滤等手段对噬菌体进行纯化，以确保得到的展示肽段或蛋白的纯度和浓度。
反复感染的过程不仅可以增加展示肽段或蛋白的数量，还能帮助排除展示过程中可能产生的突变。
克隆选择是噬菌体展示技术的另一个关键步骤。
这个过程中，通过将展示肽段或蛋白与特定配体结合，筛选出能够与配体结合的克隆。
这些克隆可以进一步扩增和纯化，从而获得高亲和力和高特异性的克隆。
噬菌体展示技术的优点在于其能够将蛋白质或多肽特异性与噬菌体的生物学特性相结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示筛选抗体技术介绍
探索生物医学中的创新应用
目录
01 噬菌体展示筛选抗 体概述
06 噬菌体展示抗体的 发展前景
02 噬菌体展示技术原 理
03 噬菌体展示抗体筛 选流程
0Hale Waihona Puke 噬菌体展示抗体的 应用案例05 噬菌体展示抗体的 优点与缺点
01 噬菌体展示筛选抗体 概述
噬菌体展示筛选抗体概述
1 噬菌体展示筛选抗体技术介绍
疗效果并降低副作用。
05 噬菌体展示抗体的优 点与缺点
噬菌体展示抗体的优点与缺点
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术能够快速、 高效地筛选出特异性抗体， 大大缩短了实验周期，提高 了研究效率。
噬菌体展示抗体的局 限性
噬菌体展示技术虽然筛选速 度快，但存在假阳性率高的 问题，需要进一步的验证和 优化。
噬菌体展示筛选抗体技术是一种利用噬菌体表面
噬菌体展示筛选抗体的优势 2 展示特定蛋白质，通过生物淘选方法寻找与目标
噬菌体展示筛选抗体技术具有高度灵活性和多样
抗原特异性结合的抗体的方法。
性，能够快速、高效地筛选到具有高亲和力和特
异性的抗体，为免疫学研究和药物开发提供了重
要工具。 3 噬菌体展示筛选抗体的应用前景
噬菌体展示抗体的优 势
噬菌体展示技术具有高度灵 活性和多样性，可以快速、 大量地筛选出特异性强、亲 和力高的抗体，为生物医学 研究和药物开发提供了重要 工具。
噬菌体展示抗体的应 用前景
噬菌体展示抗体技术在肿瘤 治疗、免疫诊断、疫苗研发 等领域具有广泛应用前景， 有望为人类健康事业做出重 要贡献。
谢谢大家
噬菌体展示筛选抗体技术在疾病诊断、治疗和预
防等方面具有广泛的应用前景，包括癌症治疗、
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体载体复习题及答案.docx
噬菌体载体复习题及答案一、填空题1. 噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：①它 在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；②对某些噬菌 体(如入噬菌体)的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆 宿主系统的遗传研究的比较详尽。
2. 入噬菌体基因组DNA 为48.5 kb,根据入噬菌体的包装能力，其 包装DNA 限度为37〜51 kb,为其本身基因组的75〜105 %。
将野生 型入噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，如X ZAP II,该载体的 最小分子大小约为48.2kb,插入的外源片段最大不超过10. 2kb 。
构 建的入取代型载体XEMBL4,基因组大小为42. 36kb,填充DNA 片段为 14 kb,可容纳的外源DNA 分子最大为23 kb 。
3. 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是没有合适的 限制性内切核酸酶识别位点和选 择标记。
4. 黏粒(cosmid)是质粒一噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒,大的克隆片段达到45 kb o 8.野生型的入噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：① 分子 质量大；②酶的多切点；③无选择标记。
cmCOS 位点序列来自入噬菌体，9. M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：①SS-RF ；②RF-RF ；③ RF->SSo二、选择题（单选或多选）1.限制性内切核酸酶屁oR I在野生型的入噬菌体DNA中有5个切点，Hind III 有7 个切点，Banil I也有5个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过（A ）。
A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切2.pBluescript M13载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，下述四种功能中哪一种是不正确的？（D ）A. 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析B. 利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增C. 利用通用引物进行序列分析D.利用这两个启动子进行定点突变3. 下面关于细菌人工染色体（BAC）的特征描述，除了（C ）外都是正确的。
噬菌体展示技术PPT精选文档
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噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
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噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
噬菌体表面展示技术名词解释
噬菌体表面展示技术名词解释摘要：一、噬菌体表面展示技术简介二、噬菌体表面展示技术的应用三、噬菌体表面展示技术的优势四、噬菌体表面展示技术的操作步骤五、我国在噬菌体表面展示技术的研究进展六、未来发展展望正文：噬菌体表面展示技术是一种生物技术手段，通过将外源性蛋白质或其他生物大分子展示在噬菌体表面，实现对目标分子的筛选、检测和修饰等。
该技术在生物科学研究、药物开发和诊断领域具有广泛的应用价值。
一、噬菌体表面展示技术简介噬菌体表面展示技术利用噬菌体作为载体，将外源性蛋白质或其他生物大分子呈现在噬菌体表面。
这一过程通过基因重组技术实现，将外源基因插入噬菌体的基因组中，使噬菌体在感染宿主细胞时，表达并展示目标分子。
二、噬菌体表面展示技术的应用1.抗原表位筛选：噬菌体表面展示技术可用于筛选抗原表位，为疫苗研究和药物开发提供依据。
2.酶标仪检测：通过噬菌体表面展示技术，可将酶标记在噬菌体表面，实现对目标分子的酶标仪检测。
3.生物药物研发：利用噬菌体表面展示技术筛选具有特定功能的蛋白质，为生物药物的研发提供新靶点。
4.亲和层析：噬菌体表面展示技术可用于亲和层析，分离和纯化目标分子。
三、噬菌体表面展示技术的优势1.高效表达：噬菌体在感染宿主细胞时，可实现外源基因的高效表达。
2.易于筛选：噬菌体表面展示技术可通过菌落筛选、荧光检测等方法，快速筛选出具有特定功能的目标分子。
3.操作简便：实验过程相对简单，无需复杂的仪器设备。
四、噬菌体表面展示技术的操作步骤1.构建表达载体：将外源基因插入噬菌体的基因组中，实现目标分子在噬菌体表面的展示。
2.感染宿主细胞：将构建好的噬菌体感染宿主细胞，培养筛选出表达目标分子的细胞。
3.筛选和纯化：通过菌落筛选、荧光检测等方法，筛选出具有特定功能的目标分子，并对其进行纯化。
4.应用：将筛选出的目标分子应用于抗原表位筛选、生物药物研发等领域。
五、我国在噬菌体表面展示技术的研究进展我国在噬菌体表面展示技术领域取得了显著的研究成果，不仅在基础研究方面取得了突破，还为药物开发、疫苗研究等提供了有力支持。
噬菌体展示技术
噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
淘选过程中常见问题及解决方案
谢谢
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
噬菌体展示技术流程
噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
• 有供筛选的抗生素标记基因。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
pIII展示和pVIII，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
噬菌体展示技术常见问题与解答
噬菌体展示技术常见问题与解答1、在噬菌体展示技术的应用中，M13噬菌体与其他噬菌体比有什么优点？M13噬菌体和与其密切相关的丝状噬菌体fd和f1均为非裂解性噬菌体，它们在增殖期间均不裂解宿主菌。
这就极大地简化了每轮淘选过程之间的中间噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。
而其他用于噬菌体展示的噬菌体，如T7, T4和Lambda噬菌体，均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以避免淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白。
2、pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。
每个病毒子含５个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。
而对主要包膜蛋白pVIII来说，每个病毒子含～2700个拷贝之多，其中约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。
这样，以pIII融合子方式表达的多肽便是低价的（每个病毒子1~5个拷贝），而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200个拷贝）。
这种高价pVIII展示所增加的亲和力／性有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。
3、含与不含前导肽的pIII蛋白各有多大？未加工的包膜蛋白pIII（含前导肽序列但不含展示肽的pIII蛋白）的分子量为44651 Da。
不含前导肽序列的成熟pIII蛋白分子量为42579 Da。
然而，进行SDS-PAGE电泳时，pIII通常跑在分子量60-65 KDa附近，可能是因为该蛋白不同功能域之间含有特殊的甘氨酸富集的间隔区域。
前导肽的氨基酸序列是MKKLLFAIPLVVPFYSHS （注意起始甲硫氨酸Met是由密码子GTG编码的）。
4、文库克隆载体可以买到吗？用来构建所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE，是可以购买到的。
M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端构建了限制性酶切位点，用户可以将设计好的人工基因盒（synthetic cassette）插入此处构建自己的肽库。
关于噬菌体侵染细菌实验的一些问题
关于噬菌体侵染细菌实验的⼀些问题在讲解噬菌体侵染细菌实验的时候，师⽣往往⾯临着如下⼏个疑问，试解答如下：①在T2噬菌体侵染细菌实验中，经过短时间的保温后，⽤搅拌器搅拌，离⼼才会使混合溶液分层。
其中“短时间”有何意义？搅拌和离⼼的⽬的是为了将噬菌体蛋⽩质外壳同侵⼊⼤肠杆菌的噬菌体DNA分开，以便对放射性元素跟踪测试。
离⼼会使质量较轻的噬菌体颗粒进⼊上清液，⽽被感染的细菌则形成沉淀，但这必须保证是在菌体裂解之前进⾏。
噬菌体侵染细菌的速度很快，在37度的条件下⼤约40分钟就可以产⽣100到300个⼦代噬菌体。
从感染到释放前的这段时间叫潜伏期，⼤约经历20到30分钟。
短时间的保温可获得⾜够数量的⼦代噬菌体，但⼜必须避免超出潜伏期（确保溶液分层），所以离⼼要在“短时间”保温后及时进⾏。
②在赫尔希和蔡斯所做的噬菌体侵染细菌的实验中，在⽤35S标记的⼀组侵染实验,主要在上清液中检测到了放射性元素，那么沉淀物的少量放射性是如何产⽣的?⽽⽤32P标记的⼀组实验,却主要在试管的沉淀物中检测到了放射性同位素，那么上清液中的少量放射性⼜是如何产⽣的?第⼀个实验是把35S标记的噬菌体与细菌混合，吸附⼏分钟后，离⼼除去没有吸附上的噬菌体，收集沉淀（噬菌体—细菌混合物），将沉淀悬浮后再⼀次离⼼，收集上清液和沉淀，分别测定放射性活性，发现80%的放射活性存在于上清液中，沉淀中只有20%的放射活性，这是由于在在这期间⼤部分吸附的噬菌体已经将其DNA注⼊细菌⽽蛋⽩质外壳与细菌解离进⼊上清液，但仍然有少部分留在细菌细胞壁上，后来证明沉淀中的20%放射活性确实是由于尾丝与细菌表⾯结合太紧，以⾄于不容易把它除去。
⽤32P标记的噬菌体和细菌混合，⽤上述⽅法同样处理后实验结果差别很⼤，70%的放射活性在沉淀⾥，⽽30%的放射活性在上清液⾥。
在上清液的30%的放射活性可能是由于搅拌细菌时破裂产⽣的。
（⼏年后发现有些缺损噬菌体粒⼦不能将其DNA注⼊到细菌中去）。
噬菌体展示技术
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
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第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合旳噬菌体
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第四步：洗脱—将特异性结合旳噬菌体洗脱下来
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第五步：扩增—将洗脱旳噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
背面旳筛选逐渐加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合旳克隆序列
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及处理方案
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什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证明外源DNA能够插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
• 有供筛选旳抗生素标识基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要旳全部蛋白和酶。
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筛选旳措施－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简朴直接。 缺陷：偶尔会造成配体结合位点难以进入 可能是因为分子旳立体封阻 或者是靶分子表面旳部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。 优点：克服直接包被旳出现旳问题 缺陷：轻易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合旳克隆。
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谢谢
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6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 构成，5个拷贝，位于噬菌 体旳尾部。
2. 由三个功能区构成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
噬菌体疗法行业行业痛点与解决措施ppt
噬菌体疗法行业的监管和政策环境
1 2
监管法规的缺失
噬菌体疗法缺乏明确的监管法规和标准，难以 合法进入市场。
临床试验的挑战
噬菌体疗法的临床试验缺乏规范和标准，难以 评估其有效性和安全性。
3
知识产权的保护
噬菌体疗法的知识产权保护不足，难以鼓励创 新和知识产权的投入。
噬菌体疗法的重要性及应用领域
噬菌体疗法对治疗严重和耐药 细菌感染具有重要意义。
噬菌体疗法应用于多种领域， 如皮肤感染、口腔感染、肺部
感染等。
噬菌体疗法对解决抗生素耐药 性问题具有独特优势。
行业现状及痛点分析
尽管噬菌体疗法具有诸多优势，但该行业仍存在 一些痛点。
噬菌体疗法产品的生产工艺复杂，且难以实现工 业化生产。
噬菌体疗法行业行业痛点与解决措 施
xx年xx月xx日
目录
• 引言 • 行业痛点 • 解决措施 • 结论
பைடு நூலகம்1
引言
噬菌体疗法的定义与特点
噬菌体疗法是指利用噬菌体裂解细菌，从而治疗 由细菌感染引起的疾病。
噬菌体具有高度特异性，能够裂解特定细菌，对 其他细菌无影响。
噬菌体疗法具有天然抗生素无法比拟的优势，可 克服细菌耐药性。
完善产业链
加快噬菌体疗法产业链的发展，形成完整的产业链条，促进各环节的协同创新和优化。
加强政策支持和监管，推动行业发展
政策支持
政府应加大对噬菌体疗法的支持力度，制定相应的政策措施，如税收优惠、财政 补贴等，促进行业发展。
监管加强
建立健全噬菌体疗法的监管体系，严格行业标准，确保产品的安全性和有效性。
噬菌体疗法技术不断 创新
噬菌体展示技术的局限性
噬菌体展示技术的局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。
目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。
（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。
例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。
另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是体内选择压力的一个例子。
真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故[15]。
（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。
（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
观察大肠杆菌噬菌体示意图并回答问...
观察⼤肠杆菌噬菌体⽰意图并回答问题
（1）病毒的结构简单，没有细胞结构，由
外壳和内部的
组成．
（2）病毒不能独⽴⽣活，只能寄⽣在
⾥，靠⾃⼰的遗传信息，利⽤寄主细胞内的物质，制造新病毒，这就是它的
⽅式．病毒⼀旦离开寄主细胞，
通常会变成
．
考点：病毒的形态结构及⽣命活动特点
专题：
分析：⼤肠杆菌噬菌体是寄⽣在⼤肠杆菌细胞内的⼀种病毒，属于细菌病毒，病毒是形体⼗分微⼩的⽣物，形体⽐细胞⼩得多，据此解答．
解答：解：（1）病毒的结构简单，没有细胞结构，由蛋⽩质外壳和内部的遗传物质组成．
（2）病毒不能独⽴⽣活，只能寄⽣在活细胞⾥，靠⾃⼰的遗传信息，利⽤寄主细胞内的物质，制造新病毒，这就是它的⽣殖⽅式．病毒⼀旦离开寄主细胞，通常会变成结晶体．
故答案为：（1）蛋⽩质；遗传物质
（2）活细胞；⽣殖；结晶体
点评：掌握病毒的形态和结构特点是解题的关键．。
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噬菌体展示技术常见问题与解答
1、在噬菌体展示技术的应用中，M13噬菌体与其他噬菌体比有什么优点？
M13噬菌体和与其密切相关的丝状噬菌体fd和f1均为非裂解性噬菌体，它们在增殖期间均不裂解宿主菌。
这就极大地简化了每轮淘选过程之间的中间噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。
而其他用于噬菌体展示的噬菌体，如T7, T4和Lambda噬菌体，均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以避免淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白。
2、pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?
丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。
每个病毒子含５个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。
而对主要包膜蛋白pVIII来说，每个病毒子含～2700个拷贝之多，其中约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。
这样，以pIII融合子方式表达的多肽便是低价的（每个病毒子1~5个拷贝），而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200个拷贝）。
这种高价pVIII展示所增加的亲和力／性有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。
3、含与不含前导肽的pIII蛋白各有多大？
未加工的包膜蛋白pIII（含前导肽序列但不含展示肽的pIII蛋白）的分子量为44651 Da。
不含前导肽序列的成熟pIII蛋白分子量为42579 Da。
然而，进行SDS-PAGE电泳时，pIII通常跑在分子量60-65 KDa附近，可能是因为该蛋白不同功能域之间含有特殊的甘氨酸富集的间隔区域。
前导肽的氨基酸序列是MKKLLFAIPLVVPFYSHS （注意起始甲硫氨酸Met是由密码子GTG编码的）。
4、文库克隆载体可以买到吗？
用来构建所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE，是可以购买到的。
M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端构建了限制性酶切位点，用户可以将设计好的人工基因盒（synthetic cassette）插入此处构建自己的肽库。
因为M13KE 是噬菌体，而不是噬菌粒载体，所以在已加工病毒子上的所有5个拷贝的pIII蛋白均携带有展示肽序列。
另外，大于20-30个残基的展示多肽会影响噬菌体的感染力，所以此载体仅适合展示短的多肽，而不能展示大的蛋白分子或cDNA文库。
5、有anti-M13的抗体吗?
市面上有抗-M13的抗体，抗-M13的抗体为多克隆抗体，主要识别pVIII抗原。
6、可以对文库进行扩增以便多做几轮淘选试验吗?
强烈建议不要对产品中所提供的原始文库进行扩增。
因为体内序列偏性现象很可能导致某些序列在扩增后的文库中所占比例大大降低，甚至完全缺失。
所提供的文库都是在连接后仅扩增了一次，文库所有的特征（代表性的测序数据，淘选数据等）都是在扩增销售贮存液的基础上进行的，一旦进行再扩增，我们便不能保证每种文库中所报道的氨基酸分布数据依然成立。