微生物基础

☆抗酸染色法 ☆ ☆荚膜染色法
革兰染色
原理 : 检查细菌细胞壁的渗透性
单层厚肽聚糖细胞壁
不紧密外壁层(透乙醇)+ 薄内壁层肽聚糖
革兰氏阳性
革兰氏阴性
革兰染色液
- 染色前，所有细胞是透明的
G()
G()
步骤
- 结晶紫着色後用碘增加染料与菌 体结合
- 乙醇从G() 菌体洗脱结晶紫
- 用番红液复染，革兰氏阴性菌 呈粉红色，革兰氏阳性菌呈兰 紫色
饮料常见菌
饮料的理化环境 饮料中含有不等量的有机酸，因此pH较
低，一般在2.4（柠檬汁）；～4.2（番茄 汁） 饮料中含有较高的糖份，浓缩果汁的糖 度高达60~70度
饮料常见菌
酵母菌 霉菌 极少数的细菌
饮料常见菌
乳杆菌属Lactobacillus（利用葡萄糖，代 谢产生乳酸）
明串珠菌属Leuconostoc（利用蔗糖，代 谢产生葡聚糖或丁二酮）
细菌的营养类型
▪ 自营菌：能以简单的无机物为原料，合成
复杂的菌体原生质。
▪ 异营菌：必须供给多种有机物质，才能合
成菌体原生质。所有的病原菌都是异营菌。
细菌的营养物质与机理
▪ 营养物质：
水、无机盐、碳源、氮源、某些气体和生长因子等
▪ 营养机理：
主要靠细胞膜以及细胞壁的选择性渗透作用来 完成从外环境吸收所需的营养物质，以及排泄 体内代谢废物。细菌不能直接利用不溶解的物 质，它必须通过酶的水解，成为水溶性的小分 子物质后，才能透过细胞膜而被利用
包括：
一群菌而非只有大肠杆菌，包含4个菌属（艾希菌属-大肠杆菌、 柠檬酸杆菌属-弗劳地柠檬酸杆菌、克雷伯菌属-肺炎克雷伯菌、 肠杆菌属-阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）
意义：
大肠菌群中的各类菌主要来源于人畜粪便，可代表粪便污染的情 况，推断有无肠道致病菌污染的可能
大肠菌群的分布情况
人及温血动物肠道：大肠杆菌4*108个/g粪便 外环境：其它3类菌比例上升 大肠菌群的存在与人类活动密切相关： 人迹罕见的高山环境少 随人类活动而渐多
• 形态与排列：
• 球菌、杆菌、螺形菌
细菌的基本分类
• 界、门、纲、目、科、属、种（亚型或生物型） •《伯杰氏细菌鉴定手册》根据原核细胞型微生物的形态、营 养型等将其分为19类，其中细菌可：
（1）根据细菌形态分：球菌、杆菌、球杆菌、弧菌、螺旋菌等 （2）根据细菌细胞壁结构分：革兰阳性、革兰阴性 （3）根据细菌的呼吸过程分：需氧菌、厌氧菌、微需氧菌和兼性厌氧菌 （4）根据细菌的特殊结构分：如有无芽胞；有无鞭毛、荚膜
微生物基础
微生物的分类
微生物
非细胞型微生物
原核细胞型微生物 真核细胞型微生物?
病毒 细菌 衣原体立克次体支原体螺旋体 放线体 真菌
细菌的结构
细胞膜 荚膜
异染质粒 细胞壁 细胞质 中介体
菌毛 核质
鞭毛
细菌的大小与形态
• 大小：
• 以微米为单位。同一种菌的大小会因 不同情况而变，如：死的比活的缩小 1/3，幼龄的比老的大几倍
↓
6.
全面鉴定
形态学检查
▪ 形态结构：微生物的形态结构观察主要是通 过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列 方式、细胞结构及染色特性进行观察
▪ 培养特性：不同微生物在某种培养基中生长 繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同 一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一 定稳定性
镜检
显微镜
普通显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜
细菌的综合分类与鉴定（1）
革兰氏阳性菌
球菌
杆菌
球形成堆或四联
源自文库
椭圆形成链
棒状、栅栏状
葡萄球菌属 …… 链球菌属 …… 李司特菌属 分枝杆菌属 丹毒丝菌 ……
GPI API STAPH
GPI API STREP
GPI GEN-PROBE APICORYNE API Listeria
丝状
粗大，有芽孢
…… 芽孢杆菌属 芽孢梭菌属
粪便污染指标菌（3）
肠球菌：
人肠道中2*108个/g粪便，低于大肠杆菌,畜中更 高(高于大肠杆菌)
可判断污染来源：
粪大肠菌群与肠球菌比例高于4，污染主要来源于人类 粪便，小于0.7污染主要来源于畜粪便,介于两者之间为 混合污染
粪便污染指标菌（4）
产气荚膜梭菌:
人与动物肠道中106个/g粪便 厌氧、对各种消毒剂和外界不良环境抵抗力强 在外环境中存活时间长 样品陈旧性污染的指标：大肠菌群低、产气荚膜梭菌
▪无机盐：参与构成菌体成分；调节细胞内外渗透压；与酶活性有关。
其中P、K、Na、Mg、S、Fe需要量较多；Cl、Mn、Zn、Co、Cu等只 需微量生长因子
▪生长因子：许多细菌的生长还必需一些其自身不能合成的生长因子，
主要是B族维生素（硫胺素VB1、核黄素VB2、泛酸VB3、吡哆素VB6、 烟酸VB5、对氨基苯甲酸PABA）和某些氨基酸、嘌呤、嘧啶等
微生物检测流程
一、卫生微生物检验
卫生微生物学检验方法、标准
制定检验方法、标准的意义和原则：
判断水、空气、食品、日用品及各类公共场所的卫生 状况
直接检测病原菌的难度：数量少、种类多、生物学性 状各异
只有寻找具指标性的微生物来代表
指标性微生物选择的原则
环境中大量存在 易于检验 易于检出 具有广泛的代表性 根据此指标的检出情况，可判断样品被污
API50CHB API20A
细菌的综合分类与鉴定（2）
球菌
奈瑟氏菌属
……
NHI API NH
肠杆菌科
革兰氏阴性菌
杆菌
大小一致，杆状
弯曲、弧状
……
假单胞菌属
气单胞菌属
……
弧菌属
弯曲菌属
GNI API 20E
GNI API 20NE
GNI API 20NE
GNI
API Campy
API 20E/API 20NE
细菌的营养物质
▪水： 细菌代谢过程中的一切反应都必须有水才能进行。培养基用水应
为纯水（蒸馏水、去离子水），电导率→ 0
▪碳源： 碳源是细菌合成菌体成分和获得能量的主要来源。培养基碳源
的供应主要来自糖类、有机酸、醇类等
▪氮源：提供合成菌体原生质和其它结构成分的原料。培养基中氮源主要
来自蛋白胨、氨基酸以及动、植物组织浸出液
葡萄汁中主要有柠檬形克勒克氏酵母、葡萄酒 酵母、卵形酵母和路氏酵母等；
浓缩果汁中生长的是一些耐高渗透压的酵母菌： 路氏酵母、蜂蜜酵母等。
假丝酵母属
分类学：半知菌亚门－芽胞菌纲－隐球 酵母目－隐球酵母科－假丝酵母属
广泛分布于土壤、空气、水、人和动物 皮肤表面、指甲、毛发中。
麦芽琼脂培养基上菌落为乳白色，有光 泽，质地柔软，平滑，边缘整齐有明显 菌丝。
链球菌属
该属中的许多种为共栖菌和寄生菌，常 见于人和动物的口腔、上呼吸道和肠道 等处。
细胞成对地链状排列；接触酶阴性；革 兰氏阳性；兼性厌氧菌；无芽胞；产乳 酸；不产气；最适温度37℃。
明串珠菌属
人和动物的毛发、皮肤表面、土壤等 无芽胞；动力阴性；接触酶阴性；革兰
氏阳性；兼性厌氧；最适温度20～30℃
产生的只有多黏菌素、杆菌肽
▪细菌素：转一性，蛋白质 ▪维生素：细菌合成，如Vit K
细菌的致病作用
细菌的致病作用是否发生与3要素： 毒力、侵入数量、侵入部位有关
毒力：毒素、侵袭力 ▪毒素：来源、理化性质、作用分成内毒 素（ G-产生）、外毒素（ G+产生）2类 ▪侵袭力：突破机体屏障、在体内定居、 繁殖、扩散的能力，菌毛、侵袭性酶
细菌的能量来源
细菌获能主要是通过生物氧化作用，包括需氧呼吸 与发酵，此两种获能方式将细菌分成4类：
▪专性需氧菌：有完善呼吸酶系统，需利用分子氧作为最后受 氢体以完成呼吸作用，无游离氧不长，霍乱弧菌、结核杆菌 ▪微需氧菌：低氧压生长最好，氧压上升则有抑制作用，空肠 弯曲菌 ▪兼性厌氧菌：兼有需氧呼吸与发酵功能，无论有氧无氧皆长， 但以有氧时生长好，绝大多数病原菌 ▪专性厌氧菌：缺乏完善呼吸酶系统，只能在无氧下发酵，有 游离氧不长，破伤风梭菌、脆弱类杆菌
革兰（Gram）染色法
染色液
第一液：结晶紫色液（初染剂） 第二液：卢戈（Lugol）氏液（固定剂） 第三液（退色剂）：纯酒精 第四液（复染液）：一般用10倍稀释萋尔氏复红液
包含：
需氧或兼性厌氧、嗜中温、能在普通营养琼脂培养基 上生长的一群细菌
缺陷：
低于样品中的实际活菌数、不表明污染菌种类
菌落总数的检测与报告
检测方法： 倾注法、表面涂布法、表面点滴法 检验报告： 选取菌落数在30～300的稀释度 报告为菌落形成单位cfu 不宜报告为细菌总数
霉菌和酵母菌数
链球菌属Streptococcus（利用葡萄糖、 果糖、乳糖和蔗糖，产生乳酸）
梭菌属Clostridium（利用糖类，产生乙 酸）
乳杆菌属
常见生长环境：人类以及动物的口腔、 消化道和阴道的正常菌群，对人以及动 物无病原性。
革兰氏阳性；且两极着色；耐氧或微需 氧；生长温度2~53℃；最适温度30～ 40℃；最适pH5.5～6.2。
定义： 单位重量、容积、表面积、体积的样品
在28 ℃有氧条件下经48小时，采用孟加 拉红培养基培养后记数得到的菌落 检测方法： 倾注法 检验报告： 选取菌落数在30～100的稀释度
粪便污染指标菌（1）
大肠菌群：
一群在37 ℃、24小时内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的 革兰阴性无芽胞杆菌
量高，表明陈旧性污染
特定环境不能检出的指标菌
金黄色葡萄球菌：食品、外用药品、化妆品、游泳池 水、浴室毛巾等
铜绿色假单胞菌：外科创伤用药、眼科用药、化妆品、 游泳池水等
沙门菌：食品、口服用药 志贺菌：食品 链球菌：室内空气污染、食品 消毒效果测定：嗜热脂肪芽胞菌（高压蒸汽灭菌）、
短小芽胞菌（辐射灭菌）、枯草芽胞菌黑色变种（环 氧乙烷消毒）
染程度 间接指示有无病原微生物的存在
指标性微生物的类型
评价样品的一般卫生质量、污染程度及安全性： 菌落总数、霉菌和酵母菌数 粪便污染的情况： 大肠菌群、粪大肠菌群、肠球菌、产气荚膜梭菌 特定环境不能检出的微生物 金葡菌、绿脓杆菌、溶链菌、芽胞菌
菌落总数
定义：
单位重量、容积、表面积、体积的样品在37 ℃有氧条 件下经48小时，采用营养琼脂培养基培养后记数得到 的菌落数
饮料中的霉菌
主要有青霉属：如扩展青霉、皮壳青霉 其次是曲霉属，如构巢曲霉、烟曲霉等，
其他还有丝衣霉属、似青霉属等。
微生物检测流程
二、致病性细菌检验
致病性细菌检验流程
1.
样品采集
↓
2.
初步检验→ 直接镜检(涂片→染色→镜检)
↓
3.
分离培养 (包括增菌培养和直接平板培养)
↓
4.
初筛试验
↓
5.
纯培养
▪ 温度：细菌生长的温度极限为-7～90℃。病原菌最 适生长温度为人体温度37℃±2℃
▪ 氧气：需氧菌利用分子氧作为最后受氢体以完成呼 吸作用。厌氧菌则在无氧环境中才能生长
细菌的代谢产物
▪生化代谢：各种生化鉴定的基础 ▪热源质：G-产生，内毒素，LPS ▪毒素、侵袭性酶：细菌的毒力 ▪色素：绿脓素、金葡菌色素 ▪抗生素：大多由放线菌、真菌产生，细菌
粪便污染指标菌（2）
粪大肠菌群：
人畜肠道内的大肠菌群已适应37 ℃ ～45 ℃的环境， 而自然界中的大肠菌群只适应37 ℃ 的较低环境，故可 将培养温度升高至44 ℃以此来区分大肠菌群的来源， 能在44 ℃生长的大肠菌群应来源于人畜粪便的污染， 称为粪大肠菌群
总大肠菌群：
37 ℃生长的大肠菌群应来源于人畜粪便的污染和外环 境污染的总和，称为总大肠菌群（一般情况下简称大肠 菌群）
梭状芽胞杆菌
广泛存在于土壤、下水道内、人以及哺 乳动物的肠道内。
有鞭毛；革兰氏阳性；严格厌氧；有些 为微需氧；接触酶阴性；产生H2S
饮料中的酵母菌
苹果汁中主要有假丝酵母属、圆酵母属、隐球 酵母属、红酵母属和汉遜氏酵母属；
柑橘汁中常有葡萄酒酵母、越南酵母以及圆酵 母属和酺酵母属中的一些种；
细菌的生长繁殖
3要素：
细菌在原料、能量、环境三要素都适宜时进行正常 生长繁殖
4周期：
迟缓期、对数生长期、稳定期、衰亡期
影响细菌生长的环境因素
▪ pH值：大多数细菌生长最适酸碱度为中性或弱碱性， 即pH 7.2～7.6。但有些细菌例外，如霍乱弧菌在 pH 8.4～9.2生长佳；乳酸菌在pH 5.5时生长最好
镜检形态学
不染色标本的检查法：主要用于检查细菌的动力及
运动状况。有鞭毛的细菌在显微镜下呈现活泼的动力
染色标本的检查法：用形状、大小、排列、染色特
性及荚膜、鞭毛、芽胞、异染颗粒等结构。有助于对细 菌的初步识别或确定诊断
☆单染色法
☆革兰染色法
异染颗粒染色法 ☆ 鞭毛染色法
☆ 芽胞染色法 ☆负染色法