图文讲解如何在PCR仪上设置退火温度梯度
图文讲解如何在PCR仪上设置退火温度梯度
图文讲解如何在 PCR仪上设置退火温度梯度
TProfessional热循环仪（红色PCR仪）如何设置退火温度梯度
设定梯度 ①设定梯度最简单的方法是输入模块的两端温度(左边或者移动光标到下一个 位置。
②另外一种做法是移动光标到设定温度的位置并且按软键[Gradient] 在梯度的界面上您可以输入一个新的梯度或者编辑现有的梯度。在01行(左边)和第12行(右边)输入新的设定值，并且按[Enter] 确认。 要回到表格模式，按软键[Table]。
PCR仪缓慢降温怎么设置
PCR仪缓慢降温怎么设置什么是PCR仪？PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的基因分析技术，它能够在体外复制DNA片段，并通过温度的周期性变化来引发DNA的复制。
PCR技术在生物学和医学领域有着广泛的应用，对于研究基因组学和分子生物学等领域非常重要。
PCR仪是进行PCR技术的关键设备，它通过控制温度变化来实现DNA的复制过程。
PCR仪内部配备了一个热盖，能够提供恒定的温度环境，同时也能确保反应混合物的蒸发。
PCR过程中的缓慢降温PCR技术通常包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
其中，在退火步骤中的缓慢降温对于PCR反应的成功至关重要。
在退火过程中，引物结合到目标DNA序列上，启动DNA链的合成。
缓慢降温可以提高引物与目标序列的特异性结合，减少非特异性杂交的可能性。
缓慢降温的设置可以通过PCR仪的温度程序控制来完成。
下面是一个常见的缓慢降温设置方案：1.将PCR仪的温度设置为目标DNA序列退火温度的5°C。
2.将PCR反应体系放入PCR仪中。
3.启动PCR仪的程序，让温度从初始变性温度快速升高到95°C，进行变性步骤。
4.当温度达到95°C时，缓慢降低温度至目标退火温度的5°C，保持一段时间。
5.在缓慢降温阶段，引物与目标DNA序列结合。
6.缓慢降温时间结束后，提高温度至延伸步骤所需的温度。
7.完成PCR反应。
缓慢降温的重要性为什么缓慢降温在PCR技术中如此重要呢？这是因为在缓慢降温的过程中，引物与目标DNA序列结合的特异性增强。
这是由于在较低温度下进行退火，引物需要更长的时间和更低的温度来正确结合到目标序列上，从而减少了非特异性杂交的可能性。
此外，缓慢降温还有助于避免产生二聚体和伪二聚体等不良反应，这些反应可能会降低PCR反应的特异性和产量。
总结PCR仪的缓慢降温设置对于PCR反应的成功至关重要。
通过合理设置PCR仪的温度程序，可以在退火步骤中提高引物与目标DNA序列结合的特异性。
梯度退火pcr程序
梯度退火pcr程序
梯度退火PCR程序是一种常用的PCR技术，它可以在一定程度上提高PCR反应的特异性和灵敏度。
本文将介绍梯度退火PCR程序的原理、步骤和优缺点。
梯度退火PCR程序的原理是利用不同温度下引物的特异性，通过逐渐降低退火温度来筛选出最适合引物的温度。
在PCR反应中，引物的特异性是非常重要的，如果引物与非目标序列结合，会导致PCR产物的非特异性扩增，从而影响PCR反应的结果。
因此，通过梯度退火PCR程序可以有效地提高PCR反应的特异性。
梯度退火PCR程序的步骤如下：
1. 设计引物：根据目标序列设计引物，确保引物的特异性和合适的长度。
2. 准备PCR反应体系：将引物、模板DNA、Taq聚合酶和PCR反应缓冲液混合，制备PCR反应体系。
3. 设置PCR反应条件：设置PCR反应的温度和时间，包括退火温度、延伸温度和退火时间等。
4. 进行PCR反应：将PCR反应体系放入PCR仪中进行PCR反应。
5. 分析PCR产物：通过凝胶电泳等方法分析PCR产物，确定最适合引物的温度。
梯度退火PCR程序的优点是可以提高PCR反应的特异性和灵敏度，同时可以减少PCR反应的非特异性扩增。
缺点是需要进行多次PCR 反应，耗时较长，同时需要进行PCR产物的分析，增加了实验的难度。
梯度退火PCR程序是一种常用的PCR技术，可以提高PCR反应的特异性和灵敏度，但需要进行多次PCR反应和PCR产物的分析，实验难度较大。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的PCR技术。
PCR仪操作说明2（thermalcyclerc1000touch）
PCR仪操作说明2（thermalcyclerc1000touch）C1000 Touch操作指南一、传统法编辑新程序1、打开电源开关，等待自检结束；2、按New Protocol按钮；3、在温度曲线上进行编辑温度、时间和循环次数。
例如将95℃改为94℃: 按95℃按钮，在弹出的界面直接输入94，按OK就可以了。
时间和循环次数的修改方法相同。
4、删除步骤：选中需要删除的步骤，按Delete就删除该步骤。
5、插入步骤：选中将要插入步骤的前一步骤，按Insert，在弹出界面选择Temperature（温度）或Gradient（温度梯度）或Goto（循环┄）。
具体的温度、时间和循环次数输入方法同前述。
6、如果要做梯度PCR、Long PCR或Touchdown，请先选中退火温度步骤，按Options选项，然后选中相应项并输入数值并按OK 即可。
Gradient（梯度）、Increment（Touchdown温度变量）、Extend（Long PCR时间变量）。
7、按Save保存程序。
可以在该界面按New Folder新建自己的文件夹。
在File Name处输入文件名，按OK。
按Save即可。
二、运行程序1、在主界面按Saved Files；2、在Folders下选中相应的文件夹；3、在Files下选中将要运行的程序；4、按Run；5、输入反应体系；然后按OK，就开始运行程序。
三、停止程序运行1、如果中途要停止正在运行的程序，请按Cancel；2、在弹出的确认界面按Yes；四、注意事项1、开盖前必须逆时针方向旋松旋钮，然后向上抬起把手就开盖了；2、PCR管放好后，盖下热盖。
轻轻顺时针方向旋转旋钮，当刚好感觉到有PCR管阻力时，再顺时针方向最多旋转90度就可以了。
不能过度拧紧。
3、如果保温时间为∞或保温时间没有结束，千万不要强行关闭电源。
应该按照上述步骤四停止程序运行，至少2分钟后再关闭电源开关。
4、反应模块的底孔有脏物后，应该及时用无水乙醇清洁。
pcr仪梯度降温
pcr仪梯度降温PCR（聚合酶链反应）是一项广泛应用于生物学和医学研究的技术，以放大特定DNA片段为目的。
而pcr仪梯度降温技术则是pcr反应中的一项重要创新，它可以更好地控制反应的温度变化，提高反应的特异性和效率。
1. 什么是PCRPCR（聚合酶链反应）是一种在体外扩增特定DNA片段的技术，它是由一种酶（聚合酶）在不同温度条件下扩增DNA链的能力而得名。
PCR反应通常需要三个基本组分：DNA模板，引物和聚合酶。
2. PCR温度变化的重要性PCR反应需要在不同的温度条件下进行，包括变性、退火和延伸的阶段。
变性阶段用于分离DNA双链，将其转变为两条单链DNA。
退火阶段用于引物与目标DNA序列的互补结合，从而形成引物模板复合物。
延伸阶段则是在合成DNA链的过程中，聚合酶利用引物复合物作为起始点，并合成互补链。
准确的温度控制对于PCR反应的成功至关重要。
过高或过低的温度会影响引物的结合、DNA的分离和DNA链的延伸，从而影响PCR的效果。
因此，精确调控温度是PCR 反应中的一项重要挑战。
3. PCR仪梯度降温技术的原理PCR仪梯度降温技术是为了解决温度控制问题而被引入的一种技术创新。
它通过在PCR反应过程中在不同的反应管中设置不同的温度，来模拟不同温度条件下的反应。
PCR仪梯度降温技术的核心是在PCR仪的加热平台上设置不同位置的温度。
通过这种方式，可以在PCR反应中模拟不同的温度梯度。
通常，温度梯度可以从一个高温到一个低温，或者从一个低温到一个高温。
4. PCR仪梯度降温技术的优势PCR仪梯度降温技术的主要优势是可以同时进行多个温度条件下的PCR反应。
这使得研究人员可以在一次实验中测试不同的引物和反应条件，从而更好地优化PCR反应的特异性和效率。
另外，PCR仪梯度降温技术还可以用于确定最佳引物的退火温度。
通过设置不同位置的温度梯度，在不同温度条件下进行PCR反应，可以确定引物与目标DNA序列最佳结合的温度。
PCR温度梯度怎么设计
PCR温度梯度怎么设计概述聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术，可在体外复制和扩增DNA序列。
PCR的核心是通过控制反应体系中的温度，在不同阶段调节DNA的变性、退火和延伸，以实现DNA扩增。
在PCR实验中，PCR温度梯度实际上是温度区间的设定，使DNA的变性和退火的温度在每一轮反应中逐渐变化。
合理设计PCR温度梯度可以提高PCR反应的效率和特异性，同时还可以优化特定目标序列的扩增。
温度梯度设计原则合理设计PCR温度梯度需要考虑以下几个方面：目标序列长度PCR温度梯度的设计应基于目标序列的长度。
一般而言，较短的目标序列对温度的变化更敏感，而较长的目标序列则需要更高的变性温度和较长的延伸时间。
因此，在设计PCR温度梯度时，需要根据目标序列的长度来选择合适的温度范围和变化步长。
引物的退火温度引物的退火温度是PCR温度梯度设计中的关键因素之一。
引物退火温度应尽量接近目标序列的局部退火温度，以确保引物和目标序列在每一轮反应中能够准确结合。
一般而言，引物的退火温度可以通过计算引物序列的化学组成和熔解温度来确定。
延伸温度延伸温度取决于使用的DNA聚合酶的最佳工作温度。
聚合酶的最佳工作温度是每种聚合酶都有的最适合其活性的温度范围。
延伸温度过低会导致延伸速率缓慢，温度过高则可能导致脱氧核糖核酸（DNA）链的循环变性。
因此，选取延伸温度时需要根据所使用的聚合酶来确定。
变性温度变性温度是指PCR反应中DNA的变性过程。
在变性过程中，DNA的双链结构会在高温下解开，形成两条单链DNA。
变性温度取决于目标序列的GC含量、长度和硬碱基配对的稳定性。
一个合理的变性温度可以确保DNA在每一轮PCR反应中都能充分解开。
温度梯度设计步骤根据以上原则，可以按照以下步骤设计PCR温度梯度：步骤一：确定目标序列的长度和GC含量通过测定目标序列的长度和计算GC含量，可以为后续的温度梯度设计提供基本的参考信息。
步骤二：计算引物的退火温度根据引物序列的化学组成和熔解温度计算公式，计算引物的退火温度。
梯度PCR仪标准操作程序
梯度PCR仪标准操作程序
ABI 9902 Veriti TM 96-well thermal cycler 梯度PCR仪标准操作程序
1.使用前打开电源，预热20分钟。
2.待机器自检完成后，进入主界面。
3.点击“Browse/New Methods”按键，进入试验程序设置。
4.可在下面列表单中选择最近用户保存的试验程序，然后点击
“View/Edit”，进行编辑使用；也可直接点击“New”按键，进行新的试验程序设置。
5.点击“Add”“Delete”按键，可增删试验步骤。
6.点击“Save”按键可保存当前试验程序，方便下次试验使用。
7.待所有试验程序设置完毕后，打开热盖，加入样品，应尽量使样
品集中在样品槽中央部位，点击“Run”按键，进入试验状态。
8.试验完成后，取出样品，关闭电源。
PCR怎么设置梯度降温
PCR怎么设置梯度降温什么是PCR？PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，用于扩增DNA 片段。
通过PCR，我们可以在体外快速制备出目标DNA的大量复制品。
PCR的基本原理PCR的基本原理是通过反复进行DNA的复制，最终获得大量目标DNA片段。
PCR 反应中需要三种主要的组分：模板DNA、引物和聚合酶。
引物是短的DNA片段，能够与目标DNA序列的两端特异性结合。
聚合酶是一种能够在合适的温度下催化DNA链延伸的酶。
在PCR反应中，通过合适的温度控制，DNA的双链会在解链温度下分离，然后引物结合，聚合酶进行复制，最终得到复制的DNA片段。
PCR反应中的温度PCR反应通常需要设定不同的温度，以完成DNA的解链、引物结合和DNA合成的步骤。
其中一种常用的温度控制方法是梯度降温。
梯度降温的原理梯度降温是指在PCR反应中控制温度发生变化，分别在不同的温度下进行DNA解链和DNA合成。
通过这种温度梯度，可以在一次PCR实验中测试多个反应温度，以确定最适合目标DNA扩增的温度。
如何设置梯度降温要设置梯度降温，首先需要选择一个合适数量的PCR反应管。
每个PCR管中的反应体积相同，但温度是逐渐变化的。
实验中常用的PCR仪可以设定温度梯度的上下界限。
其次，选择适当的温度范围。
根据目标DNA的序列和长度，可以选择一个合适的温度范围。
通常，解链温度的上限应高于引物的Tm（配对温度），而下限应低于引物的Tm。
然后，在PCR仪中设置温度梯度。
引物结合温度和延伸温度被设置在不同的温度区域。
这样，在PCR过程中，不同PCR管内的温度会不断发生变化。
在设置好温度梯度后，将PCR反应混合液分配到各个PCR管中，并在PCR仪中进行扩增。
梯度降温的优势使用梯度降温的PCR方法可以快速确定最佳的反应温度，从而提高PCR反应的特异性和效率。
相比传统的固定温度PCR，梯度降温可以在一个PCR实验中测试多个温度，节约时间和成本。
梯度退火pcr程序
梯度退火pcr程序梯度退火PCR程序是一种常用的聚合酶链反应（PCR）优化方法，它能够在PCR反应中找到最佳的温度条件，以提高反应的效率和特异性。
本文将从梯度退火PCR程序的原理、步骤和优点等方面进行介绍。
我们先来了解一下PCR反应的基本原理。
PCR反应是一种体外扩增DNA序列的技术，它可以在短时间内大量复制目标DNA片段。
PCR 反应的核心是DNA的两股链的分离和扩增，这个过程需要一个特定的温度条件。
通常，PCR反应需要进行三个步骤：变性、退火和延伸。
其中，退火的温度条件对于PCR反应的效果起到至关重要的作用。
梯度退火PCR程序在PCR反应中找到最佳的退火温度条件。
它的原理是在一个PCR反应管中设置一系列不同温度的反应区域，每个区域的温度略有不同。
这样，PCR反应管中的不同区域就会有不同的退火温度条件。
在反应过程中，不同温度区域的反应效率和特异性也会有所不同。
通过对比不同温度区域的PCR产物，可以找到最佳的退火温度条件。
梯度退火PCR程序的步骤如下：1. 准备PCR反应体系，包括目标DNA片段、引物、酶和缓冲液等。
2. 在PCR反应管中设置一系列不同温度的反应区域，温度逐渐升高或降低。
3. 将PCR反应体系加入到PCR反应管中，并进行PCR反应。
4. 反应结束后，通过电泳等方法对PCR产物进行分析。
5. 比较不同温度区域的PCR产物，找到最佳的退火温度条件。
梯度退火PCR程序具有以下优点：1. 可以一次性测试多个温度条件，节省时间和资源。
2. 可以找到最佳的退火温度条件，提高PCR反应的效率和特异性。
3. 可以减少PCR反应的非特异性扩增和副产物的产生。
4. 可以优化引物的选择，提高PCR反应的特异性。
5. 可以适用于不同长度和GC含量的目标DNA片段。
总结一下，梯度退火PCR程序是一种常用的PCR优化方法，通过设置不同温度区域来找到最佳的退火温度条件，以提高PCR反应的效率和特异性。
它具有简单、快速、经济的优点，适用于各种PCR反应的优化和实验设计。
PCR反应的引物和退火温度的设计与优化
PCR反应的引物和退火温度的设计与优化PCR反应是一种常用的分子生物学技术，它可以利用引物和DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。
PCR反应的效率和特异性很大程度上取决于引物的设计和选择，以及PCR程序的设置。
本文将介绍一些关于引物和PCR程序的基本知识和常见问题，以及如何通过梯度PCR来优化PCR反应的退火温度。
引物是一种短的单链DNA分子，它可以与模板DNA上的互补序列结合，从而为DNA聚合酶提供起始位点。
引物的长度一般在18～25个碱基之间，引物的碱基组成应该尽量平衡，避免出现过多的GC或AT碱基。
引物的3’端应该避免出现互补或回文序列，以防止引物自身形成发夹结构或二聚体。
引物的浓度也会影响PCR反应的效果，一般建议使用0.1～0.5μM的引物浓度。
引物的退火温度是指引物与模板DNA之间的互补结合所需要的温度，它取决于引物的长度、碱基组成和浓度。
引物的退火温度可以通过一些公式或软件来计算，例如Tm值(解链温度)=4 (G+C)＋2 (A+T) 。
PCR程序是指PCR反应中设置的不同步骤和参数，它包括预变性、变性、退火、延伸、最终延伸和保持等步骤。
每个步骤都有相应的温度和时间，这些温度和时间会影响PCR反应的效率和特异性。
PCR程序中最重要的一个参数是退火温度，它是指PCR反应中实际设置的退火温度，它影响着引物与模板DNA之间的亲和力。
PCR程序的退火温度一般要比引物的退火温度低一些，以便引物能够有效地结合到模板DNA上。
PCR程序的退火温度也要根据不同的PCR酶、缓冲液和靶序列来调整，一般在40℃～60℃之间选择一个合适的温度。
如果退火温度过高，引物可能无法结合到模板DNA上，导致PCR产量低或无产物；如果退火温度过低，引物可能会发生非特异性结合，导致PCR 产生多条带或杂带。
梯度PCR是一种在同一反应板上同时设置不同的退火温度来进行PCR反应的方法，它可以快速地筛选出最适合特定引物和模板DNA的退火温度。
PCR仪操作说明 2(thermal cycler c1000 touch )
C1000 Touch操作指南一、传统法编辑新程序1、打开电源开关，等待自检结束；2、按New Protocol按钮；3、在温度曲线上进行编辑温度、时间和循环次数。
例如将95℃改为94℃: 按95℃按钮，在弹出的界面直接输入94，按OK就可以了。
时间和循环次数的修改方法相同。
4、删除步骤：选中需要删除的步骤，按Delete就删除该步骤。
5、插入步骤：选中将要插入步骤的前一步骤，按Insert，在弹出界面选择Temperature（温度）或Gradient（温度梯度）或Goto（循环┄）。
具体的温度、时间和循环次数输入方法同前述。
6、如果要做梯度PCR、Long PCR或Touchdown，请先选中退火温度步骤，按Options选项，然后选中相应项并输入数值并按OK即可。
Gradient（梯度）、Increment（Touchdown温度变量）、Extend（Long PCR时间变量）。
7、按Save保存程序。
可以在该界面按New Folder新建自己的文件夹。
在File Name处输入文件名，按OK。
按Save即可。
二、运行程序1、在主界面按Saved Files；2、在Folders下选中相应的文件夹；3、在Files下选中将要运行的程序；4、按Run；5、输入反应体系；然后按OK，就开始运行程序。
三、停止程序运行1、如果中途要停止正在运行的程序，请按Cancel；2、在弹出的确认界面按Yes；四、注意事项1、开盖前必须逆时针方向旋松旋钮，然后向上抬起把手就开盖了；2、PCR管放好后，盖下热盖。
轻轻顺时针方向旋转旋钮，当刚好感觉到有PCR管阻力时，再顺时针方向最多旋转90度就可以了。
不能过度拧紧。
3、如果保温时间为∞或保温时间没有结束，千万不要强行关闭电源。
应该按照上述步骤四停止程序运行，至少2分钟后再关闭电源开关。
4、反应模块的底孔有脏物后，应该及时用无水乙醇清洁。
PCR的退火温度选择
熔解温度(Tm）是引物的一.个重要参数..这是当50。
％的引物和互。
补序列表现为双链DNA 分子时的。
温度.Tm对于设。
定PCR退火温度是必。
需的。
在理想状态。
下，退火温度足.够低，以保证引物。
同目的序列。
有效退火，同时还要足够高，以减少非特。
异性结合。
合理的退火。
温度从55℃到70℃。
退火温度一.般设定比引.物的 Tm低5℃.设定Tm有。
几种公式。
有的是来源。
于高盐溶液中的杂交，适用于小于。
18碱基的.引物。
有的是根据.GC含量估.算Tm.确定引物T。
m最可信的方法是近邻。
分析法.这种方法从.序列一级结。
构和相邻碱。
基的特性预。
测引物的杂交稳定性.大部分计算。
机程序使用。
近邻分析法.根据所使用.的公式及引.物序列的不.同,Tm会差异。
很大。
因为大部分公式提供一。
个估算的T。
m值,所有退火温度只是一个。
起始点。
可以通过分.析几个逐步.提高退火温.度的反应以。
提高特异性。
开始低于估。
算的Tm5。
℃,以2℃为增量，逐步提高退。
火温度.较高的退火。
温度会减少。
引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳。
结果，两个引物应.具有近似的.Tm值。
引物对的T。
m差异如果.超过5℃，就会引物在循环中使用。
较低的退火温度而表现。
出明显的错。
误起始。
如果两个引。
物Tm 不同,将退火温度。
设定为比最.低的Tm低.5℃或者为了提。
高特异性,可以在根据。
较高Tm设。
计的退火温。
度先进行5个循环，然后在根据.较低Tm设计的退火温度进行剩余。
的循环。
这使得在较为严紧的条.件下可以获。
得目的模板.的部分拷贝。
当引物长度.低于20个。
bp可以根据Tm=3GC+2AT，对于更长的。
寡聚核苷酸。
，Tm计算公.式为：Tm = 81.5 + 16。
6 x Log10。
［Na+] + 0.41 (%GC）– 600/size公式中，Size = 引物长度.退火温度取.决于引物长.度及序列，GC含量越。
高退火温度。
越高，引物的Tm。
值减去5—8度即是引物的退火温。
梯度pcr寻找临界退火温度
梯度pcr寻找临界退火温度
梯度PCR（Gradient PCR）是一种通过在反应管中设置一系列
不同温度的热块（热模块），使反应液在不同温度下进行
PCR反应的方法。
梯度PCR可以用于优化PCR反应的温度条件，以提高特异性和产量。
而寻找临界退火温度是其中的一个应用。
临界退火温度是指PCR反应中，使扩增的目标序列的产量达
到最高或平台期时的退火温度。
在PCR反应过程中，引物结
合于DNA模板的特定温度称为退火温度。
退火温度的选择直
接影响到PCR反应的特异性和扩增效率。
为了确定临界退火温度，可以进行梯度PCR实验。
步骤如下：
1. 设定PCR扩增的温度范围，一般从低到高设置，例如55°C
至65°C。
2. 准备一系列PCR反应管，每个管中的反应液成分相同，只
是在不同管中加入不同退火温度的引物。
3. 加入相同浓度的DNA模板和引物到每个反应管中。
4. 在热块中进行PCR反应，温度依序从低到高改变，依次进
行引物的退火和延伸步骤。
5. 停止PCR反应，分析PCR产物。
6. 根据PCR产物的质量与数量，在不同的退火温度下选择临界退火温度。
通过梯度PCR寻找临界退火温度可以帮助优化PCR反应的条件，提高扩增效率和特异性。
需要注意的是，每个PCR反应的条件有所不同，可以根据具体实验情况进行调整。
PCR 仪操作手册
Mastercycler PersonalPCR 仪操作手册1 简介Eppendorf 的Mastercycler Personal 是适用于所有分子生物学和生化实验室研究的PCR仪。
样品温度在4-90 度间快速可调（最大速度每秒3 度）。
设计有特殊的¡离心管控制¡模式，从而对装有不同体积溶液的不同离心管中的样本进行温度控制。
加热槽为一通用模块，可适用5X5 的微孔板、25 个0.2ml 的Eppendorf PCR 管、16 个0.5ml 薄壁的Eppendorf PCR 管或其他相应的试管，而无须更换模块。
为避免样本蒸发浓缩，本仪器设计有可适应各种试管高度的热盖。
本仪器易于操作，有完整的八线显示，并可连接打印机。
Mastercycler Personal 是Perkin-Elmer 公司授权许可生产的PCR 仪。
2 安全警告3 安装3.1 包装一个包装内应含有以下物品：1 台小型PCR 仪1 条主电源线1 本操作指南1 张个人存储卡1 包0.2mlPCR 管（100 个）3.2 装机安装时请确保通气孔通畅，四周有足够的空间散热；并请确保仪器下部无其他异物。
搬动仪器时无须其他装置，可抓住仪器两侧将其提起。
所需空间：宽18cm深：35cm高：25cm电源连接：1 个防电击插座。
如需连接打印机，则需用另一电源连接。
3.3 启动仪器拆除热盖上的胶条并取出热盖下的泡沫塑料。
连接电源线。
启动仪器前请核对用户电源是否与铭牌要求相符。
连接和启动打印机的步骤见第9 部分。
4 技术说明4.1 仪器结构图1：前面观1 热盖2 热盖锁3 显示与控制面板4 个人存储卡读取器图2：侧面观图3：背面观1 热盖2 加热槽（此图中未显示）3 通气孔4 PC 连接插孔5 打印机连接插孔1 通气孔2 主电源开关3 保险丝4 主电源插孔5 铭牌图4：显示与控制面板1 编辑键2 光标键3 控制键4 小数点和顺序颠倒标志键5 显示屏4.2 按键1、编辑键Opt ¡在运行过程中按opt 键可显示程序运行的剩余时间¡编程时选择温度指令（ramp、梯度、增量）Del ¡删除程序条，数据字母或重新设定参数：按住此键可删除整条信息Sel ¡选择程序指令¡选择菜单信息¡可选择字母（用¡键决定正逆序）Ins ¡在程序编辑中插入程序条2、光标键▲►▼◄用于移动光标，显示为黑色方块。
PCR温度怎么设置高低
PCR温度怎么设置高低PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA的基本技术，温度设置是PCR过程中非常重要的因素之一。
合理设置PCR温度可以确保扩增反应的高效进行，同时避免不必要的问题和失误。
本文将介绍PCR温度设置的原则和方法，帮助读者正确进行PCR实验。
温度梯度的选择对于每个PCR实验来说，首先需要确定所需扩增片段的特性和反应条件。
根据目标片段的长度、GC含量、Tm值等特征，可以选择合适的温度范围作为PCR反应的温度梯度。
常用的温度梯度范围为50°C至70°C，可根据需要酌情调整。
初始变性温度在PCR反应开始时，需要对DNA模板进行变性，使其双链解开形成单链。
这一步骤一般在94°C至98°C的高温下进行，以确保DNA的完全变性。
一般情况下，94°C即可满足变性需求。
如果目标片段较长或含有高GC含量，可以适当提高初始变性温度，但不要超过98°C，避免DNA的损伤。
延伸引物的退火温度在PCR反应的下一步中，引物将与DNA模板序列的特定区域进行结合。
这一步骤称为引物的退火。
优选的退火温度通常比引物的Tm值低3°C至5°C。
一般而言，引物的合成商会提供引物的Tm值，可以据此选择退火温度。
DNA扩增温度在PCR反应的主要扩增步骤中，需要将DNA引物的末端与DNA模板序列结合，并使用聚合酶进行DNA链的合成。
此时的温度应根据DNA引物的退火温度而定，一般会选择与其相同或稍高的温度。
有时，一些研究人员会尝试较高温度以增加扩增特异性，但这也容易导致非特异性扩增产物的形成。
最终延伸温度最后，PCR反应需要进行DNA链的延伸，即在DNA模板的5’端和引物末端之间合成新的DNA链。
这一步骤一般在50°C至70°C的温度下进行。
我们可以根据引物的Tm 值以及目标片段的长度来选择合适的延伸温度。
综上所述，PCR温度设置的关键是结合DNA模板和引物的特性，根据不同的反应步骤选择相应的温度范围。
梯度pcr寻找临界退火温度
梯度pcr寻找临界退火温度
梯度PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增DNA
片段的方法，其基本原理是在不同温度下进行PCR反应，以
产生丰富的DNA产物。
要找到临界退火温度，可以通过梯度PCR来进行寻找。
梯度PCR通常使用一个热传导梯度装置，该装置在不同的PCR反
应管中分别设置不同的温度，从而形成一个温度梯度。
下面是一个寻找临界退火温度的梯度PCR步骤：
1. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTPs、聚合
酶和缓冲液等。
2. 将PCR反应体系组装到不同的PCR反应管中。
3. 将PCR反应管放入热传导梯度装置中，确保每个管子处于
不同的温度。
4. 开始PCR反应，进行一定的循环数，通常为25-30个循环。
5. 完成PCR反应后，将反应产物进行凝胶电泳检测。
6. 观察凝胶上的DNA产物带，寻找到最明亮、最清晰的带。
这些带表示在该温度下DNA扩增效果最好。
7. 将最明亮、最清晰的带对应的温度记录下来，该温度即为临界退火温度。
通过上述步骤，可以找到DNA在哪个温度下扩增效果最好，
即临界退火温度。
这个临界退火温度可以用于优化PCR反应
的退火温度，以提高PCR扩增效率和特异性。
QPCR退火温度和熔解曲线程序设定
QPCR退火温度和熔解曲线程序设定QPCR退火温度和熔解曲线程序设定，熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55度到70度。
退火温度一般设定比引物的Tm低5度。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5度，以2度为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5度，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5度或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
梯度退火pcr程序
梯度退火pcr程序梯度退火PCR程序是一种用于DNA序列扩增的技术，它可以在较短的时间内扩增出目标DNA序列，具有高效、快速、准确等优点。
下面将详细介绍梯度退火PCR程序的原理、步骤和应用。
一、原理梯度退火PCR程序是一种改进的PCR技术，它利用梯度退火的原理，通过逐渐降低退火温度的方式，使PCR反应在不同温度下进行，从而扩增出目标DNA序列。
梯度退火PCR程序的原理基于PCR反应的三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被分离成两条单链，这需要高温（通常为95℃）来实现。
在退火步骤中，引物与模板DNA结合，这需要较低的温度（通常为50-60℃）来实现。
在延伸步骤中，DNA聚合酶在引物的引导下，将新的DNA链合成，这需要适当的温度（通常为72℃）来实现。
梯度退火PCR程序通过逐渐降低退火温度的方式，使PCR反应在不同温度下进行，从而扩增出目标DNA序列。
二、步骤1.设计引物：根据目标DNA序列设计引物，引物的长度应在18-25个碱基之间，GC含量应在40-60%之间，引物之间的距离应在100-500个碱基之间。
2.制备PCR反应体系：将引物、模板DNA、聚合酶、缓冲液和dNTPs等反应物混合，制备PCR反应体系。
3.设置PCR反应条件：设置PCR反应条件，包括退火温度、延伸温度、延伸时间和循环次数等参数。
4.进行PCR反应：将PCR反应体系加热至变性温度，进行PCR反应。
在PCR反应过程中，逐渐降低退火温度，使PCR反应在不同温度下进行，从而扩增出目标DNA序列。
5.检测PCR产物：将PCR产物进行电泳分析，检测PCR产物的大小和纯度。
三、应用梯度退火PCR程序在分子生物学研究中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因克隆：梯度退火PCR程序可以用于基因克隆，通过扩增目标DNA序列，将其插入到表达载体中，从而实现基因克隆。
2.基因分型：梯度退火PCR程序可以用于基因分型，通过扩增目标DNA序列，检测基因型差异，从而实现基因分型。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。