辣椒疫病拮抗菌株筛选_鉴定及其防效_梅新兰
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拮抗菌对辣椒疫霉菌拮抗能力的测定采用对峙培 养法． 将辣椒疫霉菌 NGDP 在 PSA 平板上活化，用打孔 器在菌落边缘打取菌块（ 直径 5 mm） ，再接种在 PSA 平 板中央． 培养 1 d 后，在距离病原菌菌块 2 cm 处点接拮 抗菌，然后置于 25 ℃培养箱内，培养 5 d 后测量 NGDP 直径，并按下式计算抑菌率，试验重复 3 次．
10 期
梅新兰等： 辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效
2653
无从根本上防治辣椒疫病的有效方法［7］． 利用拮抗微生物菌株与有机肥发酵生产的生物
有机肥，在防治土传病害、改善植物营养和土壤理化 性状等方面具有显著作用，正越来越受到人们的关 注和重视［8］． 不少研究结果表明，连作土传病害发 生的关键因素是由于连作作物分泌的特定物质导致 土壤微生物区系失衡，土壤中有益细菌菌群严重降 低，病原真菌明显增加［9］． 利用微生物有机肥防治 土传病害不仅可以向植物根际施入特异性生防菌， 抑制病原菌生长繁殖，防止土传病害的发生，而且有 机肥能提供丰富的营养，促进生防菌在土壤和植物 根际定殖，大大提高其生防效果［10］． 连作障碍土壤 中施用微生物有机肥还能改善土壤理化性状，有利 于微生物种群的恢复［11］，减少连作障碍的发生．
Abstract： A total of 98 isolates with antagonistic activity against Phytophthora capsici were isolated from the rhizosphere soil of healthy pepper plants in the fields seriously infected by pepper Phytophthora capsicit，and two strains named as HL-3 and LZ-8 were screened，which had the characteristics of wide-spectrum antagonism and good growth under poor soil condition． The HL-3 and LZ-8 were identified as Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus，respectively，based on their morphological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences． The two strains could inhibit the mycelium growth of P． capsici，and the inhibitory effect of HL-3 and LZ-8 was 72% and 68% ， respectively． The two strains also had antifungal activities toward other plant pathogens such as Verticillium dahliae，Fusarium oxysporum f． sp． cucumerinum，F． oxysporum f． sp． vasinfectum，Rhizoctonia solani，Phtophthora parasitica var． nicotiana，and Ralstonia solanacearum． Pot experiment showed that the biocontrol effects of HL-3 and LZ-8 against P． capsici at the seedling stage of pepper were 72% and 83 % ，respectively，and both of the strains had significant growth-promoting effect on pepper plants．
关键词 拮抗菌 分离和筛选 辣椒疫霉 生物防治
文章编号 1001 － 9332（ 2010） 10 － 2652 － 07 中图分类号 Q939． 92； S476． 9 文献标识码
A
Screening，identification，and biocontrol effect of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici． MEI Xin-lan，ZHAO Qing-yun，TAN Shi-yong，XU Yang-chun，SHEN Biao，SHEN Qirong （ Jiangsu Province Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China） ． -Chin． J． Appl． Ecol． ，2010，21（ 10） ： 2652 － 2658．
从安徽和县、南京麒麟镇、江苏金坛和盐城等辣 椒种植区疫病发生严重的田块，采集健康辣椒植株 根际土 56 份． 称取土样 10 g 加入装有 90 ml 无菌水 的三角瓶中（ 内装玻璃珠若干） ，30 ℃ 、170 r·min － 1
振荡 30 min，静止后取土壤悬液稀释至 10 － 5 、10 － 6 、 10 － 7 ． 吸取土壤稀释液 0. 1 ml 加入含有约 103 个疫 霉菌游动孢子的 PSA 平板上均匀涂布． 置于 25 ℃ 培养箱培养 48 ～ 72 h，挑取对疫霉菌有拮抗作用的 菌株于 NA 平板上纯化，将纯化后的菌株保存在 NA 斜面上，4 ℃ 冷藏备用．
抑菌率 = （ 对 照 NGDP 直 径 － 接 种 拮 抗 菌 后 NGDP 直径） / 对照 NGDP 直径 × 100% 1. 3 拮抗菌株的复筛试验 1. 3. 1 Compost tea 培养基复筛 将有机肥（ 江苏新 天地氨基酸肥料有限公司提供） 与蒸馏水按 1 ∶ 5 （ m： v ） 混 合 后，30 ℃ 、170 r · min － 1 震 荡 24 h， 8000 r·min － 1 离心 15 min，收集上清液，过 0. 22 μm 微孔滤膜后吸取 5 ml 加入到 200 ml 水琼脂培养基 中，混合均匀后倒平板． 用接种环将拮抗菌划线接种 于平板上，30 ℃ 培养 5 d 后观察其生长情况． 1. 3. 2 胚根试验 拮抗菌株接种于 NA 培养液中， 170 r · min － 1 、30 ℃ 摇 瓶 培 养 24 h 后，8000 r · min － 1 离心15 min，去除上清液，菌体加入无菌水悬 浮备用（ 菌体浓度为 107 CFU·ml － 1 ） ． 将用 10% 的 H2O2 消毒后的辣椒种子置于铺有湿润滤纸的培养 皿内，28 ℃ 避光催芽 4 d． 挑取发芽一致的种子放入 供试拮抗菌株悬浮液中浸泡 3 h，以无菌水作为对 照． 然后移至无菌滤纸上吸干种子表面的水分，将其 置于在 0. 02% 的葡萄糖水琼脂平板上生长的 NGDP 菌丝边缘，28 ℃ 培养 6 d 后测定胚根侵染率［15］，即 胚根变褐色的百分率． 每个平皿置 10 粒种子，试验 重复 3 次．
* 国家“863”计划项目（ 2006AA10Z416） 和国家公益性行业（ 农业） 科研专项（ 200803031） 资助． ＊＊通讯作者． E-mail： ycxu@ njau． edu． cn 2010-03-10 收稿，2010-07-27 接受．
病原菌侵 染 模 型、侵 染 条 件［4］ 及 病 害 发 生 规 律，并 在栽培措施、遗传育种和化学防治方面开展了一系 列研究，但防治辣椒疫病的农业管理措施较复杂，大 面积生产栽培难以实施； 辣椒种质中尚不具有抗侵 染类型，常规育种也存在一定难度； 由于疫霉兼具土 壤和空气双重传播的特点，且以土壤传播造成的危 害更严重［5］，因 此 发 病 多 从 根 部 侵 染 开 始，待 地 上 部表现症状时再用药剂防治为时已晚，且化学农药 还会造成残留污染，危害人畜安全［6］． 迄今为止，尚
DOI:10.13287/j.1001-9332.2010.0380
应 用 生 态 学 报 2010 年 10 月 第 21 卷 第 10 期 Chinese Journal of Applied Ecology，Oct． 2010，21（ 10） ： 2652 － 2658
辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效*
梅新兰 赵青云 谭石勇 徐阳春＊＊ 沈 标 沈其荣
（ 南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验Biblioteka Baidu，南京 210095）
摘 要 从疫病发病严重田块的健康辣椒植株根际分离到 98 株拮抗菌，从中筛选出两株具 有广谱抗性并可在贫营养条件下生长良好的高效拮抗菌株 HL-3 和 LZ-8． 通过形态观察、生理 生化特性和 16S rDNA 序列分析，确定 HL-3 为多粘类芽孢杆菌，LZ-8 为短小芽孢杆菌． HL-3 和 LZ-8 对辣椒疫霉菌丝生长抑制率分别为 72% 和 68% ． HL-3 和 LZ-8 还对黄瓜枯萎病菌、辣 椒枯萎病菌、棉花黄萎病菌、黄瓜立枯病菌、烟草黑胫病菌和番茄青枯病菌具有显著的抑制作 用． 盆栽试验表明，HL-3 和 LZ-8 对辣椒苗期疫病防治效果分别为 72% 和 83% ，且对辣椒生长 表现出明显的促生作用．
利用微生物有机肥防治辣椒疫病的核心是高效 生防菌，虽然国内外已从土壤、植物体内等分离筛选 到大量对辣椒疫病具有控制作用的拮抗菌［12 － 13］，但 能真正用于微生物有机肥料生产的高效菌株却鲜有 报道． 本研究通过初筛和复筛，获得了两株在贫营养 条件下 生 长 良 好 并 具 广 谱 抗 性 的 高 效 拮 抗 菌 株 HL-3和 LZ-8，并通过盆栽试验研究了其对辣椒苗期 疫病的生防效果，以期为其在生产上的应用推广提 供理论依据．
Key words： antagonistic bacteria； isolation and identification； Phytophthora capsici； biocontrol．
辣椒疫病是由辣椒疫霉（ Phytophthora capsici） 侵染引起的一种毁灭性土传病害［1］． 20 世纪 80 年 代以来，随着辣椒设施生产的专一化、规模化等生产 模式的出现，辣 椒 疫 病 在 全 国 各 地 普 遍 发 生［2］，且 从苗期到成株期都可发生，发病周期短，蔓延快，常 造成辣椒减产，甚至绝收［3］． 目前已探明辣椒疫病
1 材料与方法
1. 1 供试菌株和培养基 辣椒疫病病原菌由中国农业科学院蔬菜花卉研
究所提供，编号为 NGDP． 培养基为牛肉膏蛋白胨培 养基（ NA） 、马铃薯蔗糖培养基（ PSA） 、玉米粉琼脂 培养基（ CMA） 、利马豆培养基 （ LBA） ［14］和水琼脂 培养基． 棉花黄萎病菌（ Verticillium dahliae） 、黄瓜枯 萎病菌（ Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum） 、西 瓜枯萎病菌（ F． oxysporum f． sp． niveum） 、甜瓜枯萎 病菌（ F． oxysporum f． sp． melonis） 、辣椒枯萎病菌 （ F． oxysporum f． sp． vasinfectum） 、香 蕉 枯 萎 病 菌 （ F． oxysporum f． sp． cubense） 、黄瓜立枯病菌（ Rhizoctonia solani） 、烟 草 黑 胫 病 菌 （ P． parasitica var． nicotiana） 和番茄青枯病菌（ Ralstonia solanacearum） 均为本实验室保存． 1. 2 拮抗菌株的筛选试验
10 期
梅新兰等： 辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效
2653
无从根本上防治辣椒疫病的有效方法［7］． 利用拮抗微生物菌株与有机肥发酵生产的生物
有机肥，在防治土传病害、改善植物营养和土壤理化 性状等方面具有显著作用，正越来越受到人们的关 注和重视［8］． 不少研究结果表明，连作土传病害发 生的关键因素是由于连作作物分泌的特定物质导致 土壤微生物区系失衡，土壤中有益细菌菌群严重降 低，病原真菌明显增加［9］． 利用微生物有机肥防治 土传病害不仅可以向植物根际施入特异性生防菌， 抑制病原菌生长繁殖，防止土传病害的发生，而且有 机肥能提供丰富的营养，促进生防菌在土壤和植物 根际定殖，大大提高其生防效果［10］． 连作障碍土壤 中施用微生物有机肥还能改善土壤理化性状，有利 于微生物种群的恢复［11］，减少连作障碍的发生．
Abstract： A total of 98 isolates with antagonistic activity against Phytophthora capsici were isolated from the rhizosphere soil of healthy pepper plants in the fields seriously infected by pepper Phytophthora capsicit，and two strains named as HL-3 and LZ-8 were screened，which had the characteristics of wide-spectrum antagonism and good growth under poor soil condition． The HL-3 and LZ-8 were identified as Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus，respectively，based on their morphological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences． The two strains could inhibit the mycelium growth of P． capsici，and the inhibitory effect of HL-3 and LZ-8 was 72% and 68% ， respectively． The two strains also had antifungal activities toward other plant pathogens such as Verticillium dahliae，Fusarium oxysporum f． sp． cucumerinum，F． oxysporum f． sp． vasinfectum，Rhizoctonia solani，Phtophthora parasitica var． nicotiana，and Ralstonia solanacearum． Pot experiment showed that the biocontrol effects of HL-3 and LZ-8 against P． capsici at the seedling stage of pepper were 72% and 83 % ，respectively，and both of the strains had significant growth-promoting effect on pepper plants．
关键词 拮抗菌 分离和筛选 辣椒疫霉 生物防治
文章编号 1001 － 9332（ 2010） 10 － 2652 － 07 中图分类号 Q939． 92； S476． 9 文献标识码
A
Screening，identification，and biocontrol effect of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici． MEI Xin-lan，ZHAO Qing-yun，TAN Shi-yong，XU Yang-chun，SHEN Biao，SHEN Qirong （ Jiangsu Province Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China） ． -Chin． J． Appl． Ecol． ，2010，21（ 10） ： 2652 － 2658．
从安徽和县、南京麒麟镇、江苏金坛和盐城等辣 椒种植区疫病发生严重的田块，采集健康辣椒植株 根际土 56 份． 称取土样 10 g 加入装有 90 ml 无菌水 的三角瓶中（ 内装玻璃珠若干） ，30 ℃ 、170 r·min － 1
振荡 30 min，静止后取土壤悬液稀释至 10 － 5 、10 － 6 、 10 － 7 ． 吸取土壤稀释液 0. 1 ml 加入含有约 103 个疫 霉菌游动孢子的 PSA 平板上均匀涂布． 置于 25 ℃ 培养箱培养 48 ～ 72 h，挑取对疫霉菌有拮抗作用的 菌株于 NA 平板上纯化，将纯化后的菌株保存在 NA 斜面上，4 ℃ 冷藏备用．
抑菌率 = （ 对 照 NGDP 直 径 － 接 种 拮 抗 菌 后 NGDP 直径） / 对照 NGDP 直径 × 100% 1. 3 拮抗菌株的复筛试验 1. 3. 1 Compost tea 培养基复筛 将有机肥（ 江苏新 天地氨基酸肥料有限公司提供） 与蒸馏水按 1 ∶ 5 （ m： v ） 混 合 后，30 ℃ 、170 r · min － 1 震 荡 24 h， 8000 r·min － 1 离心 15 min，收集上清液，过 0. 22 μm 微孔滤膜后吸取 5 ml 加入到 200 ml 水琼脂培养基 中，混合均匀后倒平板． 用接种环将拮抗菌划线接种 于平板上，30 ℃ 培养 5 d 后观察其生长情况． 1. 3. 2 胚根试验 拮抗菌株接种于 NA 培养液中， 170 r · min － 1 、30 ℃ 摇 瓶 培 养 24 h 后，8000 r · min － 1 离心15 min，去除上清液，菌体加入无菌水悬 浮备用（ 菌体浓度为 107 CFU·ml － 1 ） ． 将用 10% 的 H2O2 消毒后的辣椒种子置于铺有湿润滤纸的培养 皿内，28 ℃ 避光催芽 4 d． 挑取发芽一致的种子放入 供试拮抗菌株悬浮液中浸泡 3 h，以无菌水作为对 照． 然后移至无菌滤纸上吸干种子表面的水分，将其 置于在 0. 02% 的葡萄糖水琼脂平板上生长的 NGDP 菌丝边缘，28 ℃ 培养 6 d 后测定胚根侵染率［15］，即 胚根变褐色的百分率． 每个平皿置 10 粒种子，试验 重复 3 次．
* 国家“863”计划项目（ 2006AA10Z416） 和国家公益性行业（ 农业） 科研专项（ 200803031） 资助． ＊＊通讯作者． E-mail： ycxu@ njau． edu． cn 2010-03-10 收稿，2010-07-27 接受．
病原菌侵 染 模 型、侵 染 条 件［4］ 及 病 害 发 生 规 律，并 在栽培措施、遗传育种和化学防治方面开展了一系 列研究，但防治辣椒疫病的农业管理措施较复杂，大 面积生产栽培难以实施； 辣椒种质中尚不具有抗侵 染类型，常规育种也存在一定难度； 由于疫霉兼具土 壤和空气双重传播的特点，且以土壤传播造成的危 害更严重［5］，因 此 发 病 多 从 根 部 侵 染 开 始，待 地 上 部表现症状时再用药剂防治为时已晚，且化学农药 还会造成残留污染，危害人畜安全［6］． 迄今为止，尚
DOI:10.13287/j.1001-9332.2010.0380
应 用 生 态 学 报 2010 年 10 月 第 21 卷 第 10 期 Chinese Journal of Applied Ecology，Oct． 2010，21（ 10） ： 2652 － 2658
辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效*
梅新兰 赵青云 谭石勇 徐阳春＊＊ 沈 标 沈其荣
（ 南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验Biblioteka Baidu，南京 210095）
摘 要 从疫病发病严重田块的健康辣椒植株根际分离到 98 株拮抗菌，从中筛选出两株具 有广谱抗性并可在贫营养条件下生长良好的高效拮抗菌株 HL-3 和 LZ-8． 通过形态观察、生理 生化特性和 16S rDNA 序列分析，确定 HL-3 为多粘类芽孢杆菌，LZ-8 为短小芽孢杆菌． HL-3 和 LZ-8 对辣椒疫霉菌丝生长抑制率分别为 72% 和 68% ． HL-3 和 LZ-8 还对黄瓜枯萎病菌、辣 椒枯萎病菌、棉花黄萎病菌、黄瓜立枯病菌、烟草黑胫病菌和番茄青枯病菌具有显著的抑制作 用． 盆栽试验表明，HL-3 和 LZ-8 对辣椒苗期疫病防治效果分别为 72% 和 83% ，且对辣椒生长 表现出明显的促生作用．
利用微生物有机肥防治辣椒疫病的核心是高效 生防菌，虽然国内外已从土壤、植物体内等分离筛选 到大量对辣椒疫病具有控制作用的拮抗菌［12 － 13］，但 能真正用于微生物有机肥料生产的高效菌株却鲜有 报道． 本研究通过初筛和复筛，获得了两株在贫营养 条件下 生 长 良 好 并 具 广 谱 抗 性 的 高 效 拮 抗 菌 株 HL-3和 LZ-8，并通过盆栽试验研究了其对辣椒苗期 疫病的生防效果，以期为其在生产上的应用推广提 供理论依据．
Key words： antagonistic bacteria； isolation and identification； Phytophthora capsici； biocontrol．
辣椒疫病是由辣椒疫霉（ Phytophthora capsici） 侵染引起的一种毁灭性土传病害［1］． 20 世纪 80 年 代以来，随着辣椒设施生产的专一化、规模化等生产 模式的出现，辣 椒 疫 病 在 全 国 各 地 普 遍 发 生［2］，且 从苗期到成株期都可发生，发病周期短，蔓延快，常 造成辣椒减产，甚至绝收［3］． 目前已探明辣椒疫病
1 材料与方法
1. 1 供试菌株和培养基 辣椒疫病病原菌由中国农业科学院蔬菜花卉研
究所提供，编号为 NGDP． 培养基为牛肉膏蛋白胨培 养基（ NA） 、马铃薯蔗糖培养基（ PSA） 、玉米粉琼脂 培养基（ CMA） 、利马豆培养基 （ LBA） ［14］和水琼脂 培养基． 棉花黄萎病菌（ Verticillium dahliae） 、黄瓜枯 萎病菌（ Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum） 、西 瓜枯萎病菌（ F． oxysporum f． sp． niveum） 、甜瓜枯萎 病菌（ F． oxysporum f． sp． melonis） 、辣椒枯萎病菌 （ F． oxysporum f． sp． vasinfectum） 、香 蕉 枯 萎 病 菌 （ F． oxysporum f． sp． cubense） 、黄瓜立枯病菌（ Rhizoctonia solani） 、烟 草 黑 胫 病 菌 （ P． parasitica var． nicotiana） 和番茄青枯病菌（ Ralstonia solanacearum） 均为本实验室保存． 1. 2 拮抗菌株的筛选试验