蒸发光散射检测器ELSD 简介

质谱MS 局限性 •购买费用高 •操作复杂 •需要经常维护
蒸发光散射检测器ELSD
•发展历史
•பைடு நூலகம்测原理
•局限性
•优点
•在药物分析中的应用
发展历史 第一台商业化的产品出现在80年代初期 • 最早的应用集中在聚合物的分析上 • 90年代初期，更多其它方面的应用 • 目前，应用在广泛的领域
•
独特的检测方法
在撞击器开情况下，可以较低温蒸发溶剂，防止半挥发性样 品蒸发
撞击器开-在几乎室温下检测半挥发样品
1. Glycerol甘油
Column: Prevail™ Carbohydrate ES, 5µ m, 250 x 4.6mm Mobile Phase: Acetonitrile: 0.04% Ammonium Hydroxide (80:20) Flowrate: 1.0mL/min
Alltima™ NH2, 5µ m 1.5mL/min Acetonitrile:Water (75:25) ELSD
# 7570 (Gradient) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 核糖 木糖 果糖 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 棉子糖
Column: Alltima™NH2, 5µ m Flowrate: 1.5mL/min Mobile Phase: A: Acetonitrile B: Water Gradient: Time: 0 10 %B: 20 40 Detector: ELSD
ELSD
RI
RI (反转极性)
ELSD相对RI，提高了检测灵敏度和基线稳定性
10278
1. Fructose 果糖 2. Glucose 葡萄糖 3. Sucrose 蔗糖
10277
RI
ELSD
Column: Flowrate:
Prevail™ Carbohydrate ES, 5µ m, 53 x 7mm (Part No. 35104) 2.0mL/min
撞击器开模式
撞击器垂直于气溶 胶流向，部分液滴碰 上撞击器 从废液管排掉；其余 穿过撞击器，经过漂 移管到达流动池
Drive Shaft
Impactor ‘On’ Nebulizer Optics Optics
Exhaust
最适用于半挥发性 样品及低挥发性溶剂 (大部分为水溶液)
Drift Tube
96-97°C
120°C
Nonafluoropentanoic Acid九氟戊酸
Pentadecafluoroocatanoic Acid十五氟辛酸 Tridecafluoroheptanoic Acid十三氟庚酸
140°C
189°C 175°C
如何应对非线性响应的检测器？
-选择2阶方程或者幂指曲线方程 -使用曲线的仅仅线性部分 -使用log/log 双对数方法产生线性曲线 在中国药典2005版中，中药计算采用两点双对 数方法,抗生素计算采用三点双对数方法
5.5-7.5 and 9.3-11.3
挥发性的流动相改性剂#2
Volatile Mobile Phase Modifiers
pKa pKb pH Range BP MP
Ion-Pair Reagents Pentafluoropropionic Acid五氟丙酸 Heptafluorobutyric Acid七氟丁酸 ~0.6 ~0.6 ~0.6 ~0.6
Column: Mobile Phase: Flowrate:
非挥发性样品在撞击器“关”的情况下也不挥发，全部进入流动池，得到最高灵敏度
撞击器关-最适合挥发性溶剂
# 9180
葡萄糖苷分析
Impactor ‘On’
Column:
Mobile Phase: Flowrate:
Alltech Econosphere®, C18, 5µ m, 150 x 4.6 mm Methanol:Water (90:10) 0.8mL/min
撞击器关模式
撞击器与气溶 胶流向平行
所有样品流过
Drive Shaft
漂移管到达流通 池
最适用于非挥 发性样品及挥发 性溶剂(大部分 为有机)
Impactor ‘Off’
Nebulizer
Optics Optics
Exhaust
Drift Tube
Impactor Nebulizer Drain
功能强大的HPLC检测器
通用性高-可检测任何挥发性低于流动相 的化合物 灵敏度好-比示差及低波长紫外灵敏 一致的响应-给出准确的样品浓度 用途广泛-梯度相容，改善分离及缩短分 析时间
示差与ELSD的比较
示差检测器的限制 ELSD优点
•温度变化会引起基线不稳定
•可能出现负峰 •不可以用梯度洗脱 •受溶剂峰干扰
Impactor Nebulizer Drain
撞击器关-最适合非挥发性样品
# 9206
Impactor ‘On’
碳水化合物
Column: Mobile Phase: Flowrate: Alltech 700CH Carbohydrate Column 10µ m, 300x6.5mm 100% Water 0.5mL/min
ELSD的局限性
1. 只能使用挥发性的流动相
2. 样品的挥发性必须要小于流动相 3. 检测器响应是非线性的
挥发性的流动相改性剂#1
Volatile Mobile Phase Modifiers
pKa Acids Trifluoroacetic Acid三氟乙酸 Formic Acid甲酸 0.3 3.75 13.70 10.25 72.4°C 100.7°C pKb pH Range BP MP
Mobile Phase: Acetonitrile:Water (75:25) Column Temp: 30°C
碳水化合物的梯度洗脱
# 7576 (Isocratic)
Carbohydrates
1. 2. 3. 4. 5. 果糖 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖
Column: Flowrate: Mobile Phase: Detector:
荧光检测器Fluorescence 优点： •很好的灵敏度 •很好的选择性 •受流速和温度的变化影响很小
荧光检测器Fluorescence
局限性
•线性范围窄 •操作复杂-需要对化合物和仪器的变化了解透彻 •某些物质如氧气会熄灭荧光-必须严格脱气 •能够自然产生荧光的化合物不是很多 •衍生方法复杂
检测三部曲 雾化 溶剂的蒸发 检测
第一部：雾化
色谱柱流出物通过喷雾器针孔 与氮气混合形成均匀的雾状液滴
第二部：溶剂的蒸发
液滴通过加热的漂移管 溶剂蒸发 只有样品颗粒保留
第三部：检测
样品颗粒通过流动池 激光“撞击”颗粒被散射 光电二极管检测散射光 检测角度为90℃，避免虚假 信号(>90℃折射/衍射光；<90℃反射光)
# 9202
1. 2. 3. 4.
羟基苯甲酸甲酯 羟基苯甲酸乙酯 羟基苯甲酸丙酯 羟基苯甲酸丁酯
Alltech Econosphere®, C18, 5µ m, 150 x 4.6 mm Methanol:Water (90:10) 0.8mL/min
Impactor ‘Off’
Column: Mobile Phase: Flowrate:
4.75
6.37
9.25
7.63
116.0°C
—
9.25 10.81 10.66 11.01
4.75 3.19 3.34 2.99
-33.35°C 16.6°C -6.3°C 89.3°C
3.0-5.0 3.0-5.0 3.8-5.8 4.0-6.0
120° C
111° C
8.0 (adjusted)
MS4% 其它3% FLuorescence8%
ECD10%
UV/Vis 65%
RI&ELSD10%
紫外/可见检测器UV/VIS
优点： • 易于操作 • 可靠性
• 费用相对低廉
• 溶剂梯度兼容
• 对样品没有破坏性
• 相对灵敏度高
紫外/可见检测器UV/VIS
局限性
• 没有好的发光基团的化合物响应较差 • 溶剂的使用上受紫外截止波长的限制
示差折光检测器RI 优点：
•通用性-对几乎所有的物质具有相应
•宽的动态线性范围 •易于操作
示差折光检测器RI
局限性
•检测灵敏度不高
•对于温度和压力的波动敏感 •平衡慢 •检测既有正峰也有负峰 •不能进行梯度洗脱 •流动相预先混合后的效果好于泵在线混合的
质谱MS 优点
•灵敏度高
•选择性好 •提供化学结构信息
# 9179
1. n-癸基-b-D-吡喃糖苷 (5µ g/mL) 2. n-辛基-b-D-吡喃糖苷 (5µ g/mL) 3. n-十二烷基-b-D-吡喃糖苷(5µ g/mL)
Impactor ‘Off’
Column: Mobile Phase: Flowrate:
Alltech Econosphere®, C18, 5µ m, 150 x 4.6 mm Methanol:Water (90:10) 0.8mL/min
# 9205
Impactor ‘Off’
1. 2. 3. 4.
蜜三糖 (50µ g/mL) 乳糖(50µ g/mL) 葡萄糖 (50µ g/mL) 甘露糖 (50µ g/mL)
Alltech 700CH Carbohydrate Column 10µ m, 300x6.5mm 100% Water 0.5mL/min
大纲
常规检测器的回顾 ELSD的检测原理 ELSD与常规检测器的比较 ELSD在药物分析上的优点 ELSD的维护 质量保证 最新的发展 总结
常规检测器的回顾
-
紫外可见UV/Vis
- 示差折光RI - 荧光Fluorescence - 质谱Mass Spectrometry
检测器的应用分布
Acetic Acid醋酸
Carbonic Acid碳酸 Bases Ammonia氨水 Methylamine甲胺 Ethylamine二乙胺 Triethylamine三乙胺 Buffers Ammonium Formate甲酸胺 Pyridinium Formate甲酸吡啶翁 Ammonium Acetate乙酸胺 Pyridinium Acetate乙酸吡啶翁 Ammonium Carbonate (for reverse phase) 碳酸胺(用于反相) Ammonium Carbonate碳酸胺
两种类型ELSD
A型-所有液滴进入漂移管及流动池(又称为 “无气溶胶分流 No Aerosol Splitting”) B型-部分液滴分流排掉；只有一部分进入 漂移管及流动池(“气溶胶分流Aerosol Splitting”)
A型ELSD-不分流操作
所有样品从喷雾器 进入漂移管及流动 池 需要较高温度才能 完全蒸发流动相； A型ELSD只有不分 流一种操作模式
B型ELSD-气溶胶分流操作
部分样品被排掉 较低的温度已足 够蒸发所有溶剂 B型ELSD只有分 流一种操作模式
Alltech2000(ES)型ELSD
唯一提供两种操作模式的ELSD，在任何流动 相及样品分析条件下均达到最佳结果
一台仪器，两种操作
撞击器(Impactor)关-所有液滴进入漂移管及流 动池(A型ELSD-无分流) 撞击器(Impactor)开-部分液滴被排除，只有一 部分进入漂移管及流动池(B型ELSD-气溶胶分流) 采用新型专利“气溶胶分流技术” US Patent #6229605
•不受环境温度影响 •均是正峰 •梯度洗脱兼容 •溶剂无响应，无溶剂峰
•灵敏度差
•ng级的检测限
ELSD不会出负峰
五糖, 1.5mg/mL
• • • • • Hypersil SI, 5um, 250 x 4.6mm Hexane:Ethylacetate:Ethanol (45:45:10) 1.0 mL/min. Drift Tube 75C Gas Flowrate 2.0 SLPM
有机溶剂在较低温度蒸发，在撞击器“关”的情况下， 也会完全蒸发，B型ELSD 任何条件下均分流，做成样品 损失，降低检测灵敏度
撞击器开-最适合半挥发性样品
# 9201
防腐剂分析
Impactor ‘On’
Column: Mobile Phase: Flowrate: Alltech Econosphere®, C18, 5µ m, 150 x 4.6 mm Methanol:Water (90:10) 0.8mL/min