酶活测定方法
酶活测定方法
酶活测定方法
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土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
酶活性和质量测定方法及其评价
1.酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：20世纪50年代以前大都使用固定时间法。
这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。
50年代中期开始采用连续监测法。
这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。
1）定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法，称为两点法，其中t1往往取反应开始的时间。
在酶反应一定时间后，往往通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。
2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。
在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
（2）按监测方法分类法：可分为①分光光度法；②旋光法；
③荧光法；④电化学方法；⑤化学反应法；⑥核素测定法；⑦量热法。
2.酶质量测定法随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng／ml、μg／L来表示酶含量的高低。
免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。
如肌酸激酶同酶MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。
取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。
各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。
冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。
以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用P E塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100m L 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100m g 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
酶活测定实验方案
在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。
植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
酶活测定基本方法
前处理：称取叶片0.5克，加5ml（1+4）提取液PH7.8 Pbs，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为粗酶提取液。
注：粗酶提取液要全部转移；加入石英砂后离心需配平1.SOD测量取透明度好的指形管，按下表加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）0.05M磷酸缓冲液 1.565mM Met溶液0.3500uM NBT溶液0.3100uM EDTA-Na20.3200uM核黄素0.3酶液0.1（对照管加缓冲液）蒸馏水0.5总体积 3.3混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，其余各管于4000lx光下反应20-30min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，560nm测定OD值。
按下式计算SOD活性。
SOD总活性=[(ACK —AE)×V]/[ ACK×1/2×W×a]SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以每克鲜重每单位表示：比活力单位以酶单位/mg蛋白表示ACK—照光对照管的消光度值AE—样品管的消光度值V—样液总体积（ml）a—测定时样品用量（ml）W—样重（g）蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。
【试剂配制】磷酸缓冲液配制：母液：A：Na2HPO4•12H2O 36g，稀释至500mlB：NaH2PO4•2H2O 15.92g，稀释至500ml提取液配制：取0.0186gEDTA（0.1mM），5g PVP （1%（g/ml））,用磷酸缓冲液（PH7.8）稀释至500ml。
PH7.8 Pbs配制：A 114.35ml + B 10.625ml，定容至500ml。
PH7.0 Pbs配制：A 152.5ml（76.25ml）+ B 97.5ml（48.75ml）稀释至1000ml （500ml）。
65 mmol/L Met: 取0.97g Met 用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml；500 umol/L NBT:取0.0409g NBT用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml（避光保存）；100 umol/L EDTA-Na2: 0.03721g（0.0186g）EDTA-Na2磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；200 umol/L 核黄素：0.0753（0.03765）g核黄素磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；（现用现配）注：若要抑制Cu-Zn/SOD的活性，可加入30mM的KCN0.3ml；若要抑制Cu-Zn/SODFe-SOD的活性，可加入50mM的H2O2（0.52ml 30%的H2O2稀释至100ml） 0.3ml；2.CAT酶提取液：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，4℃下保存备用。
酶活测定原理
酶活测定原理酶活测定是通过测定酶反应产物生成的物质量或反应速率来确定酶活性的一种方法。
这种测试被广泛应用于生物、医学、环境和食品科学领域。
本文将重点介绍酶活测定的原理和方法。
一、酶的定义和分类酶是一类具有催化生物反应能力的蛋白质，在生物体内担任调节代谢过程的重要角色。
酶的活性被认为是其特异性、选择性和效率的关键因素。
酶根据其催化反应类型，可以分为六类：1. 氧化还原酶：例如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，可以将还原剂氧化成相应的氧化物。
2. 转移酶：例如乙醛酸酯酶和谷氨酰胺转移酶，可以将一个基团从一个分子转移到另一个分子。
3. 加水酶：例如酯酶和葡萄糖苷酶，可以加入水分子切断化学键。
4. 合成酶：例如DNA聚合酶和RNA聚合酶，可以将单体结合成聚合物。
5. 裂解酶：例如蛋白酶和纤维蛋白溶解酶，可以降解大分子化合物。
6. 引导酶：例如酰基载体蛋白，可以在代谢过程中向该蛋白基团上结合或从该基团上解离。
二、酶活测定的原理酶活性通常通过测量酶反应的速率来评估。
酶反应速率与底物浓度、酶浓度、反应温度和pH值等条件有关。
在酶活测定中，这些条件必须被控制和标准化。
测量酶活性可以通过直接测量酶反应产物生成的量或测量反应底物消耗的量来进行。
下面介绍常用的酶活测定方法。
1. 进行光学密度测定酶活测定可以通过光学测量来实现。
在酯类水解反应中，酶催化酯水解为醇和羧酸。
在这种反应中，测量分离的醇透过率或吸光度变化，可以计算出相应的反应产物含量。
这种方法可以适用于其他酶反应，例如测定酒精脱氢酶催化的乙醛氧化反应。
2. 进行电化学测定另一种常用的酶活测定方法是电动势测定。
该方法用于测量电位差的变化以检测酶催化反应过程中电子的流动。
在氧化还原酶催化的反应中，测量体系中的电位差可以告诉我们酶的活性程度。
3. 进行放射性测定有些酶活性测定需要使用放射性示踪剂。
在DNA聚合酶催化下进行DNA复制实验中，可以使用放射性示踪剂来测量酶反应产物的数量。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.二、材料、仪器设备与试剂〔一〕材料；水稻或小麦叶片〔二〕仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯〔反应试管处照度为4000Lx〕；5.试管或指形管数支.〔三〕试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液〔pH7.8〕；2. 130mmol/L 甲硫氨酸〔Met〕溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片〔视需要定,去叶脉〕0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.2. 显色反应取5ml指形管〔要求透明度好〕4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂〔酶〕用量〔ml〕终浓度〔比色时〕0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min〔要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长〕.3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝<A ck－A E>×V/<A ck×0.5×W×V t>上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积〔ml〕Vt测定时样品用量〔ml〕W样鲜重〔g〕蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重. SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：〔V=3ml〕磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：<1> 0.05mol/L PBS：pH7.8<2> 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml<3> 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml<避光保存><4> 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml<5> 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml<避光保存>注：〔1〕对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管<2> 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：〔1〕5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml〔2〕0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：〔1〕0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A<0.2mmol/L的HAc溶液>—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中〔2〕0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中〔临用前配制〕〔3〕0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml〔临用前配制〕方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液〔5min值为500-800即可〕—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：<1> 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕 <2> 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：<1>以不加H2O2的50mmol/L的PBS〔pH7.0〕为空白把A240调零<2>50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min<连续读取5min>.20XX06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水.称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管〔做三个重复〕,加入25ml浓度为80％的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度,以80％的丙酮液为空白.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36〕也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰649Cx.c=<1000D470-2.05Ca-114Cb>/2452 抗氧化酶活性的定：〔2.5g样〕0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.8〕溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134〕. 取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液〔pH=7.8〕〔最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液.2.1丙二醛〔MDA〕的测定：20％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕；0.5% 硫代巴比妥酸〔TBA〕溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸〔TBA〕,用20％三氯乙酸〔TCA〕溶液溶解并定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕〔先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解〕；0.5ml酶液〔对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液〕〔做三个重复〕+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却〔至少30min〕――比色〔OD600、OD532、OD450〕.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕2.2超氧化物歧化酶〔SOD〕的测定：NBT<400ml>混合反应液:392mlPBS<Ph=7.8>,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液〔100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素〕.〔另配〕100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml<根>或0.02 ml<叶>粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度.2.3过氧化物酶〔POD〕的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.0〕溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml.0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS> + 0.02ml？？〔原来为0.01〕酶液〔根加0.05ml酶液〕〔对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液〕〔做三个重复〕,记录470nm处OD降低速度.将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕比色时加酶液,混合后即刻计时.2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量〔ml〕00.10.20.40.60.81.0H2O〔ml〕1.00.90.80.60.40.20冰乙酸〔ml〕2222222显色液〔ml〕3333333脯氨酸含量〔µl〕012468100.5ml酶液〔对照用0.5ml 80％乙醇代替〕〔做三个重复〕+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520.2.5可溶性蛋白的测定〔参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》〕牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml.90％乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水.？？？85％〔W/V〕磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水.考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中,加入85％〔W/V〕磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L.常温下可保存一个月.标准曲线的制作：配制0～100µg/ml血清白蛋白血液管号123456100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.020.040.060.080.10配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液管号789101112100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.20.40.60.81.00.1ml 酶液〔做三个重复〕+ 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色.2.6过氧化氢酶〔CAT〕的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到500ml.1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度.将每分钟OD 减少0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕2.7 抗坏血酸〔ASA〕的测定：〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125〕5％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml.10％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml.150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液的配制：100ml.44％H3PO4溶液的配制：250ml.4％2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml.3％FeCl3溶液的配制：100ml.首先标制作准曲线.粗酶液的提取：取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入15m 5％三氯乙酸〔TCA〕溶液〔最好是较冷的三氯乙酸〔TCA〕溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸〔ASA〕含量的测定.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕测定：0.2ml 粗酶液+ 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液+ 0.2ml H2O,混匀〔振荡〕,至少30秒后,再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸〔TCA〕溶液+ 0.4 ml 44％H3PO4溶液+ 0.4 ml 4％2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml 3％FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+ 2ml 0.3mol/L醋酸汞+ 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水〔每次10ml〕在摇动情况下冲洗2次.向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液,混匀,离心.上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗.离心后溶液与第一次离心液合并.向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止.1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽.〔参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院##植物生理研究所编〕.2.9天冬酰胺合成酶〔AS〕的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶〔AspAT〕的测定：3 硝酸还原酶<NR>的测定采用离体法：〔1g样〕〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29〕亚硝酸钠标准溶液〔1µg/ml〕：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml.0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml.3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml.1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中.0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中.0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液.0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L.提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液. 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液〔临用前配制〕. 首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液.摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色.以亚硝态氮〔μg〕为横坐标〔x〕,光密度值为纵坐标〔y〕绘标准曲线或建立回归方程.各试剂加入顺序管号1234567亚硝酸钠标准液<ml>00.20.40.81.21.62.0蒸馏水<ml>2.01.81.61.20.80.401％磺胺溶液<ml>44444440.2%α-萘胺<ml>4444444每管含NO2- <μg>00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶<NR>的测定.0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀〔对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替〕,在25℃水浴中保温30min.保温结束后立即加入1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2％a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度.根据回归方程计算.。
测定酶活的原理
测定酶活的原理
测定酶活的原理是基于酶与底物的特异性结合及催化活性。
一种常用的测定方法是通过测量底物转化为产物的速度来间接衡量酶的活性。
该方法的基本步骤包括：
1. 准备一定浓度的底物溶液，使其与酶反应时达到酶的最佳工作浓度。
2. 添加一定量的酶溶液到底物中，使它们充分混合。
3. 在一定时间间隔内，取出反应液样本，并停止反应，例如通过加入酸性或碱性溶液。
4. 采用一种合适的分析方法，如光度法、荧光法或电化学法，测定样本中产生的产物的浓度。
5. 根据样本中产物浓度的变化，计算出酶的活性，通常以单位时间内产生的产物量来表示。
此外，也可以采用其他方法来直接测定酶的活性，例如测定酶的催化反应速率常数（Kcat）、酶对底物的亲和力（Km）等。
这些方法需要更复杂的实验步骤和数据处理。
总的来说，测定酶活的原理就是利用酶对底物的催化作用，通过测量底物转化为产物的速度或其他相关参数来间接或直接衡量酶的活性水平。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
酶活性的测定
低温酶学
五、pH 对酶反应的影响
最适pH时的酶 最适 时的酶 活力最大
•最适 因酶而异， 最适pH因酶而异 最适 因酶而异， 多数酶在7.0左右 多数酶在 左右 •是酶的特性之一 是酶的特性之一
连续监测法所需仪器
仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、 高速冷冻离心机、微量移液器等
过氧化物酶活力的测定
操作步骤
一、酶液提取
分别精确 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约 精确 5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓 冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。 将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。
酶活性单位(U 酶活性单位 )
按照国际酶学会议 的规定，1个酶活 力单位是指在25℃ 、测量的最适条件 （指最适pH、温 度等）下，1分钟 内能引起1微摩尔 底物转化的酶量。
术语酶活力指的是 溶液或组织提取液 中总的酶单位数。
在酶的纯化过程中 常用到另一个术语 （specific activity） ）
比活
是指每毫克蛋白含有的酶单位数。 是指每毫克蛋白含有的酶单位数。随着 毫克蛋白含有的酶单位数 酶纯化的进行，比活会越来越高， 酶纯化的进行，比活会越来越高，当酶 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 所以比活是酶纯化程度的指标 指标。 所以比活是酶纯化程度的指标。
双分子反应、 双分子反应、一级反应
酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程 、
1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 年 和 提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－ 物浓度关系的数学方程式 ，即米 － 曼氏方程 简称米氏方程(Michaelis equation)。 式，简称米氏方程 。
酶活测定 原理
酶活测定原理
酶活测定是一种常用的实验方法，用于测定酶在一定条件下的活性。
酶活性是指酶在特定条件下催化底物转化的速率，是衡量酶功能的重要指标。
酶活测定的原理基于酶与其底物之间的专一性反应。
当酶与底物结合形成酶-底物复合物时，酶会使底物发生化学反应，产生产物。
产物的生成量与酶活性成正比，可以作为测定酶活性的指标。
常见的酶活测定方法包括光度法、荧光法、融合法、电化学法等。
其中，光度法是最常用的方法之一。
该方法通过测量底物的某种性质的变化来间接测定酶活性。
例如，可以根据底物的吸光度变化来测定酶活性。
在酶活测定实验中，常使用专一底物来与特定的酶反应，以增强实验的专一性和敏感性。
同时，为了控制实验条件，通常需要对温度、pH值等参数进行调整，以确保实验结果的准确性和可比性。
酶活测定在许多生物学和生物化学研究中起到了重要的作用。
通过测定酶的活性，可以评估酶的功能状态、酶活性的变化以及酶与底物之间的相互作用。
这对于深入理解生物过程、研究酶的功能以及开发新药物等方面具有重要意义。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活的测定方法
酶活测试及试剂1 木素过氧化物酶（Lip）：3ml反应体系：①0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0) 1.5mL；②10mmol/L藜芦醇1.0mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，25℃反应3min。
于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。
0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)：配0.1mol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为3.0。
（酒石酸：分子量75，0.1mol/L溶液为7.5g/L。
酒石酸钠：分子量230，0.1mol/L溶液为23g/L）10mmol/L藜芦醇：1.682g藜芦醇添加到1L水中即可（试剂藜芦（3,4-Dimethoxybenzyl alcohol）的分子量为168.19）10mmol/L H202（按1L计算）：称取1.13g过氧化氢试剂加入到1L纯水中即可（原试剂含30% H202）2 锰过氧化物酶（MnP）：3ml反应体系：① 0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5) 2.0mL；②15mmol/LMnSO4 0.5mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，37℃反应3min。
240nm测吸光值变化。
三价锰离子的吸光系数为8100 M−1 cm−1）0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5)：配0.05mol/L的琥珀酸和琥珀酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为4.5。
（琥珀酸：分子量118.09，0.05mol/L 溶液为5.9g/L。
琥珀酸钠：分子量270.15，0.05mol/L溶液为13.5g/L）15mmol/L MnSO4（按1L计算）：2.535g硫酸锰加入到1L纯水中溶解即可。
酶活DNS法测定
酶活DNS法测定一、将初筛的菌株接入100mL 种子培养基(250ml 三角瓶) 中, 25 ℃150r ·min - 1 培养24h（此步骤在初筛期省略）,取培养至对数生长期的种子液3mL 接入60mL 发酵培养基(250mL规格三角瓶)中发酵培养。
在30℃,150r ·min - 1 转速下培养144h ,8000r ·min - 14 ℃离心10min ,取上清用DNS 法测酶活。
二、标准曲线的制作精确称取100 ℃干燥至恒重的葡萄糖0. 10g ,加蒸馏水溶解并定容至100mL ,配成1.00mg ·mL - 1浓度的溶液,（按表1）在各比色管中加入溶液,沸水浴反应5min ,冷却加蒸馏水定容至25mL 后,以去离子水作为空白校正,用紫外分光光度计于550nm下测A值。
三、褐藻酸酶活力测定- DNS 法3 ,5-二硝基水杨酸法测定酶活力 ,利用比色法测定酶解后还原产物的生成量 ,以表示酶的活力。
具体为:吸取 1 mL 发酵液 ,2 mL 1 %褐藻酸钠溶液(pH7. 0 的 1/ 15N 的磷酸缓冲液配制) ,于试管中混匀 ,并且以 1 mL 蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。
置于40 摄氏度水浴糖化30 min ,取出后立即于沸水中煮沸 15 min 使酶失活。
冷却 ,过滤 ,吸取 1 mL 滤液于比色管中 ,加入 3 ,5-二硝基水杨酸显色剂3 mL,再沸水浴 15 min ,冷却 ,用蒸馏水定容至 25 mL ，混匀 ,在 550 nm 下测光密度(用蒸馏水调零) 。
酶活力单位定义为 ,在实验条件下 ,每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成 1μg还原糖所需的量。
4、菌株的产酶曲线的测定在复筛培养基中接入2mL 对数生长期的菌株一组,从48小时起，每隔18--24h测量发酵液的酶活力,并且测量发酵液于550nm下的A值,从而做出产酶曲线，得到最大酶活时间并为以后的测定提供参考时间。
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酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力。
作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。
即现测现用。
酶的活力是指酶催化底物进行反应的本领。
即酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的底物越大，则催化速度越快，活力越高。
酶活力的大小用酶活力单位（U，active unit）来表示。
1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制（SI）的反应速率相一致，推荐用Katal单位（也称催量，Kat）。
规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。
Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat。
把酶制剂的量和活力联系在一起，即为酶的比活力，它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少。
是用来度量酶纯度的指标。
在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小。
另外在实际的生产应用中，由于酶的性质不同，测定方法不同，很多酶的活力都有各自的惯用单位。
1、Folin法（第一法）测定蛋白酶活力目前所用到的蛋白酶的种类比较多。
根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。
在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。
定义：lg固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，l min水解酪素产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
具体测定方法见《QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法》及《SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法》。
表1几种酶促反应最佳条件2、胰酶活力测定胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物，主要是蛋白酶，脂酶和淀粉酶。
白色或淡黄色无定形粉末，有微弱的肉类物臭味。
溶于水呈微浑溶液，不溶于醇和醚。
遇酸、碱及热即丧失活力，pH＝7.8~8.7活性强。
水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀，经煮沸则迅速分解而变性。
胰酶用于原料皮脱灰后进行软化。
胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止成革粒面出现碎玻璃花纹，提高产品质量。
胰酶软化时，对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进躁剂与皮胶原的结合，以使成革具有柔软性、丰满性和良好的透气性。
酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓度过高，皮内胶原纤维损失大，致使成革松面。
为了达到正常的软化目的，必须在软化之前，测定其活力，以便确定其含量。
[醋酸盐指示剂法]（1）测定原理胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多。
一定量的胰酶，催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大。
与福林法蛋白酶活力不同的表示是，胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。
即在一定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量(g)，即胰酶能使酪蛋白转化的能力，又称酪蛋白转化力，以倍数来计量。
控制胰酶的最适条件pH＝8~9、T＝(40±1)℃，用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水解一定的时间后，用醋酸盐(或醋酸)指示剂调节反应液pH值达到酪蛋白的等电点(pH＝4.6)附近，末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出，而水解产物则不沉淀。
据此，则可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。
根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶的活力。
（2）试剂 1.24:50硼酸水溶液；0.1mo1/L。
NaOH水溶液；硼酸盐溶液，即1.24:50的H3BO4 20mL+2mL 0.1mo1/L NaOH；13.6％醋酸钠水溶液；60％醋酸溶液；醋酸盐缓冲液，即l 3.6％NaAc与60％HAc等体积混合。
（3）操作①配制底物酪蛋白称取(精确至0.0001g)0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加20mL蒸馏水，移取5mL0.1mo1/L NaOH，40℃水浴上加热约30min，搅拌使之溶解，移人100mL容量瓶，加5mL H3BO4溶液，并定容到刻度(pH＝8.5)。
②胰酶溶液的配制在研钵中称取(精确至0.0001g)胰酶0.1g(先加3~5滴研磨，再补加15~17滴)，加1mL硼酸盐溶液，浸泡3~5min，研磨到无大块胰酶，转移定容到500mL容量瓶，用H2O定容。
③粗测取5支带刻度的干燥试管，按表1-2所示进行。
依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL(10滴)，边滴边观察刚加人时是否产生白色沉淀，若缓冲溶液到了试管底部还不出现沉淀，说明酪蛋白已水解完全，有沉淀产生，证明酪蛋白没有全部水解，找出刚不产生沉淀的胰酶体积(mL)。
即是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量。
表2胰酶活力粗测步骤④精确测定在粗测刚不沉淀至刚沉淀之间移取酶液量，梯度为0.1mL。
例如表1-2中2.0mL刚沉淀，则取2.5~2.0mL。
按表1-3所示进行。
操作同上，找出刚好不产生沉淀胰酶的量，记为V。
表3胰酶活力精确测定步骤（4）计算胰酶活力X按照下式计算。
式中ml——酪蛋白的质量，g；m2——胰酶的质量，g；V——终点时管中胰酶溶液的体积，mL。
（5）注意事项：①酪蛋白、胰酶、水按比例加入以后一定要使其混合均匀，否则将造成试管底部的酪蛋白没有水解，使测定结果不准确。
②水浴加热，使整个液面都进入到水中。
③试管的粗细程度。
试管不可太粗或太细，既好摇匀又好观察，且粗细一致。
④配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20℃以下存放24h有效，室温高于20℃时胰酶4h有效，酪蛋白8h有效。
⑤产生白色沉淀必须是现加现看，不能放置过久，否则酪氨酸也沉淀出来了。
3.l还原糖法(Reducing sugar release)这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。
酶与底物在特定的条件(温度、PH值和底物浓度)下反应。
反应产物是还原糖，通过比色确定还原糖的数量，同时制作标准曲线。
酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量(mg或ml)。
3.2比色法(Colorimetric assaysⅠ)这种方法是对底物进行化学修饰，使其带有特定的可溶性生色基团物质，该生色基团能够产生特定颜色。
在酶与底物发生反应后，生色基团就被释放出来，用分光光度计可以测定颜色的深度，并制作标准曲线。
与已知标准酶的活性进行比较，计算出该酶的活性。
这种方法并不能区分内切酶和外切酶，但是通常认为这种方法更适合于测定外切酶。
目前采用这种方法测定所需的底物被工业上广泛采用。
3.3比色法(Colorimetric assnysⅠ)这种方法是通过生色基团结合酶作用底物分子的中间产物(sub-unit)来确定酶的活性。
如PNPG(para nitro phenyl)，该种物质与半乳糖结合形成一种乳糖(或葡萄糖)类似物。
在酶的作用下，释放出PNP，利用其它方法测定PNP的含量。
上述的方法通常只在生物化学实验室采用，饲料酶作用的底物是高分子量的物质，不宜采用。
3.4黏度法(Viscometric assays)这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物(控制pH值、温度等条件)的黏度的能力来确定酶的活性。
利用的底物主要有化学合成的底物(如CMC用于纤维素酶的测定)和自然提取的底物(如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定)。
测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较，来确定酶的活性。
这种方法的特点是通过降低底物的新度来反映酶的活性，这也正是酶在体内起作用的重要特征。
化学合成的底物的效果要优于自然提取的底物，因为化学合成的底物不利于酶的接触。
3.5免疫学法(Immunological methods)用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA法和免疫凝胶扩散法。
这两种方法是根据酶与抗体之间发生反应，然后ELISA法通过第二步反应，凝胶扩散法则通过印染过程来确定酶的活性(与标准添加酶的水平对比)。
这些方法是非常灵敏的，能够检测到极低水平的酶蛋白。
但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体，另外作为抗体能够与非酶蛋白质发生反应。
由于抗体本身所用的蛋白质是特定的，因此，由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。
另外，采用实验动物的敏感性也值得探讨。
3.6凝胶扩散法(Gel Diffusion methods)这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中，凝固之后，在凝胶上切开一条凿，倒入标准酶液和测试酶液。
培养一定时间后，在切开的凝胶周围能够看到水解区域，区域的大小与酶的含量成比例。