第十一章 荧光分析方法

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在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
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激发单重态与激发三重态的区别：

激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
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（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
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5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
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光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
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② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
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3. 酸度：
具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，
其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；
+
NH3
OH H
-
OH-
NH2
NH-
+
H+
pH<2
pH=7~12
pH>13
无荧光
蓝色荧光
无荧光
对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因 而也可使其荧光强度发生改变。
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4．荧光熄灭剂
荧光熄灭又称荧光淬灭 指荧光物质分子 与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧 光强度降低的现象。
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内转换 S2
S1 能 量
振动弛豫
内转换
系间跨越
吸 收
发 射 荧 光
T1 T2
外转换 磷 光
振动弛豫
S0
λ1
λ
2
λ 3 λ 2 分子内的光物理过程
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荧光与磷光的不同点：
跃迁时重度不同。荧光：S1→S0重度未变。 磷光：T1→S0重度改变。 辐射强度不同。荧光：强度较大，因从 S0→S1是自旋允许的，处于S1，S2态电子多， 因而荧光亦强。磷光：很弱，因为S0→T1是 自旋禁阻的，处于T1态电子少。 寿命不同。荧光：10-9~10-7s，寿命短。磷 光：10-4~100s，寿命稍长。
③ 外部能量转换（外转换 external conversion） 是溶液中的激发态分子与溶剂分子 或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并 以热能的形式释放能量的过程。外转换常发生在 第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向 基态转换的过程中。外转换会降低荧光强度。
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④ 体系间跨越(intersystem crossing) ：是处 于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多 重性发生变化的过程。 如S1→T1，S1上的受激电子发生自旋方向变化 而变成T1，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁。 如果两个电子能级态（如S1与T1)的振动能级相 重叠，则发生体系间跨越的几率将增大。 体系间跨越常见于含有重原子（如碘、溴等） 的有机分子。
第十一章
荧光分析方法
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有些物质受到光照射时，除吸收某种波长 的光之外还会发射出比原来所吸收光的波长 更长的光，这种现象称为光致发光。最常见 的光致发光现象是荧光和磷光。 荧光是物质分子接受光子能量被激发后， 从激发态的最低振动能级返回基态时发射出 的光。 荧光分析法是根据物质的荧光谱线位臵及 其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
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荧光分析法的特点
（1）灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
检测下限：0.1～0.1μg/cm-3
（2）选择性强
既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收 光谱；
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
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第一节荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程 在基态时，分子中的电子成对地填充在能量最低 的各轨道中。
选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。
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第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
荧光强度正比于被荧光物 质吸收的光强度
F K ' (I0 I )
I I 010
ECl
F K ' I 0 (1 10 ECl ) K ' I 0 (1 e2.3ECl )
(2.3ECl) 2 (2.3ECl)3 F K ' I 0 [2.3ECl ] 2! 3!
b 减弱分子的π电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄
灭，如 -COOH、 -NO2 、-C=O、 -NO、-SH、NHCOCH3、-X等；常为吸收电子取代基 c 对π电子共轭体系作用较小，如：-R、-SO3H、NH3+等，对荧光的影响也不明显。
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（三）荧光试剂
为了提高测定的灵敏度和选据性，常使弱荧光 物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物， 扩大荧光分析法的应用范围。 1．荧光胺 能与脂肪族和芳香族伯胺形成高度 荧光衍生物。
Ft F0e
Kt
F0和Ft分别是在激发时t＝0和激发后时间t时的荧光强度， K是衰减常数。
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假定在时间t＝τf时测得的Ft为F0的1/e， 即Ft＝(1／e)F0，则：
F0 e F0e
K f
K
1
f
F0
Ft
e
Kt
F0 t ln Ft f
如果以1nF0/Ft对t作图，直线斜率即为1/τf，此 可计算荧光寿命。

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（二）荧光的激发光谱和荧光光谱
1. 激发光谱
激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发 射某一波长荧光的相对效率。
绘制激发光谱曲线时，固定发射单色器在某一 波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射 光激发荧光物质，记灵荧光强度(F)对激发波长 (λex)的关系曲线，即激发光谱，其形状与吸收 光谱极为相似。
ECl 0.05, F 2.3K ' I 0ECl KC
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二、定量方法
1.工作曲线（校正曲线)法：用一定量的对照品配制成浓度不同的对照 品系列溶液（标准系列溶液），测得对照品 系列溶液的荧光强度，绘制荧光强度F对浓度 c的标准曲线。然后，测量同样条件供试品溶 液的荧光强度，对照标准曲线求出供试品溶 液的浓度。
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溶液荧光光谱通常具有如下特征：
（1）斯托克斯位移 光波长的现象。 原因：
荧光发射波长总是大于激发
①激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到 达第一激发单重态s1*的最低振动能级； ②荧光发射可能使激发态分子返回到基态的各个不 同振动能级．然后进一步损失能量；
③激发态分子与溶剂分子的相互作用。
振动弛豫过程很快，约10-12~10-14s
在其他去激发过程发生之前，电子已首先完成 了由较高能级跃迁至同一电子能级的最低振动能 级的振动弛豫过程。
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② 内部能量转换（内转换 internal conversion） 是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其 振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以 无辐射方式转移至低电子能级的过程。
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2. 荧光光谱：
荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分
的相对强度。
绘制发射光谱时，使激发光的波长和强度保持
不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相 应的荧光强度，记录荧光强度 (F)对发射波长 (λem)的关系曲线，即荧光光谱。 激发光谱和荧光光谱可用来鉴别荧光物质，而 且是选择测定波长的依据。
2．分子的刚性 在同样的长共轭分子中，分子的刚性越强，荧 光效率越大，荧光波长产生越长。
芴（φf=1.0）
联苯 （φf=0.2）
N N O Al H2O H2O
N OH
N
O
HO
2，2’-二羟基偶氮苯 （无荧光）
配合物（荧光）
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3． 取代基：
a 增加分子的π电子共轭程度，常使荧光效率提高，
荧光波长长移．如-NH2、 -OH、-OCH3、-NHR、CN、-NR2等；常为给电子取代基



激发三重态比激发单重态能级稍低一些。
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2. 荧光的产生 分子的去激发：分子中处于激发态的电 子以辐射（发光）跃迁方式或无辐射跃迁 方式回到基态。 辐射跃迁：荧光或磷光
无辐射跃迁：振动驰豫、内转移、体系 间跨越、外转移。
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（1）无辐射跃迁：