药学本科分子生物学实验指导

实验项目一：总RNA的提取（必做）

一、实验学时：6学时

二、实验目的

通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。

三、实验内容

利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。

四、实验要求

学会提取基因组RNA的方法和操作过程

提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用

0.1%DEPC处理。

五、实验所需仪器设备与试剂

仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等

试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2O 配制）、DEPC H2O

六、实验原理

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂

解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；

七、实验步骤

1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏

2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液

3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，

4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。准备冰盒。

5．戴口罩，戴手套。

6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，

7. 超声破碎仪破碎细胞

8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。

9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。

10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。

11．取新EP管。将上层水相（约600uL）加入新EP管，

12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。

13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。

14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。

15 .-70度保存提取的总RNA。

八、注意事项

1．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA 酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。

2．RNA提取用品准备：

1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。

2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。

3）用烘烤过的药勺称取试剂。

4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min。

实验结果:成功从植物中分离得到总RNA

实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做）

一、实验学时：6学时

二、实验目的

通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法

三、实验内容

1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。

2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA

四、实验要求

1、学会纯化植物总RNA的方法

2、学会定量、定性检测RNA的方法

五、实验所需仪器设备

移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计

六、实验原理

乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。反复利用乙醇沉淀RNA，可以起到纯化RNA的作用。

由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于

细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：

终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40

七、实验步骤

（一）总RNA的纯化

1．提取的总RNA，加入75%乙醇500uL洗涤。

2. 离心：4℃，7,500rpm，5min。

3．去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。

4 离心：4℃，7,500rpm，5min。

5．去上清液，空气干燥5-10分钟。（RNA不可以完全干燥，防止复溶的时候困难）

6. 加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。

（二）总RNA质量的检测（完整性的检测）

1．称取琼脂糖0.25 g，溶于盛有30ml的 50×TAE（电泳缓冲液）的锥形瓶中；母液为50×TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA·2H2O 配成1L 于4 ℃储备)，

2．将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化为准）；加热时应盖上盖子,以减少水份蒸发。

3．在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；

4．从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住；

5．向锥形瓶中加入10 mg/ml的溴化乙锭（EB）1 µl（终浓度0.5 µg/ml，EB插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种在紫外光下发光的络合物，容易观察）,轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液；

6．将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5 ~ 1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；

7．让凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿拔起；待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶。