无菌检查和微生物限度检查阳性菌种的管理
无菌实验室及要求与日常管理
无菌实验室的要求与日常管理一、实验室设施开展无菌检查及微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规X》及《药品生产质量管理规X》的要求，建立一个布局合理、使用方便、操作安全的无菌室，并且配有完善的实验设施和管理制度。
无菌检查、微生物限度检查以及接种室（接种对照菌、菌种传代）均应严格分开，具有危险性的毒株、毒素如破伤风梭菌、黄曲霉毒素的实验室需单独使用，以便控制防止传播。
（一）洁净实验室1.洁净室的布局1.1根据样品检验要求，一般应至少包括更衣缓冲系统、微生物限度检查室、无菌检查室、阳性菌室和物流通道。
1.2更衣系统应至少包括一更（含更鞋）、二更（含洗手）、缓冲以及人流走廊等。
1.3物流通道应考虑净污分流的布局，有条件的可设置污物走廊2.1净化级别：洁净走廊、检查室、阳性菌室应为一万级；其他房间应为十万级2.2气流组织：阳性菌室对走廊呈负压，走廊对缓冲有5Pa的正压；阳性菌室全排风2.3电气控制：控制开关外置；设置通讯系统3.结构与要求：无菌洁净室不宜设在底层，防潮、防霉、采光好，远离交通干道，厕所及污染区，面积不超过10m2，高度不超过2.4m，由两个缓冲间、操作间组成。
操作间缓冲间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
无菌室内应六面光滑平整，无缝隙，不起灰，不落尘，耐腐蚀，易清洗，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，操作间不得安装下水道。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，采光面积要大，光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。
缓冲间和操作间应装有紫外线杀菌灯（2－25w/m3）''用于空气消毒。
紫外线波长200－300nm者具有杀菌作用，其中以265－266nm杀菌作用最强，这与DNA的吸收光谱X 围一致，其杀菌机理可能是在细菌细胞DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰细菌细胞DNA复制，导致细菌变异死亡。
紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳，每次开灯照射时间为30min。
微生物限度及无菌检查
计数方法适用性检查
1.供试液的制备
u 水溶性供试品 u 非水溶性供试品：可适量加入如聚山梨酯80等表面活性剂，加入量及加 入的试剂均需进行验证，以证明其无明显抑菌性。 u 油性供试品：十四烷酸异丙酯或其它无抑菌性的表面活性剂。 u 肠溶供试品：一般肠溶制剂用pH8.6磷酸盐缓冲液，结肠制剂用pH7.6磷 酸盐缓冲液。
阳性对照组：相当于1g或1ml的供试液+不大于 100cfu的目标菌
阴性对照组：与供试液同体积的稀释液
耐胆盐格兰阴性菌检查
1.供试液制备和预培养：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，放置20~25℃培养 约2小时内。 2.定性试验：取1:10的供试液10ml，加至肠道菌增菌培养基中（加入量应经过验证），此方法 适用于标准为不得检出的供试品。 3.定量试验：三管法，同上述MPN法，每级稀释级均取1ml加入一管培养基中。 4.选择与分离：取上述培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上。 5.结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，定性试验判断是否检出；定量试验 则对应培养管，查表确定供试品中含有耐胆盐格兰阴性菌的可能菌数。
概要
实验室 管理要
求
菌种管 理
培养基 适用性 检查
微生物 限度检
查
无菌检 查
总体要求： 各功能区域应明确标识，特别是菌种储藏室、污染物处理
区、阳性菌室等存在生物安全危害的区域。
洁净室要求： 洁净室作为药品微生物实验室的核心区域，应远离交通干道、厕所及污染区，
应选上、下水道及其他安装适宜的位置。 洁净室与各配套功能区，包括清洗、培养基配制、消毒/灭菌、灭菌物品存放和
洁净度级 过滤完整性 别
气流组织
A级
B级
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案编号：无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室空气净化系统验证方案验证方案起草人：日期：验证方案批准人：日期：企业名称年月目录1．引言1．1概述1．2验证的目的2．验证标准3．检验室的自净器和层流罩安装确认4．检验室的自净器和层流罩运行确认4．1风速测定4．2压差测定4．3温湿度测定5．洁净度测定5．1悬浮粒子测定5．2沉降菌测定6．验证结果及评价7．责任8．时间安排1．引言1．1概述无菌检验室是专供医疗器械无菌检验用，微生物限度检验室是专供医疗器械微生物检验用，阳性对照检验室是专供医疗器械菌检时阳性对照实验用，这三个实验室专用。
,检验室顶棚安装自净器一台,向室内送洁净空气,洁净级别为10000级,室内还安装层流罩一个,层流罩下洁净级别为100级。
1．2验证的目的1.2.1检查并确认检验室的自净器层流罩的安装符合设计要求。
1.2.2检测并确认检验室的自净器层流罩的运行性能应能达到药品菌检要求及验证标准。
1.2.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
3．检验室的自净器和层流罩安装确认3．1部件安装确认检查人: 日期:3．2高效过滤器的检漏测试采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及内边框来回扫描。
检漏测试结果记录在自净器和层流罩运行确认记录上。
4．自净器和层流罩的运行确认4．1风速测定采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。
层流罩测定8个点，求平均风速。
4．2压差测定采用微压表测定4．3温度、相对湿度测定采用干湿球温度计测定自净器和层流罩测试人: 日期:结果分析及评价:5．洁净度的测定5．1悬浮粒子测定5.1.1方法:采用尘埃粒子计数器,每个检验操作室测试3次,每个检验操作室采样点2个,层流罩下采样点4个,采样点的高度离地面1m。
求平均值。
悬浮粒子测定在自净器和层流罩运行30分钟后进行。
微生物限度检查室管理规程
微生物限度检查室管理规程一、目的规范微生物限度检查室洁净区、一般区的管理。
二、适用范围适用于微生物限度检查室的管理。
三、内容1微生物限度检查室准备间1.1准备间应保持清洁，严禁吸烟和饮食。
1.1.1工作人员进入微生物限度检查室准备间，必须穿戴一般工作服，离开时脱去，放于指定地点，一般工作服按《一般生产区工作服清洁操作规程》定期清洁。
1.1.2工作人员操作前后或离开准备间，必须用肥皂或0.1%新洁尔灭洗手。
1.1.3严防一切器材和培养基被污染，已污染的应立即停止使用并作相应的处理，保证实验的准确性。
1.1.4工作衣、帽、口罩等受到菌液污染时，应立即脱去，湿热灭菌后洗涤。
如有菌液污染手部，应先用75%的乙醇棉球擦拭后，浸入0.1%新洁尔灭消毒液内片刻，再用肥皂及清水彻底洗刷干净。
1.1.5接种环（针）每次使用前后，必须通过酒精灯外焰灼烧灭菌，待冷却后，方可接种培养物。
1.1.6废弃培养物和带菌的实验用品应先进行湿热灭菌，再清洗干燥。
1.1.7阳性菌专用的无菌工作服使用后应先进行湿热灭菌后，按《微生物限度检查室清洁操作规程》进行洗涤，再经湿热灭菌后备用。
1.2微生物限度检查室洁净区1.2.1洁净区内应有消毒设施、消毒毛巾及挂衣钩等。
检测室有放置试验用品的工作台和实验操作有关的仪器，室内应设置适当的日光灯。
1.2.2检测室内备好消毒液、酒精灯、镊子、消毒棉球、打火机及天平等。
1.2.3微生物限度检查室洁净区应定期检查空气洁净度。
1.2.4出入微生物限度检查室洁净区的管理规定1.2.5一切物品按要求经消毒或灭菌程序处理后，方可传入微生物限度检查室洁净区。
1.3 物品进出规定进：清除外包装,放进传递窗后关闭传递窗（阳性菌传递窗在物品放入前开启风机）。
开启紫外灯照射消毒30分钟后，从传递窗另一侧取进。
出：检验后物品放入传递窗，关闭传递窗，再从传递窗另一侧取出。
1.4 人员进出规定进：准备区用肥皂洗净手，脱一般区工作鞋，进到缓冲间从鞋柜取出并穿上已消毒的工作鞋，脱一般区工作服，进入一更换上洁净拖鞋，洗手液洗手烘干。
无菌、微生物限度检查及方法验证
菌种保藏步骤
① 干燥菌种复苏，划平板 ② 挑选特征典型的纯菌菌落；（制菌悬液使用） ③ 确定保藏的合格菌体形态； ④ 选择最适宜的保存方法，定期对保藏菌种进行检查，观察是否 发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行
移种。
菌种的接收
① 标准菌种一般是玻璃安平装的冻干粉剂 ② 接收时应检查名称/数量和完整性。 ③ 贴好标签后储存于-20℃ ④ 一般安平冻干品可在5年之内使用 ⑤ 使用时应按（菌种保藏中心提供的）相关资料的要求进行复溶、
•严格分开的无菌检查、微生物限度检查、无菌采样室。 •菌种处理与微生物鉴别室有局部百级措施。 •各自分开的抗生素微生物检定、细菌内毒素检查、抗菌作用测定半无菌 室。 •培养室（一般为100，000级）。 •试液及培养基的配制室。 •灭菌室。
•实验器皿洗涤、烘干室。
•人员办公休闲室。 •实验用品、易耗品储藏室。
• 优点：操作简单，使用方便，不需特殊设备，对大多数微生物都适 用。 • 缺点：保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。 • 此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌 种的短期保藏。
微生物实验室的质量管理
清洁、消毒剂的管理
•品种：5~20倍稀释的碘伏水溶液 •0.10%新洁尔灭容易 •1:50的84消毒液
•75%乙醇溶液
•3%碘酒溶液 •5%石碳酸（来苏儿）消毒溶液 •2%戊二醛水溶液 •尼泊金酒精消毒液等 •应定期更换消毒剂品种，按标准准确配制。
微生物实验室的质量管理
□无菌操作间内禁放杂物，并应制定地面、门窗、墙壁、设施等的定 期清洁、灭菌规程。
•无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区与工作台面，必须进行洁净度验 证。微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。
微生物实验室管理条例
常用菌株的保存
大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44102〕 大肠埃希菌 〔 〕 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 金黄色葡萄球菌 〔 26003〕 〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98001〕 白色念珠菌 〔 〕 黑曲霉（ 黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC(F)98003〕 ） 〕 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella apecies)〔CMCC(B) 乙型副伤寒沙门菌 〔 50094〕 〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 铜绿假单胞菌 〔 10104〕 〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 生孢梭菌 〔 64941〕。 〕 常用上述菌株进行培养基灵敏度检查和检查方法的验证。 常用上述菌株进行培养基灵敏度检查和检查方法的验证。 菌株可用普通肉水加15%甘油冻存于 甘油冻存于-20℃或-70℃冰箱。试验用 菌株可用普通肉水加 甘油冻存于 ℃ ℃冰箱。 对照菌株可保存于营养琼脂斜面，存于4℃ 对照菌株可保存于营养琼脂斜面，存于 ℃～8℃。试验前对菌种进 ℃ 行传代培养，对照菌株必须使用18～ 小时的新鲜培养物 小时的新鲜培养物。 行传代培养，对照菌株必须使用 ～24小时的新鲜培养物。一旦发 现对照菌株污染或存在问题，则应立即更换。 现对照菌株污染或存在问题，则应立即更换。
4. 检验者接受检品后，首先对检验卡与样品中的品名、 批号、生产厂家、检验依据、检验项目、包装、数 量、编号等进行核对，确认无误后，按照质量标准 及其方法和有关SOP进行检验，并按要求记录。 5. 检验结果的复检，应由检验人员申述理由，查找原 因，经科室主任同意后方可进行。检验结果不合格 的项目或结果处于边缘的项目，除另有规定以一次 检验结果为准不得复检外，一般应予复检。必要时 室主任可指定他人进行复检。
洁净实验室的要求与日常管理
厌倦了城市中的繁华,想在这绿树丛中寻找一份清静。无论过程怎么样艰辛
5.2 当温度、相对湿度和照度等指标出现 符合时，洁净室可不必停用，但应及时修复空 系统（或更换照明装置），使其符合规定。
二、实验室管理：
为保证实验有序进行，实验室必须制定一系 列实验室管理制度。
（一）实验室要求：
1 实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室 内严禁吸烟和饮食。
菌机理可能是在细菌细胞 DNA 中引起胸腺嘧啶双 聚体形成，从而干扰细菌细胞 DNA 复制，导致细 菌变异死亡。紫外线杀菌灯 1m 以内距离杀菌效 果最佳，每次开灯照射时间为 30min。应定期检 查紫外线灯辐射强度，不得低于 70μW·cm-21m 距离。其缺点是穿透力 弱，一张纸板可以阻碍光的透过，不能穿透固体
开展无菌检查及微生物限度检查，首先要 照《药品检验所实验室质量管理规范》及《药 生产质量管理规范》的要求，建立一个布局合 使用方便、操作安全的无菌室，并且配有完善 实验设施和管理制度。无菌检查、微生物限度 查以及接种室（接种对照菌、菌种传代）均应 格分开，具有危险性的毒株、毒素如破伤风梭
洁净实验室 1.洁净室的布局
4.温度、湿度
厌倦了城市中的繁华,想在这绿树丛中寻找一份清静。无论过程怎么样艰辛
无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀
菌灯的杀菌效果，故温度最好控制在
25±2℃，相对湿度 40－60％。操作
净化台的洁净空气应保持对环境形成正压，不
5.操作间
于 49Pa。
无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及 调温装置。洁净度要求：净化台洁净度为 100 级，
2 实验人员必须穿戴衣帽，服经常洗涤、消 毒、保持清洁。
无菌检查和微生物限度检查阳性菌种的管理
无菌检查和微生物限度检查阳性菌种的管理一、实验室要求：1.实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室内严禁吸烟和饮食。
2.实验人员必须穿戴工作衣帽，工作服经常洗涤、消毒、保持清洁。
3.操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。
4.发生菌液污染台面或地面，应立即用3%甲醛或5%碳酸等消毒液由外向内倾覆其上，1小时后再擦拭，如为破伤风梭菌，则应隔夜后再擦洗。
5.工作衣、帽、口罩受到菌液污染时，应立即脱下使污染部位包裹在内部，高压灭菌后再清洗。
6.如有传染性培养物污染手部，应先用75%乙醇棉球擦拭，再浸入01新洁尔灭消毒液内泡手，然后再用肥皂及清水彻底洗干净。
7.接种环(针)，每次使用前后，必须通过火焰灭菌，冷却后方可接种培养物，接种带有蜡质、油质的培养物或菌苔残留多时，不应立即在火焰上灼烧，应先在内焰里将油质培养物烘干后再移至火焰上灭菌，以免活菌外溅污染环境及感染操作者。
8.带菌的吸管应浸泡在5%甲酚消毒液内24h后取出清洗，带菌的试管或培养物应在121℃高压灭菌后再取出清洗。
9.在接种霉菌、放线菌时应在铺有浸过消毒液的纱布上操作，防止孢子散落传播。
10.凡带活菌的物品，必须消毒后才能清洗，严禁污染下水道。
二、无菌操作要求:无菌操作是指在无菌的环境条件下，使用无菌器材，防止微生物污染的操作技术。
即保持待检样品在操作时不被污染，又要防止被检的微生物及阳性对照菌在操作中污染环境或感染操作人员。
从事无菌及微生物操作的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的学习及培训才具备上岗操作的资格，微生物专业检验人员也不应该频繁地变换工作岗位。
1.无菌室应每次使用前后用0.1%新洁尔灭消毒液或2%甲醛液擦拭工作台面及可能污染的死角，湿拖地面，打开无菌空气过滤器及超净工作台的开关30分钟，紫外线杀菌灯照射1小时。
2.操作人员用肥皂洗手后进入缓冲间换拖鞋，用75%乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。
将所需物品剥去牛皮纸及外包装，从传递窗移入操作间，再用01新洁尔灭泡手后进入操作间，在乙醇(或煤气灯)火焰区(火焰高度3-5cm)操作。
无菌检测和微生物限度常见问题
无菌检测和微生物限度常见问题1、问:做无菌验证时阳性对照菌是怎么加入的？可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入吗？答:严格的说是要在最后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性～但是滤器如果可以提供滤膜对于阳性菌的充分截留的话在最后的培养体系中加入阳性菌也是未尝不可的.如果供试品没有抑菌作用,可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入,摇匀如果供试品有抑菌作用,正如安哥洛卡所讲,在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌,摇匀,抽虑,加培养基.无菌检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。
只是注意：1、避免人为污染。
2、阳性菌加入数量2、问:离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么?答:原理:利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离;操作:取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量.注意事项:真菌由于沉降系数比较小,500r/min离心5min，黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离心沉淀法.3、问:稳定性实验的微生物及无菌检查,是否每次都要做?答:是;原因:一实验期内可能会染菌;二灭菌后微生物并不是就彻底"死亡",有些成为碎片,这些碎片在一定的条件和时间下,可以自我修复而复活.三稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有问题。
4、问:眼部给药制剂如何做卫生学检验?答:液体制剂:无菌检查;半固体及固体制剂:微生物限度检查5、问:滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查?答:一滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品,故其成品的微生物质量应要求统一为无菌;所以,滴眼剂产品的临床合理用药应与其卫生标准要求一致,即将其微生物质量要求统一为无菌,显然更为合理;二滴眼剂的微生物质量要求为无菌,是与各国药典在滴眼剂要求上的统一,及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善等方面看,滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要性。
无菌检验室、微生物限度检验室、阳性对照室验证方案
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室黑曲霉对照检验室验证方案沈阳上善医疗器械有限公司2011年月目录１.验证的目的２.验证小组成员３.验证小组分工４.验证依据５.标准内容６.检验室的自净器和超净台安装确认7.自净器和超净台的运行确认8.洁净度的测定9.验证结果及评价：10.责任1．验证的目的1.1检查并确认检验室的自净器和超净台的安装符合设计要求。
1.2检测并确认检验室的自净器和超净台的运行性能应能达到检验要求及验证标准。
1.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
3验证小组分工：3.1组长：负责审核验证方案是否可行。
3.2副组长：负责组织实施验证、审核测试结果、评价及结论，负责验证报告的会签与批准。
3.3组员：负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室、黑曲霉对照检验室的验证过程；提供监测结果。
3.4组员：负责无菌室正常管理。
4.验证依据：GB—T16294—1996 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规范5．验证标准6．检验室的自净器和超净台安装确认6.1部件安装确认6.2高效过滤器的检漏测试采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及内边框来回扫描。
检漏测试结果记录在自净器和超净台运行确认记录上。
7．自净器和超净台的运行确认7.1风速测定采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。
超净台测定8个点，求平均风速。
7.2压差测定采用微压表测定7.3温度、相对湿度测定采用温湿度记录仪测定7.4结果记录如下：无菌检验室结果分析及评价:8．洁净度的测定8.1尘埃粒子数测定采用尘埃粒子计数器,每个检验操作室测试3次,每个检验操作室采样点2个,超净台采样点4个,采样点的高度离地面1m。
求平均值。
尘埃粒子数测定在自净器和超净台运行30分钟后进行。
尘埃粒子数测试记录( )平均值0.5μm 个, 5μm1 个平均值0.5μm 个, 5μm 个测试人: 日期:结果分析及评价:8.2沉降菌测定医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》有关要求采用φ90mm培养皿，将培养皿按要求放置后，打开平皿盖，使培养基表面暴露30分钟后，将平皿盖盖上，然后在30—35℃下培养48小时后计数。
中检所无菌检查和微生物限度检查操作规范
中检所无菌检查和微生物限度检查操作规范无菌检查和微生物限度检查操作规范（中国药品生物制品检定所）一、无菌室的要求：无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。
建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。
无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。
操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。
无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。
无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。
操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。
无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。
用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。
无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。
用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。
二、培养基的准备1、培养基的制备：配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。
再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。
2、培养基灵敏度试验：培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。
阳性菌管理
一）实验室要求：1实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室内严禁吸烟和饮食。
2实验人员必须穿戴工作衣帽，工作服经常洗涤、消毒、保持清洁。
3操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。
4发生菌液污染台面或地面，应立即用3％甲醛或5％碳酸等消毒液由外向内倾覆其上，1小时后再擦拭，如为破伤风梭菌，则应隔夜后再擦洗。
5工作衣、帽、口罩受到菌液污染时，应立即脱下使污染部位包裹在内部，高压灭菌后再清洗。
6如有传染性培养物污染手部，应先用75％乙醇棉球擦拭，再浸入01新洁尔灭消毒液内泡手，然后再用肥皂及清水彻底洗干净。
7接种环（针），每次使用前后，必须通过火焰灭菌，冷却后方可接种培养物，接种带有蜡质、油质的培养物或菌苔残留多时，不应立即在火焰上灼烧，应先在内焰里将油质培养物烘干后再移至火焰上灭菌，以免活菌外溅污染环境及感染操作者。
8带菌的吸管应浸泡在5％甲酚消毒液内24h后取出清洗，带菌的试管或培养物应在121℃高压灭菌后再取出清洗。
9在接种霉菌、放线菌时应在铺有浸过消毒液的纱布上操作，防止孢子散落传播。
10凡带活菌的物品，必须消毒后才能清洗，严禁污染下水道。
（二）无菌操作要求：无菌操作是指在无菌的环境条件下，使用无菌器材，防止微生物污染的操作技术。
即保持待检样品在操作时不被污染，又要防止被检的微生物及阳性对照菌在操作中污染环境或感染操作人员。
从事无菌及微生物操作的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的学习及培训才具备上岗操作的资格，微生物专业检验人员也不应该频繁地变换工作岗位。
1无菌室应每次使用前后用01新洁尔灭消毒液或2％甲醛液擦拭工作台面及可能污染的死角，湿拖地面，打开无菌空气过滤器及超净工作台的开关30分钟，紫外线杀菌灯照射1小时。
2操作人员用肥皂洗手后进入缓冲间换拖鞋，用75％乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。
将所需物品剥去牛皮纸及外包装，从传递窗移入操作间，再用01新洁尔灭泡手后进入操作间，在乙醇（或煤气灯）火焰区（火焰高度3－5cm）操作。
医疗器械产品无菌和微生物限度检查法-华渤文
（1）应制定对所承担的工作进行连续评估的程序 （2）应定期对实验环境的洁净度、培养基的适用性、灭菌方法、菌株纯度
和活性(包括性能）、试剂的质量等进行监控并详细记录 （3）应定期对检测人员进行技术考核 （4）应对重要的检验设备如自动化检验仪器等进行比对
外部质量控制
应参加与检测范围相关的国家能力验证或实验室之间的比对实验来评估 检测水平，通过参加外部质量评估来评定检测结果的偏差
一、微生物实验室质量管理指导原则
9.污染废弃物处理
污染废弃物
废弃样品 过期（或失效）培养基 有害废弃物
处理原则
（1）减少检查环境和材料的污染 （2）符合国家环境和健康安全规定
针对类似于带菌培养物溢出的意外事件制定处理规程
一、微生物实验室质量管理指导原则
10.检测结果的质量保证和检测的质量控制
一、微生物实验室质量管理指导原则
6.设备
一般要求
（1）微生物实验室设备配备
与检验能力和工作量相适应 类型、测量范围和准确度等级
应满足检验所采用标准的要求
（2）设备的安装和布局
便于操作 易于维护 易于清洁和校准 保持清洁 保持良好工作状态
（3）唯一标识
用于试验的每台仪器、设备应该有 唯一标识
一、微生物实验室质量管理指导原则
2.培养基
培养基的贮藏
（1）自配的培养基应标记名称、批号、配制日期、制备人等信 息，并在已验证的条件下贮藏
（2）商品化的成品培养基标签上应标有名称、批号、生产日期、 失效期及培养基的有关特性，生产商和使用者应根据培养基 使用说明书上的要求进行贮藏
（3）培养基灭菌后不得贮藏在髙压灭菌器中，琼脂培养基不得在 0℃或 0℃以下存放
药品生产监督质量控制实验室管理检查重点内容和检查方法指导原则
药品生产监督质量控制实验室管理检查重点内容和检查方法指导原则1.质量控制实验室布局检查方法：结合有关验证方案、记录，现场检查实验室布局和设施。
检查内容：1.1质量控制实验室是否与生产区分开；设在生产区内中间控制实验室是否对生产也无不利影响，中间控制检验结果的准确性是否受生产操作的影响。
1.2质量控制实验室是否有足够的空间用于样品处置、检验和实验用物料、留样、稳定考察样品存放及记录的保存。
1.3生物检定、微生物和放射性同位素的实验室是否彼此分开；有菌实验室（微生物限度检查、菌种传代、阳性菌接种）是否与无菌检查室分开。
1.4阳性菌室是否配备生物安全柜，是否设置直排风保持与其他区域的负压。
1.5 是否设置专门的仪器室，使灵敏度高的仪器免受静电、震动、潮湿、高温或者其他外界因素影响。
1.6产生挥发性气体或者高温的设备是否设置局部排风。
1.7用于滴定液标定储存、稳定性考察药品贮存等对温湿度有特殊要求的房间或者设备，温湿度及其控制精度范围是否符合《中国药典》的规定。
2.质量控制实验室文件管理2.1文件种类检查方法：抽查物料、成品质量标准文件，审查内容是否完整、正确，检查相关检验记录看质量标准是否被正确执行。
检查内容：质量控制实验室是否建立下列详细文件：2.1.1质量标准；2.1.2取样操作规程和记录，检验操作规程和检验记录2.1.3试剂、试液、培养基配制操作规程和记录，滴定液配制标定操作规程和和记录2.1.4检验仪器操作、清洁、维护、校准的操作规程和记录；2.1.5检验报告或证书，必要的环境监测操作规程、记录和报告；必要的检验方法验证报告和记录。
2.2文件、记录管理的基本要求检查方法：选取部分产品、物料，结合现场检查审核相关文件和检验记录。
检查内容：2.2.1药品的每批检验记录是否包括中间产品、待包装产品和成品的质量检验记录，记录是否可以追溯该批药品所有相关的质量检验情况；2.2.2 是否用便于趋势分析的方法保存某些数据（如检验数据、环境监测数据、制药用水的微生物监测数据）；2.2.3 记录所有计算均应当严格核对，记录内容是否经过复核，确保结果与记录一致。
微生物限度检测室和阳性对照室管理规程
1.2.2.3人员进出程序：
1.2.2.3.1进：第二更衣间脱外衣，换洁净拖鞋后，洗手烘干，进入第三更衣间穿戴洁净服，进入缓冲间酒精消毒，进入微检室。
1.2.2.3.2出：出到第三更衣间脱洁净服，叠放整齐后放收纳箱中待清洗。到第二更衣间洗手烘干，将洁净拖鞋放鞋架，穿工作鞋和工作服后出。
1.2.3.4有创伤、皮肤病，刚拔过牙等情况的人员，痊愈前不得进行操作。注意个人卫生，常洗澡、换衣，经常洗手、洗头、剪指甲，男性尽量每日刮胡须。保持身体清洁。戒除操作中或洗手后摸口、鼻、眼、脸、头发，挖鼻孔，搔痒等不良卫生习惯，以防自身感染和交叉污染。
4.3微生物限度检查室或阳性对照室清洁程序。
4.3.1每周75%酒精擦拭后臭氧灭菌。
目的：建立一个微生物限度检测室和阳性对照室的管理规程，使微生物限度检测室和阳性对照室使用色谱柱规范化、制度化，确保工作有效性与安全性。
范围：被授权的化验员必须遵守此管理规程。
责任：检测中心化验员、检测中心主任。
内容：
1内容：每次操作实验结束后清洗，配套整齐后放入专用布袋内，121℃高压灭菌30分钟，存入无菌的灭菌罐内，备用。并填写记录。在实验中如被污染应及时清洗灭菌，破损应及时更换并清洗灭菌。
1.2.2.4穿戴洁净服程序：
1.2.2.4.1先戴帽子，以站立姿势穿洁净服，应避免洁净服接触地面，然后罩口罩，最后穿上无菌鞋。
1.2.2.4.2微生物限度检查室或阳性对照室一切专用物品不得随意拿出；无菌操作中不得外出（如上厕所、接电话、聊天、接待外人等）；进出微生物限度检查室或阳性对照室要随手关门；不能通过传递窗将大的物品搬进微生物限度检查室或阳性对照室时，先要在一般环境中擦洗干净后在缓冲区内进行进一步清洁、消毒之后再搬进微生物限度检查室或阳性对照室；不同洁净室有各自专用的清洁用品，不得混用。
检定菌管理规定
1 主题内容与适用范围本文件规定了公司化验室检定菌的购入、保藏、复活、传代、使用方面管理要求。
本文件适用于公司化验室抗生素微生物检定、无菌检查、微生物限度检查及微青测定用检定菌的管理。
2 引用标准ICH Q7a 2000年11月《药品生产质量管理规范》 2010年修订《兽药生产质量管理规范》 2002年6月3 术语检定菌：指生物测定中使用的各种菌种。
4 职责4.1 质监中心在满足检测要求的情况下负责向各化验室提供检定菌斜面。
4.2 各化验室负责所用检定菌的贮存、传代与使用。
4.3 质量保证部负责各化验室检定菌的使用过程的监督管理。
5 管理规定5.1 质监中心根据使用需要，做出检定菌采购计划以书面形式报领导同意后，安排购买。
5.2购进的检定菌主要来自中检所医学菌种保藏中心(China Medical Culture Collection，CMCC)的系列，或美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)系列等国际法定菌种保藏机构。
此外还有来自其他保藏单位或同行相互转让的有关菌种。
5.3购进检定菌首先进行验收，应检查菌种的来源，菌种的菌株名称及编号、菌种的包装及外观，凡包装破损或其它不符合要求的应予拒收，验收合格后要在菌种传代记录上进行登记，购进发票应复印保留，各单位领用要有发放记录。
5.4 各化验室领入检定菌应指定专人管理建立台帐，用于传代的冷冻干燥管及检定菌斜面登入菌种传代记录；用于检验的检定菌斜面登入菌种发放与使用记录。
检定菌置冰箱内上锁保存，且与其它物品分开放置，保存温度按瓶签上的规定，没有规定保存温度的检定菌冷冻干燥管、菌种斜面置2～8℃冰箱中保藏。
5.5 购进的冷冻干燥菌种管使用时，首先需复活，按菌种保藏中心提供的相关资料的要求进行复溶、培养和保存。
5.6 菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)。
质监中心为各单位提供检定菌斜面，各使用单位要根据各菌种的要求，制订贮存期限与传代期限，各化验室指定专人定期进行传代，贴上检定菌标签，格式见附件，做好菌种传代记录。
微生物限度检查若干问题
微生物限度检查若干问题微生物限度检查若干问题微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，是药品微生物学检验的重要容之一。
中国药典2000年版二部附录ⅪJ“微生物限度检查法”、《中国药品检验标准操作规》（2000年版）及参考书《药品微生物学检验手册》均做了详尽的阐述。
下面对几个比较重要的问题，谈一点工作学习体会，仅供参考。
一、实验室要求开展微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规》及《药品生产质量管理规》的要求，建立一个布局合理，使用方便，操作安全的实验室，并且配有完善的实验设施和管理制度。
微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接种室（接种对照菌及菌种传代）均应严格分开。
（一）无菌室：1结构与要求：最好设在二楼以上（防潮、防霉、采光好），面积不超过10平方米，高度不超过24米，由2个缓冲间和操作间组成。
缓冲间与操作间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
无菌室应六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙、无死角。
无菌室光照应不低于300勒克斯，缓冲间和操作间均应装有紫外线杀菌灯2-25w/m3作空气消毒用。
紫外线波长200-300nm者''具有杀菌作用，其中以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱围一致。
其杀菌机理可能是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰DNA复制，导致细菌变异或死亡。
紫外线杀菌灯1m以距离杀菌效果最佳''每次开灯照射时间为20min。
其缺点：穿透力弱，一纸可以挡住，不能穿透固体物，对人的皮肤眼睛有损伤，所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。
2温度、湿度：温度应控制在18-26℃''相对湿度40-60''操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比''不低于49Pa。
3操作间：应安装空气除菌过滤层流装置，操作间不应安装下水道，洁净度不低于1万级，净化工作台局部应为100级。
菌种管理制度
菌种管理制度目的：为保证药品生产、检定和科研的质量，加强对检验用菌种的科学管理，特制定本制度。
范围：适用于本厂检验用菌种的管理。
职责：菌种管理人对菌种的申购、保藏、检查、发放和销毁，检验员对菌种的使用和操作安全负责，对本制度的实施监督负责。
定义：检验用菌种适用于无菌检查、微生物限度检查，评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果，确认灭菌工艺效果，检验的方法验证、培养基的促生长能力检查、样品检验时的阳性对照等标准菌株。
一代：将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即成为一代。
程序：1总则检验用菌种应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性相应的等效的商业派生菌株。
2检验用菌种管理由QC部指定人负责。
3根据需要提供所需菌种，并监督其使用。
4负责菌种的申购、保藏、定期传代、使用和销毁。
5负责填写菌种记录2菌种的接收写明菌种的名称、编号、批号、接收日期、来源。
3菌种的保藏与传代标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
冻干管开启后可制备菌种甘油管和转种斜面。
斜面菌种1-3个月传代一次，传代代数不能超过5代，传代应及时写记录。
除另有规定外，菌种斜面和菌液应保存于2-8度保存。
冻干菌种一旦解冻制备工作菌种后，不得重新冷冻和再次使用。
保藏的菌种都应有明显的标志：菌种名称、接种日期、传代数。
每个工作日检查一次菌种冰箱的温度，长假期每隔数天检查一次。
菌种检查必要时对工作菌种进行纯度和特性确认。
菌液制备好后，在室温放置应在2小时内使用，在2-8度放置应在24h内使用。
凡是与菌种接触过的用具应在121度，30分钟。
然后清洗。
使用菌种时应在生物安全柜内操作，采取防护措施，避免污染。
未经批准，不得将菌种带离实验室。
菌种的销毁保存的菌种失去活性，变异或超过贮存时间，应进行灭活销毁121度，30分钟。
下面为朱自清的散文欣赏，不需要的朋友可以下载后编辑删除谢谢荷塘月色作者: 朱自清这几天心里颇不宁静。
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无菌检查和微生物限度检查阳性菌种的管理一、实验室要求：1.实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室内严禁吸烟和饮食。
2.实验人员必须穿戴工作衣帽，工作服经常洗涤、消毒、保持清洁。
3.操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。
4.发生菌液污染台面或地面，应立即用3%甲醛或5%碳酸等消毒液由外向内倾覆其上，1小时后再擦拭，如为破伤风梭菌，则应隔夜后再擦洗。
5.工作衣、帽、口罩受到菌液污染时，应立即脱下使污染部位包裹在内部，高压灭菌后再清洗。
6.如有传染性培养物污染手部，应先用75%乙醇棉球擦拭，再浸入01新洁尔灭消毒液内泡手，然后再用肥皂及清水彻底洗干净。
7.接种环(针)，每次使用前后，必须通过火焰灭菌，冷却后方可接种培养物，接种带有蜡质、油质的培养物或菌苔残留多时，不应立即在火焰上灼烧，应先在内焰里将油质培养物烘干后再移至火焰上灭菌，以免活菌外溅污染环境及感染操作者。
8.带菌的吸管应浸泡在5%甲酚消毒液内24h后取出清洗，带菌的试管或培养物应在121℃高压灭菌后再取出清洗。
9.在接种霉菌、放线菌时应在铺有浸过消毒液的纱布上操作，防止孢子散落传播。
10.凡带活菌的物品，必须消毒后才能清洗，严禁污染下水道。
二、无菌操作要求:无菌操作是指在无菌的环境条件下，使用无菌器材，防止微生物污染的操作技术。
即保持待检样品在操作时不被污染，又要防止被检的微生物及阳性对照菌在操作中污染环境或感染操作人员。
从事无菌及微生物操作的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的学习及培训才具备上岗操作的资格，微生物专业检验人员也不应该频繁地变换工作岗位。
1.无菌室应每次使用前后用0.1%新洁尔灭消毒液或2%甲醛液擦拭工作台面及可能污染的死角，湿拖地面，打开无菌空气过滤器及超净工作台的开关30分钟，紫外线杀菌灯照射1小时。
2.操作人员用肥皂洗手后进入缓冲间换拖鞋，用75%乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。
将所需物品剥去牛皮纸及外包装，从传递窗移入操作间，再用01新洁尔灭泡手后进入操作间，在乙醇(或煤气灯)火焰区(火焰高度3-5cm)操作。
3.供试品表面消毒，如为安瓿先用砂轮划痕后用2%碘酒棉球擦拭，再用75%乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。
4.操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。
5.在无菌操作中切勿大幅度或快速动作、拖行，以免搅动空气中尘埃微粒。
6.注射器如需回抽时，应对着火焰吸入无菌空气。
7.所用的器材如培养基、稀释剂配制后经湿热灭菌121℃20分钟，吸管培养皿等均应洗涤，干燥，包扎后经干热灭菌160℃2小时才能使用。
三、仪器设备实验室所用的各种仪器，如培养箱、电热恒温水浴瓶、电热恒温干燥箱等，均应严格按照仪器说明书操作，均应按计量要求定期检测，并做好检测与维修记录，以保证其正常使用。
无菌操作净化工作台要定期检测洁净度，应达到百级。
净化工作台的高效过滤器应根据使用情况四、培养基的管理培养基是人工配制的适合细菌生长繁殖的生物营养物质，培养基的管理在无菌及微生物限度检查工作中起着重要的作用。
1.培养基购入后应记录名称、产地、批号，培养基配制记录应包括:名称、配制量、配制者、配制日期。
2.干燥培养基的配制应先量入蒸馏水至容器中，再称取培养基干粉放入水中，摇匀，静置15分钟使其溶解，一般不要加热，避免某些营养成分被破坏。
3.培养基配制后应立即灭菌，以防长菌使营养成分损耗，高压灭菌时应防止温度过高、时间过长，使营养成分破坏致使实验结果出现假阴性。
灭菌时间:稀释剂121℃灭菌20分钟，含糖培养基115℃灭菌20分钟。
4.配制好的培养基应保存在凉暗处(2-10℃)或置4℃冰箱内保存，一月左右使用。
保存时间需视培养基中水分蒸发程度及有无污染而定，用硅胶塞，封入塑料袋，内可延长保存时间。
培养基切勿反复加热使用。
5培养基的质量控制，应选用优质的蛋白胨，牛肉膏等营养成分，化学纯以上的化学试剂，调配成最适的pH值。
配制后应按规定做无菌试验，如无菌检查用的培养基，需气菌、厌气菌培养基置30-35℃培养48小时，真菌培养基置20-25℃培养72小时，应无菌生长。
除此以外，还需做培养基性能的质量控制，性能试验:即不同的培养基接种不同的已知标准菌株，培养24小时后，观察细菌生长情况，如无菌检查培养基需做培养基灵敏度试验，细菌生长良好，说明培养基性能可靠。
五、实验菌种的保藏与管理国内药品微生物检验所用的菌种菌号是CMCCB、CMCCF，B(Bacteria)代表细菌，FFungi代表真菌。
由中国药品生物制品检定所提供。
1.菌种保藏基本要求菌种的保藏是微生物学基础工作中的一项重要内容，用人工方法低温、干燥、缺氧、缺营养等方法控制微生物的代谢，使细胞基本上处于休眠状态，繁殖受到抑制仍保持菌种原有的各种生物学特性，以达到保种的目的。
菌种保藏的关键是不变异、不污染、不死亡。
菌种保藏分四个阶段:1挑选特征典型的纯菌菌落，其方法是用接种环挑取少许菌苔，接种至2ml 营养肉汤或09氯化钠溶液中制成菌液，再取一环菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后可见单个菌落生长。
2凡能产生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢进行保种VUnEI oKM孢子和芽胞的代谢作用较弱，但对恶劣环境有很强的抵抗。
3在传代前，将菌液管放入80℃水浴中作用30分钟，杀死杂菌繁殖体后用芽孢传代。
4定期对保藏菌种进行检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退，检查项目:菌落形态、染色、镜检、生化特性及血清学检查。
5选择适宜的培养基及方法2.常用菌种的保藏方法6普通琼脂斜面:用于常用细菌的传代。
在营养琼脂培养基内按05加入琼脂粉配制而成。
接种培养后，将菌种管用硅胶塞塞紧，置4℃冰箱保存，每隔2-3个月传种一次。
铜绿假单孢菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，菌种可放25℃培养箱内保存。
7半固体琼脂:用于常用细菌的传代。
在营养肉汤培养基内按05加入琼脂粉配制而成。
穿刺接种培养后，置4℃冰箱保存，6个月传种一次。
如在培养管内加少量无菌液体石蜡隔绝空气，减少水分蒸发，可延长菌种保藏期。
8真菌琼脂斜面:用于真菌的传代。
在真菌培养基内按13加入琼脂粉配制而成。
划线接种后，20-25℃培养24小时，置4℃冰箱保存，3-6个月传种一次。
9沙氏琼脂斜面:用于真菌的传代。
配方:蛋白胨10g，葡萄糖10g，琼脂粉13g，水1000ml，待上述成分溶化后，摇匀分装，115℃灭菌20分钟，趁热摆成斜面。
培养、保存及传代同1040%甘油水:用于细菌的传代。
配制方法:甘油40ml加水至100ml即成。
分装至试管内，每支2ml左右，121℃灭菌20分钟备用。
接种细菌后直接放4℃冰箱保存，6-12个月传代一次。
11需气菌、厌气菌培养基:用于生孢梭菌的传代。
取生孢梭菌CMCCB64941菌液01ml至需气菌、厌气菌培养基15ml内，30-35℃培养18-24h，置4℃冰箱内保存3-6个月传种一次。
12疱肉培养基:用于破伤风梭菌的传代。
取破伤风梭菌CMCCB64067菌液01ml接种于疱肉培养基内，36℃±1℃厌氧培养3-4天，置4℃冰箱保存，6-12个月传代一次。
13液氮超低温保藏法:适用于各类微生物的保藏。
液氮温度可达-196℃，此时菌种的新陈代谢活动已停止，但不会死亡。
在配制好的菌液内加10%甘油作为保护剂，分装于安瓿中，置液氮罐内可保存10年之久。
14冷冻真空干燥保藏法:本法广泛适用于各类微生物的保藏，包括病毒和噬菌体。
将菌液混于有保护作用的介质内，分装于灭菌菌种管内，速冻后抽真空，使菌液很快变为疏松的干燥菌粉，最后在真空状态下密封管口，菌种保存期最长可达20年以上。
3.菌种检查与复壮:菌种在传代保藏过程中，易发生衰退、变异、污染、死亡，因此必须定期检查。
将菌种接种至液体培养基内使之复活，重新分离，纯化开成单个菌落，再作菌种检定，包括菌落形态、颜色，染色性、镜下观察菌体形态等，必要时可做生化试验及血清学反应。
菌种经人工传代保藏过程中，由于自发突变而引起特性变弱或消失往往为菌种衰退。
使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为菌种复壮。
常用方法有:①分离纯化:将菌种接种至营养肉汤培养基培养24小时，取菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后挑取典型单个菌落。
②宿主复壮:将退化菌种接种到相应昆虫或动植物宿主体内，传种数代可恢复其原有的特性与毒力。
③通过极端的逆境处理使那些退化的细菌死亡，选育健壮的传代保种。
aEBP9RX}z4.实验菌种的管理用菌(毒)种应放入专用冰箱(带锁)，专人保管，菌种应有购入记录，传代记录，使用销毁记录。
菌种应定期检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退。
为了保持菌种原有的各种生物学特性保证实验菌种的质量，近年来国外提出了使用菌种不超过五代的要求。
虽然目前我国药典对于菌种的传代次数未做要求，我们实验中所用的阳性对照菌可能已经传了无数代，存在着菌种衰退、老化变异、不敏感等隐患，对于使用菌种不超过五代给我们提出了更高的要求。
我们可以用以下方式传代:冻干菌种→营养肉汤→半固体琼脂或甘油水100支冰箱保存(原代)(一代)(二代)菌种的保藏条件及传种时间─────────────────────────────────────菌种名称培养基培养温度培养时间保存温度传种时间金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养基35~37℃18-24h4-6℃2-3个月。
藤黄微球菌营养琼脂斜面培养基27～30℃，24h；4～6℃，2-3个月。
生孢梭菌需气菌、厌气菌培养基30～35℃，18-24h；4～6℃，6个月。
白色念珠菌真菌琼脂斜面培养基20～25℃，24h；4～6℃2-3个月。
大肠杆菌营养琼脂斜面培养基35～37℃，18-24h；4～6℃，2-3个月。
沙门菌营养琼脂斜面培养基35～37℃，18-24h；4-6℃，2-3个月。
铜绿假单胞菌营养琼脂斜面培养基35～37℃，18-24h；25℃1个月。
破伤风梭菌疱肉琼脂培养基37℃厌氧培养3-4天；4～6℃，6-12个月。
枯草芽胞杆菌营养琼脂斜面培养基35～37℃，18-24h；4～6℃，2-3个月。
短小芽孢杆菌营养琼脂斜面培养基35～37℃，18-24h；4～6℃，2-3个月。
啤酒酵母菌真菌琼脂斜面培养基32～35℃，24h；4～6℃，4-6个月。