流式细胞术原理及树突状细胞的检测.ppt
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《流式细胞术的原理》PPT课件
光学系统
电子系统
流式细胞仪的工作原理
散射光信号
前向角散射光〔FSC，Forward Scatter〕： 细胞相对大小及其外表积 侧向角散射光〔SSC，Side Scatter〕： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性
散射光信号
荧光信号
特异荧光信号
背景信号
荧光素
•什么是荧光及荧光素？ •某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射 光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称 为荧光素。 •什么是荧光发生机理？ •室温下的荧光素分子大局部处于稳定的“基态〞。当荧光素在 激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发 态〞。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
荧光染料的选择
1，首先，了解目标抗原 1〕细胞外表抗原 2〕细胞内或是核内抗原〔固定、透膜步骤〕 3〕以上两者兼备。先标记外表抗原，固定后，破膜标记 胞内抗原。 4〕细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂， 如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。 〔活化、固定、透膜〕
《流式细胞术的原理》 PPT课件
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流式细胞术在临床血液学ppt课件
*
*
*
AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
*
*
*
AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
*
*
AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
*
*
AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
*
对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
*
流式细胞仪基本工作原理
光路系统 液路系统 电路系统
*
流式细胞仪光路图
*
外周血FSC-SSC点图
*
荧光信号（FL1、FL2、FL3）
*
滤光片
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CD8-CD28+
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AML-M4/M5
两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。
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AML-M6
特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45－SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。
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AML-M2
M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。 CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。
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AML-M3
高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。 M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。
CD80 CD86
CD80、CD86表达率（%）
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对照组B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
*
CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ表达
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CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
*
流式细胞仪基本工作原理
光路系统 液路系统 电路系统
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流式细胞仪光路图
*
外周血FSC-SSC点图
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荧光信号（FL1、FL2、FL3）
*
滤光片
*
CD8-CD28+
流式细胞术原理及树突状细胞的检测.ppt
• FITC
488
525
绿色
• PE(RD1)
488
575
橙色
• ECD
488
620
橙红
• PeCy5
488
675
深红
• PI
488
620
橙红
用途
颜
免疫荧光
免疫荧光
免疫荧光
免疫荧光
DNA染色
滤片
• 带通滤片 BAND PASS (BP)
• 只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
• 标本台
• 流动室(flow cell)
• 鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS
• 无颗粒，无荧光本底 • 无菌，稳定的pH
• 样本流SAMPLE 单细胞悬液5×105－1×106个/ml
• 放大部分
• 光电倍增管PMT HV • 放大电路 GAIN 增益
• 线性：LIN • 对数：LOG
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞 研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分 析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤 相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、 癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究
基本原理
• 光源
• 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光或633nm氦氖激光
• 统计：计算机
FLOW CELL
Fluorescence signals
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
FLOW CYTOMETRY(FCM)
流式细胞术原理及应用简介PPT课件
淋巴细胞亚群分析实验步骤 Forward Light Detector
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信 a Cell 响 FL3：>670nm FL4：653-667nm
号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 细胞凋亡—Annexin V
分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。
物理方法分离（超声波、筛网等）
荧光信号，称自发荧光。 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。
• 一种是经过特异荧光素标记后，受激发光 可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。
激光光源及光束成形系统
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激 光器。
• 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚 焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能 量较强，以激发荧光染料。
• 台式机的整个光路是封闭的，在安装时由 工程师调试完毕后，无需用户作任何调节， 使用十分方便。
激光光源及光束成形系统
动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。 • 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振
动。
流动室与液流驱动系统
FSC及SSC：480-495nm 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 BACKMAN COULTER公司 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 FL3：>670nm FL4：653-667nm AIDS病人T细胞亚群分析 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 血小板膜糖蛋白分子的表达 FL3：>670nm FL4：653-667nm 细胞凋亡—Annexin V 流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。 CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞 细胞周期分析——ModiFit 分析 尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。
流式细胞术(贝克曼)
对任何细胞群体都可以进行绝对计数
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定
根据产生的细胞因子的
类型和生物学功能,人的ＣＤ
4+Ｔ细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔ
ｈ2
Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的 免疫反应、迟发性过敏反应, 并在清除病毒等细胞内致病 因子方面起着重要作用
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行
分析 3）
CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
T细胞分析
相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫病
降低 增高 降低
降低
AIDS SARS
降低 降低
严重 降低
降低
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定
根据产生的细胞因子的
类型和生物学功能,人的ＣＤ
4+Ｔ细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔ
ｈ2
Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的 免疫反应、迟发性过敏反应, 并在清除病毒等细胞内致病 因子方面起着重要作用
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行
分析 3）
CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
T细胞分析
相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫病
降低 增高 降低
降低
AIDS SARS
降低 降低
严重 降低
降低
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术基本原理(完整)PPT参考幻灯片
流式细胞术的基本原理
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
flow cytometry流式细胞术原理及树突状细胞的检测 苏州大学
+
Single cells sorted into test tubes
信号
荧光信号 FL1，FL2，FL3， FL4 线性，对数
散射光信号 前向散射光(FS)： 细胞大小 侧向散射光(SS)： 结构复杂程度
直方图(HISTOGRAM)与 点图(DOT PLOT)
FL2 COUNT
FL
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
一定波长以上通过，该波长以下折射
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
HISTOGRAM
பைடு நூலகம்FL1
DOT PLOT
GATE设门
界定分析区域：REGION
十字门：QUA
矩形门：REC
A
自由门：AMO
线性门：LIN
A
A
建立直方图之间的关系
方案PROTOCOL
选定参数 构建直方图 区域，GATE， 停止，存储，打印 放大倍数，阈值，流速。。。。
免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 单标记
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5
488
675
免疫荧光 深红
PI
Single cells sorted into test tubes
信号
荧光信号 FL1，FL2，FL3， FL4 线性，对数
散射光信号 前向散射光(FS)： 细胞大小 侧向散射光(SS)： 结构复杂程度
直方图(HISTOGRAM)与 点图(DOT PLOT)
FL2 COUNT
FL
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
一定波长以上通过，该波长以下折射
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
HISTOGRAM
பைடு நூலகம்FL1
DOT PLOT
GATE设门
界定分析区域：REGION
十字门：QUA
矩形门：REC
A
自由门：AMO
线性门：LIN
A
A
建立直方图之间的关系
方案PROTOCOL
选定参数 构建直方图 区域，GATE， 停止，存储，打印 放大倍数，阈值，流速。。。。
免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 单标记
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5
488
675
免疫荧光 深红
PI
流式细胞术原理及应用ppt课件
•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
•横坐标：某细胞参数 相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
整理版课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
流式细胞术原理及应用
整理版课件
1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
整理版课件
2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
整理版课件
42
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
整理版课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
整理版课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
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12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
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流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
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目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞仪原理ppt课件
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
流式细胞仪的组成
仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用
大型机——FACSVantage SE
多激光多波长 八荧光参数 高速分选 单细胞点对点分选
台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信
号越强
荧光信号
FALS Sensor
Freq
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescence
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号， 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
荧光信号
激发光源与荧光标记物
流式细胞术样本来源
细胞悬液：
分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导 致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差
相关主题
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基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞 研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分 析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤 相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、 癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究
基本原理
• 光源
• 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光或633nm氦氖激光
• 统计：计算机
FLOW CELL
Fluorescence signals
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
FLOW CYTOMETRY(FCM)
SAMPLE
LASER
SIGNAL PMT
AMP
computer
LIN
LOG
常用荧光染料的特性
• 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 色
Reflected light
OPTICS
细胞分选系统
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
- Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
• 标本台
• 流动室(flow cell)
• 鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS
• 无颗粒，无荧光本底 • 无菌，稳定的pH
• 样本流SAMPLE 单细胞悬液5×105－1×106个/ml
• 放大部分
• 光电倍增管PMT HV • 放大电路 GAIN 增益
• 线性：LIN • 对数：LOG
• FITC
488
525
绿色
• PE(RD1)
488
575
橙色
• ECD
488
620
橙红
• PeCy5
488
675
深红
• PI
488
620
橙红
用途
颜
免疫荧光
免疫荧光
免疫荧光
免疫荧光
DNA染色
滤片
• 带通滤片 BAND PASS (BP)
• 只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
• 直方图：
A
A
COUNT FS
• 同型对照(ISOTYPE)S：S 同抗体类型1、同F荧L 光1染024料
•
非抗人
SAMPLE +
ISOTYPE
SAMPLE +
CD4
免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 双标记
• 参数：FS Lin, SS Lin, FL1 Log, FL2 LOG
• 直方图：
• 十字门：QUA • 矩形门：REC • 自由门：AMO • 线性门：LIN
A
• 建立直方图之间的关系
A A
方案PROTOCOL
• 选定参数 • 构建直方图 • 区域，GATE， • 停止，存储，打印 • 放大倍数，阈值，流速。。。。
免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 单标记
• 参数：FS Lin, SS Lin, FL Log
束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处
理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。
功能特点
（１）单细胞（血液，细胞株，消化后实体瘤细胞 （2）多参数定量分析 （3）高通量、更敏感、更准确
分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
（4）细胞分选 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞
树突状细胞流式检测特点
（1）体积较大，表面多突起，容易吸附非特异荧 光。 （2）未成熟DC有很强的吞噬功能，容易吞噬游离荧光分子，易检
测到假阳性。 （3）吸附能力较强，容易堵塞流动池（ FLOW CELL）。
外周血树突状细胞的检测
• 五色分析DC表达:CD(14+16)-FITC, CD85k(ILT3)-PE, CD45ECD, CD33-PC5, CD2-PC7.
White Light Source
Transmitted Light
• 二向色性滤片 DICHROIC FILTER
• 一定波长以上通过，该波长以下折射
620 -640 nm Light
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
Light Source
Transmitted Light
克隆等
Epics XL-ADC:最经典的分析型台式小机型:世界上第一台单激光四 色机型，全矩阵荧光补偿，数字式流式细胞仪
Epics Altra：最方便稳定的分析型分选型兼顾的大型流式分选机： 最稳定、最灵活的高活性收获细胞的分选机
Cytomics FC500－最新的包含多种高新技术的多色分析机：第 一台单激光5色机型，高灵敏度，全自动化设置
流式细胞术原理及树突状 细胞的检测
苏州大学 於葛华
概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） • 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细
胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定 群体加以分选的现代细胞分析技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer) • 使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光
信号
• 荧光信号
• FL1，FL2，FL3，FL4 • 线性，对数
• 散射光信号
• 前向散射光(FS)：细胞 大小
• 侧向散射光(SS)：结构 复杂程度
直方图(HISTOGRAM)与 点图(DOT PLOT)
FL2 COUNT
FL
HISTOGRAM
FL1
DOT PLOT
GATE设门
• 界定分析区域：REGION
பைடு நூலகம்
A
A
A
FL 1 COUNT COUNT
FS
A
SS
• 同型对照 • 颜色补偿
1 FL 1 1024 1
1
FL 2 1024
1 FL 2
光谱交叉
荧光补偿
PMT1 放大1
PMT2 放大2
计算机
FL2 FL2
FL!
FL!
525nm 575nm
全矩阵颜色补偿
最先进的方法是利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通 道之间都可以进行补偿）
检测对象
悬浮在溶液中的0.2uM-300uM相互离散颗粒。
对象举例 细胞类型： （1）高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
临床研究
• 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋 巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植 中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flowFISH法测定端粒长度