端粒酶活性检测方法
PCR-ELISA端粒酶检测法
PCR-ELISA端粒酶检测法发布日期:2007-6-27 热门指数:782 收藏端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGGG）。
已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。
由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。
这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。
这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。
与体细胞相对照，生殖细胞是永生性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。
因此它必须对抗端粒缩短。
这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。
端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的RNA成份的互补序列作模板，催化TTAGGG 重复序列加到染色体末端。
在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。
端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。
由于需要大量的样品材料，且检验灵敏度受局限, 这一方法已被端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol, TRAP）所取代。
标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳后，通过放射自显影显示结果。
这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法。
这种方法具有如下特点：安全，无需使用放射性同位素一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和PCR扩增可在一个试管中进行。
应用广泛，扩增后可适用于不同分析法。
灵敏，与放射性同位素TRAP测定相当。
可靠，准确、重复性好。
快速，6-8小时得到结果。
端粒酶活性的检测方法探索
端粒酶活性的检测方法探索端粒酶是一类重要的酶，参与维持染色体稳定性和基因组完整性的功能。
它能够在染色体末端的端粒上加上重复序列，减缓染色体的缩短和衰老过程。
如何准确检测端粒酶活性一直是科学家们关注的研究领域。
本文将探索端粒酶活性的检测方法，以期为相关研究提供参考。
一、端粒酶活性检测方法一：荧光探针法荧光探针法是一种常用的端粒酶活性检测方法。
通过在特定条件下，在待测物中加入有机荧光探针，探针与端粒酶发生作用，从而发出特定的荧光信号。
这种方法基于对荧光信号的监测，能够间接地反映端粒酶的活性水平。
二、端粒酶活性检测方法二：聚合酶链反应法聚合酶链反应法（PCR）是一种常用的DNA扩增技术，也可以用于测定端粒酶活性。
该方法基于端粒酶对模板DNA进行延伸，通过PCR扩增得到的产物进行分析，进而检测端粒酶的活性。
三、端粒酶活性检测方法三：细胞培养法细胞培养法是一种直接检测端粒酶活性的方法。
研究人员通过将待测样本细胞转染至全新培养基中，利用培养过程中对细胞进行观察和分析，评估端粒酶活性的水平。
四、端粒酶活性检测方法四：质谱法质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于检测端粒酶活性。
通过质谱仪对待测样本进行分析，能够获得准确的质谱图谱，从而判断端粒酶活性的高低。
该方法具有非常高的分析精确度和灵敏度。
五、端粒酶活性检测方法五：电泳法电泳法常用于检测DNA分子的长度和限制性内切酶剪切位点。
端粒酶活性检测也可以借助电泳技术进行。
使用特定试剂对待测物进行限制性内切，然后利用电泳仪进行分析，通过分析DNA片段的长度和数量变化，来推测端粒酶的活性。
六、总结与展望端粒酶活性的准确检测对于揭示细胞衰老、肿瘤等疾病的发生机制以及判断药物的疗效具有重要意义。
本文介绍了荧光探针法、聚合酶链反应法、细胞培养法、质谱法和电泳法等常用的端粒酶活性检测方法。
随着科学技术的不断进步，我们相信将会有更多更准确的方法被开发和应用于端粒酶活性的检测。
这些方法的发展有望为研究人员提供更深入的了解端粒酶活性的机制以及其在疾病治疗中的应用提供更强有力的证据。
介入化疗前后宫颈癌组织端粒酶活性的检测
Ｓ７ ， ２℃ ９ ，循 环 ３ ０Ｓ ０次 ， 后 ７ ℃ 延 伸 １ 最 ２ ０ ｍｉ。③ Ｅ ＩＡ法 检 测 端 粒 酶 活 性 ： ５ｍＬ扩 ｎ ＬＳ 取
术后病 理结果 示 阴道 切 缘 、 宫旁 浸 润及 盆腔 淋 巴 结转移 均 阴性 ， 部分患 者病理 分级 明显好 转 ， 表现 为其 中 ２例细 胞组织学 分化 程度为 Ⅲ级 的患者治 疗后 分级降低 为 Ⅱ级 ， ３例细 胞 组织 学分 化程 有
为卡铂 （ Ｂ ３０ｍｇ ） Ｃ Ｐ， ０ ，博来 霉 素（ Ｌ ４ Ｂ Ｍ， ５
ｒ ） ｎ 。 ｇ
结果 判 断 ： 端粒 酶 活 性 水平 以 Ａ 值表 示 ， Ａ ＞０２为端粒 酶活性 阳性 。试剂 盒本 身设 有 阳性 ． 对照 Ａ＞１５ 将 组织提 取物 ８ ．， ５℃加热 １ ｎ ０ｍｉ作
癌， 并且就诊 前均 未 接受 任何 化 学药 物 治疗 或放
Ｘ线 透 视 下 ， ５０Ｆ ｏ ｒ 管插 入 髂 内动 脉 ， 将 ． Ｃ ｂａ导 注入造 影剂 ， 观察髂 血管 分支及走 行 隋况 ， 择子 选 宫动脉 或肿瘤 主要 营 养血 管 ， 化 疗 药 物 的 ２３ 用 ／ 灌注 ， 然后 用携 带有 剩余 １ 化 疗 药物 的明胶海 ３ ／
绵栓塞 。同法处理 对侧 子宫动脉 。所用化疗药 物
射治疗 。每 例均分别 于介入化疗 前 １ 内及介 入 周
化疗 ２ ～３周后 手术 中收集 癌组 织 。临床 分 期按
２０ 国际妇产联 盟的诊 断标准 ：１ 期 １ 、 ００年 １ａ 例 Ⅱ
ｂ ８例 。患者 年龄 ３ ～５ 期 ９ ５岁 ， 均 （ ５ ５ 平 ４ ．６±６ ． ９ ２ 岁。另取同期 因子 宫肌瘤 或子宫腺 肌症手术 １） 患者 正 常宫 颈 组织 １ ０例 做 为对 照 组 ， 者 年龄 患 ２ －５ ６ ２岁 ， 平均 （３ ４ ±８ ２ ２ 岁 。 以上所 收标 ４ ．０ ．２ ）
AA几种肿瘤常用检测方法
AA几种肿瘤常用检测方法1．端粒酶活性检测很多恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性,端粒酶可以作为诊断这些肿瘤的生物学标志。
在某些肿瘤中,端粒酶表达会随着肿瘤的进展而上调,因此又可作为肿瘤恶性度评价的一个指标。
端粒酶常用检测方法1) TRAP 法:端粒酶是由蛋白质和RNA 构成的逆转录酶,可以用自身的RNA 为模板合成端粒DNA 而避免端粒的缩短。
人大部分体细胞都不表达端粒酶。
由于“末端复制问题”的存在,端粒在每次细胞分裂后就会缩短一点,当端粒缩短到一定程度就无法维持染色体的稳定,细胞最终衰亡。
恶性肿瘤中端粒酶却能被重新激活而使细胞获得永生化。
自从Kim创立了端粒重复序列扩增法(telomeric repeat ampli-fication protocol ,TRAP) 检测端粒酶的活性以来,大约85 %的恶性肿瘤被检测出具有端粒酶活性。
在目前的肿瘤标志物中,端粒酶是惟一能在大部分肿瘤中都以高阳性率检测到的物质,因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志。
该方法非常敏感,只要有10 个阳性细胞存在就可以检测出其端粒酶活性。
但是除了恶性肿瘤外,端粒酶活性也在一些正常细胞中被检测到,特别是有增生能力干细胞和活化的淋巴细胞,另外如甲状腺腺瘤和肠腺瘤等一些良性肿瘤中也能检测出端粒酶活性,从而使TRAP 法得到的结果复杂起来,因此光用定性的方法有时很难确认恶性肿瘤。
但不少研究发现正常组织和良性肿瘤中端粒酶的活性相对较低,所以可以用定量的方法进一步鉴定。
传统的TRAP 法无法对端粒酶活性做准确定量。
现在有人把实时PCR 技术与传统的TRAP 法相结合发明了实时定量TRAP 法( realtime quantitative telomeric repeat amplificationprotocal ,RQ2TRAP) ,能够对端粒酶活性进行较精确的定量,为良恶性的鉴别诊断提供了有效的手段。
但由于设备和试剂很昂贵,目前还难以普及。
端粒酶检测金标准
端粒酶检测金标准
端粒酶检测是一种用于评估细胞衰老和癌症风险的检测方法。
端粒酶是一种酶，它可以延长染色体的端粒，从而使细胞能够继续分裂和生长。
端粒酶检测的金标准是通过定量PCR (qPCR) 技术进行的。
qPCR 技术是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以准确地检测端粒酶的活性。
在端粒酶检测中，首先需要从患者的血液或组织样本中提取DNA。
然后，使用qPCR 技术对端粒酶的活性进行定量检测。
检测结果可以用来评估患者的细胞衰老程度和癌症风险。
端粒酶检测的金标准是基于qPCR 技术的，因为它具有高灵敏度和高特异性，可以准确地检测端粒酶的活性。
此外，qPCR 技术还可以对端粒酶的活性进行定量检测，从而提供更准确的评估结果。
需要注意的是，端粒酶检测的结果需要结合其他检测结果和临床表现进行综合评估，以确定患者的健康状况和治疗方案。
同时，端粒酶检测也存在一定的局限性，如检测结果可能受到样本质量和检测方法等因素的影响。
端粒酶基本原理及技术方法
端粒酶基本原理及技术方法摘要：近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。
本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法（同位素法、染色法、荧光法和ELISA法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。
端粒酶（Telomerase）是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。
人端粒酶RNA组分（hTR）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-CUAACCCUAAC-3′）；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。
端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。
在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物1。
因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。
本文对其检测方法综述如下。
1基本原理端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。
1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法（telomericrepeatamplificationprotocol,TRAP）。
TRAP反应原理见下图。
首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
2基本技术方法2.1标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。
2.2端粒酶的提取方法早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测什么是端粒酶活性检测端粒酶活性检测是一种用于测量细胞端粒酶活性的方法。
端粒酶是一种特殊的酶，它负责维持染色体末端的保护性结构，被称为端粒。
每次细胞分裂时，染色体末端的端粒会缩短一小段，导致细胞老化和损伤。
而端粒酶能够加上丢失的端粒序列，从而保持染色体的完整性和稳定性。
端粒酶活性检测可以帮助科研人员了解端粒酶在细胞中的表达和功能，进而揭示细胞老化、癌症等相关疾病的发生机制。
端粒酶活性检测的原理端粒酶活性检测的原理主要基于PCR（聚合酶链式反应）技术，结合端粒酶的特异性，通过测量PCR扩增产物的长度来间接判断细胞中端粒酶活性的强弱。
端粒酶活性检测通常采用两种主要的方法：1.TRAP（端粒重复序列扩增）方法：该方法通过PCR扩增端粒酶作用后产生的DNA片段。
首先，从细胞中提取总DNA，然后用端粒特异引物和通用引物进行PCR扩增。
PCR的产物是一个长度可变的DNA产物，在琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析后，可以通过观察DNA产物的长度来获得端粒酶活性的信息。
2.TRF（终端限制片段长度）方法：该方法通过限制性酶切和Southern blot等技术来测量端粒长度。
首先，从细胞中提取总DNA，然后用限制性酶切割DNA，产生一系列端粒片段。
然后，使用Southern blot技术将DNA片段转移到膜上，并与端粒特异性探针杂交。
最后，通过观察酶切后的DNA片段长度来推断细胞中端粒的长度和端粒酶的活性。
端粒酶活性检测的应用端粒酶活性检测在许多研究领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.细胞老化研究：端粒酶活性检测可以帮助研究者了解细胞老化的机制。
随着细胞的老化，端粒长度会逐渐变短，端粒酶活性也会随之下降。
通过测量端粒酶活性的变化，可以揭示细胞老化过程中端粒酶的作用和调控机制。
2.癌症研究：端粒酶在癌症细胞中常常被过度表达，维持了癌细胞的无限增殖能力。
端粒酶活性检测可以帮助研究者评估癌细胞中端粒酶的活性水平，从而了解癌细胞生长和扩散的机制，并为癌症的治疗提供新思路。
端粒酶活性检测方法的改进及dNTP浓度对端粒酶活性的影响
ｃ ｃＧＴＡＡｃ ３） １ ｍｏ ， ｑ聚 合 酶 ２ｕ ， ｃ一 各 ５ｐ ｌＴａ 端粒 酶 抽 提物 １
ｇ 或 人 工 合 成 的 模 板 （ 粒 酶 产 物 ） ． ２ａ ｌ 补 加 果
２ １ Ｔ Ｐ 反 应 结 果 ２ ３ 胞 抽 提 物 凝 胶 电 泳 显 示 间 隔 ． ＲＡ ９细
ａｎ弃 ｒｉ ， 上 清 。 胞 沉 淀 加 入 ２ ０ Ｌ ＣＨＡＰ 细 ０ Ｓ裂 解 液 ［ ， 匀 ， ３混 ］ 冰 浴 ３ ｉ ４Ｃ １ ０ ０ｒ ｎ； ６０ ０×ｇ 离 心 ２ ｉ ， 取 上 清 用 Ｂ ｏ — ａ ０ｒ ｎ 吸 ａ ｒｄ ｆｒ ｏ ｄ方 法 测 定 蛋 白 浓 度 ， 一 ８ ℃保 存 。 置 Ｏ １ ２ 改 进 的 Ｔ Ｐ 反 应 反 应 体 系 为 ５ Ｌ， 括 １ ． ＲＡ ０ 包 ０×
Ｐ Ｒ 扩 增过 程 中不 改 变端 粒 酶 产 物 的 长度 和 比 例 ， 更 准确 地 反 映端 粒 酶反 应产 物 的 性 质 。 用 这 个 方 法 ， 察 了 Ｃ 能 利 考
ｄ ＮＴＰ 浓 度 对 端 粒 酶 的 影 响 ， 现 不 同 的 脱 氧 核 苷 酸 对 端 粒 酶 活 性 的 影 响 有 差 异 。 发
增 的 端 粒 酶 重 复 扩 增 程 序 （ｅｏ ｒｓ ｅ ｅ ｔａ ｌ ｉ ｔ ｎ ｔｌｍｅａ ｅｒｐ ａ ｍｐｉｃ ｉ ｆａ ｏ ｐ ｏｏ ｏ ， ＲＡＰ） 在 最 初 的 ＴＲ ｒ ｔｃ ｌＴ ｃ 。 ＡＰ 反 应 中 ， 于 反 向 引 物 由 ＣＸ 可 结 合 在 端 粒 重 复 序 列 的 任 意 部 位 ， 致 Ｐ Ｒ 产 物 的 长 导 Ｃ
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中国兽医学报 Ｏ 年 １ 第 ２ 第 期 Ｃｉ ２ ２ １ ０ 月 ２ 卷 ６ ｈ ｎ
端粒酶基本原理及技术方法
端粒酶基本原理及技术方法摘要:近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。
本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。
人端粒酶RNA组分于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。
端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。
在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。
因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。
本文对其检测方法综述如下。
1基本原理端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。
1994年Kim 建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法。
TRAP反应原理见下图。
首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
2基本技术方法标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液等。
端粒酶的提取方法早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。
现详述如下：40～100mg冷冻组织或104～106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mMhepes-KOH,,10mMKCI,1MmDTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mMtris-HCI,1mMMgC12,1mMEGTA,,5mMβ-巯基乙醇，％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min,16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）实验前准备1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+and Ca2+-free）4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗材均要求RNase-free）冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。
实验步骤1．PBS洗去残余培养基；2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；4．冰浴30mins；5．4℃离心12000g，20mins；6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。
*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul50X dNTP Mix 0.5ulTS Primer 0.5ulTRAP Primer Mix 0.5ulTaq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）dH2O 19.8ulTemplate 1.0ul每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），②样本热敏对照（85℃，10mins），③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），④阳性热敏对照（85℃，10mins），⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s↖70℃，1mins↙30-33cycles9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上轻摇至条带显色④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中拍照。
端粒酶活性检测方法的研究进展
摘要: 近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。
本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，trap扩增技术，四种结果分析方法（同位素法、染色法、荧光法和elisa法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。
端粒酶（telomerase）是由rna和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。
人端粒酶rna组分（htr）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-cuaacccuaac-3′）；蛋白质组分具有rna依赖的dna多聚酶活性，结构尚不清楚。
端粒酶能以自身rna的模板区为模板复制合成端粒序列。
在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。
因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。
本文对其检测方法综述如下。
1 基本原理端粒酶在体外可以以其自身rna的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（page）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。
1994年kim 建立了基于pcr基础上的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, trap）。
trap反应原理见下图。
首先合成一个18nt的ts做上游引物，端粒酶结合ts末端的gtt并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的cx 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
2 基本技术方法2.1 标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。
2.4 引物设计为了防止上、下游引物之间的结合，在cx引物上设计了3个不匹配碱基（见图1*处），单链结合蛋白t4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合，ts和cx引物被广为采用，在上述条件下，只有延伸了三至更多的ggttag片断才有特异扩增，即得到从40bp 开始的6bp差异的梯带。
端粒酶活性检测方法研究
织 取 自肝脏 海绵 状 血 管 瘤 患 者 或 其他 非 肝 脏 疾 病患 者 。鼻 咽 癌 为 低分 化 的 鳞状 细胞 癌 乳 癌 为 谭 自腺 泡 或 小乳 菅 的 腺癌 组 织 样本 于 一 ７ ｃ保 存 。所 有 病 例 均经 病 理 学诊 断 证 实 。 Ｏ ｌ 试 剂 ２ 组 织 样 本 洗 涤 缓 冲 液 ： ｍｍｏ／ Ｐ ｓ ｌ ０ ］ Ｌ ＨＥ Ｅ
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技术和方法 ・
端 粒 酶 活 性 检 测 方 法 研 究
张 黎明 ，印 木 泉 ，贺 茜。 ，陈 志 龙 ，陈 铁 河 一毕 洁
（ 第 二军 医大 学 基 础 医学 部 卫 牛 毒理 学 教 研 室 ， 海 ２ ０ ； 长海 医院 妇 产 科 １３ 海 军 医 学 系 防 化 医 学 教 研 室 Ｊ １ 卜 ０ ＇３ ２ １ ３
端 粒 酶 是 已知 的 恶 性 肿 瘤 特 异 性 最 强 的 生 物 标 志 物 ， 端 粒 酶 活 性 在 肿 瘤 的 早 期 诊 断 及 预 后 评 估 中 均 有 谱 在 价
值 ｒ 。 端 粒 酶 活 性 也 表 达 于 生 殖 细 胞 、 血 干 细 胞 等 非 肿 卜 造
ｍｇ， 除 纤 维 组 织 和 坏 死 组 织 一 死 组 织 超 过 １ 者 弃 之 不 剔 坏 ０
瘤细 胞中 － 因而 单凭 端 牡 酶 活 性 的直 无 难 区分 正 常 细 胞 与 肿 瘤细 胞 ， 必须 建 立 端 粒 酶 活 性 的 定 量 分 析方 法 。本 一 种 相 对 简 便 的 端 粒 酶 活性 定 量 ５基
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端粒酶活性检测方法
1.端粒重复序列延伸法
端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。
1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法(Telom—eric Repeat Amplification Protoc
01．TRAP)。
首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGT]rAG，然后每经过一次转位合成一个GGTTAG的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
1994年Kim创建了该方法，它与DNA聚合酶分析方法相似，如；把核酸提取物、代表脊椎动物端粒重复序列的单链DNA前体
(T1’AGGG)4和放射标记的磷酸脱氧核糖一起孵育，然后通过放射自显影检测凝胶上新添加的DNA重复序列。
此方法是最早建立的方法，它稳定性好。
其缺点是，需要样本量大，敏感性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测，检测时需同位素量较大。
此法已基本被淘汰
2.TRAP法及其改进（关键是我们有没有PCR扩增机、电泳自显影及图像分析）
其基本原理是利用CHAPS去污剂提取端
粒酶后，将反应体系中下游引物CX(5’-(CCATTA)
3CCCTAA-3’]用石蜡层与其他反应隔开，在石蜡层
上利用端粒酶的逆转录酶活性在非端粒核酸．TS(5’．AACCGTCGAGCAGTT-3’)引物3’末端合成端粒重
复序列，然后将反应产物进行PCR扩增，石蜡层在
高温时溶化，CX(引物加入到反应体系中，反应体系中含有(a-32P)dGTP或（a-32P）CTP。
由于端粒酶每
合成一个TTAGGG就需要RNA模板重新定位，因
此，反应产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示为相隔
6bp的梯状条带，TRAP法由于利用PcR技术对端粒
酶合成的端粒DNA进行扩增，因此能从104个正常
细胞中检出混杂在其中的一个肿瘤细胞，这大大提
高了检测的敏感性、速度和效果。
此方法较可靠，目前应用最多。
但TRAP 方法的缺点在于：
①电泳结
果与端粒酶活性程度呈非线性相关，使得测定端粒
酶相对活性较困难；8h至两天，时间太长
改进法一：
TRAP银染法
们利用银离子与DNA结合的原理，把TrAP反应物在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染显示梯状条带，此方法的结果与同位素TRAP方法一样可靠、灵敏。
法二：
接近闪烁分析法
为了解决聚丙烯酰胺凝胶电泳操作繁琐等问题，有人利用接近闪烁分析技术，在96孔板上进行．TRAP操作，使大规模筛选临床标本成为可能，其基本原理是将CX引物．5’
端用生物紊标记，2∽i[Me-3H]TTP取代[a一32P]dGTP，PcR扩增31个循环，吸取反应物与链霉抗生素蛋白
包被的液态微球相混合，由于生物素3H标记的反应
产物与微球相结合，因此当其接近反应发生器时，能激发含有3H的核酸液闪，从而产生信号，并由液闪
计数仪计数，未结合3H标记的游离核酸其能量被吸
收在分析缓冲液中，不能激发液闪，故不会干扰实验结果。
xx：
TRAP—ELISA法（TRAP—ELISA试剂盒）
先扩增，引物TS含生物素，扩增产物与包被有亲和素的微孔板结合，并与含地高辛标记的探针杂交，酶标记抗地高辛抗体与之结合而显色，酶标仪测定结果，根据颜色的深浅进行半定量分析。
TrAP的几种方法的具体步骤我也有，但比较复杂，不好写出来，字母混乱很难复制的。
而且改进方法也很多，我就以后再讨论用哪种改进方法（肯定是用改进方法了，其他的现在淘汰了）吧。
现在先应付答辩吧，如果有PCR,就讲TRAP法好了。