端粒酶活性检测
端粒酶活性检测研究进展
第18卷第1期2018年3月应用技术学报JOURNAL OF TECHNOLOGYV0I.I8N0.IMar. 2018文章编号 $096-3424(2018)01-0001-13D O I：10. 3969/j.issn.2096-3424. 2018. 01. 001端粒酶活性检测研究进展郑婷婷，冯恩铎，田阳(华东师范大学化学与分子工程学院，上海200241)摘要：端粒酶是细胞内常见的一种逆转录酶，其功能在于维持细胞内染色体末端端粒的长度。
端粒酶活性的异常升高通常与肿瘤细胞的产生以及生长相关。
端粒酶的活性已经成为了癌症诊疗领域中非常重要的生物标志物。
因此，对于端粒酶活性准确且高效的定量分析检测方案是当今分析科学，临床医学等相关学科领域研究的重点之一。
随着分析测试技术的发展，提出了一系列具有超高性能的端粒酶活性检测方案。
总结了近5年来端粒酶活性检测方案的发展全貌并且预估了端粒酶活性检测的未来发展方向。
关键词：端粒酶；活性检测；电化学分析；荧光分析；拉曼分析；在体分析；研究进展中图分类号：O 657 文献标志码：AProgress in the Analysis of Telomerase ActivityZHENG Tingling，FENGEnduo，TIAN Yang(School of C hem istry and M olecular E ngineering，East China N orm al U n iv e rs ity，Shanghai 200241，China)Abstract：Telomerase is a common type of reverse transcriptase in ce lls，w hich plays an im p orta m aintaining the length of telom eres at the ends of chromosomes.There is always a tig h t relationshipbetween the g ro w th of tu m o r cells and the high expression of telomerase a c tiv ity.Telomerase a c tiv ity hasbeen a very im p o rta n t biom arker in the fie ld of cancer diagnosis and trea tm en t.e fficient quantitative analysis of telomerase a c tiv ity is one of the key points in the fie ld of analyticalscience，clinical medicine and other related disciplines.A series of novel telomerase a c tiv ity detectionmethods w ith very good analytical performance have been proposed w ith the development of testing technology.T h is article summarizes telomerase a c tiv ity detection scheme in the recent five yearsand we also forecast the fu tu re developm ent direction of telomerase a c tiv ity detection.Key words：telom erase；a c tiv ity detection；electrochemical analysis;fluorescence analysis;Ramananalysis；in-vivo analysis；research progress端粒是一段具有重复序列（T T A G G G)的D N A裂过程中，染色体的复制会导致端粒的不断缩短[3]。
端粒酶活性的检测方法探索
端粒酶活性的检测方法探索端粒酶是一类重要的酶，参与维持染色体稳定性和基因组完整性的功能。
它能够在染色体末端的端粒上加上重复序列，减缓染色体的缩短和衰老过程。
如何准确检测端粒酶活性一直是科学家们关注的研究领域。
本文将探索端粒酶活性的检测方法，以期为相关研究提供参考。
一、端粒酶活性检测方法一：荧光探针法荧光探针法是一种常用的端粒酶活性检测方法。
通过在特定条件下，在待测物中加入有机荧光探针，探针与端粒酶发生作用，从而发出特定的荧光信号。
这种方法基于对荧光信号的监测，能够间接地反映端粒酶的活性水平。
二、端粒酶活性检测方法二：聚合酶链反应法聚合酶链反应法（PCR）是一种常用的DNA扩增技术，也可以用于测定端粒酶活性。
该方法基于端粒酶对模板DNA进行延伸，通过PCR扩增得到的产物进行分析，进而检测端粒酶的活性。
三、端粒酶活性检测方法三：细胞培养法细胞培养法是一种直接检测端粒酶活性的方法。
研究人员通过将待测样本细胞转染至全新培养基中，利用培养过程中对细胞进行观察和分析，评估端粒酶活性的水平。
四、端粒酶活性检测方法四：质谱法质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于检测端粒酶活性。
通过质谱仪对待测样本进行分析，能够获得准确的质谱图谱，从而判断端粒酶活性的高低。
该方法具有非常高的分析精确度和灵敏度。
五、端粒酶活性检测方法五：电泳法电泳法常用于检测DNA分子的长度和限制性内切酶剪切位点。
端粒酶活性检测也可以借助电泳技术进行。
使用特定试剂对待测物进行限制性内切，然后利用电泳仪进行分析，通过分析DNA片段的长度和数量变化，来推测端粒酶的活性。
六、总结与展望端粒酶活性的准确检测对于揭示细胞衰老、肿瘤等疾病的发生机制以及判断药物的疗效具有重要意义。
本文介绍了荧光探针法、聚合酶链反应法、细胞培养法、质谱法和电泳法等常用的端粒酶活性检测方法。
随着科学技术的不断进步，我们相信将会有更多更准确的方法被开发和应用于端粒酶活性的检测。
这些方法的发展有望为研究人员提供更深入的了解端粒酶活性的机制以及其在疾病治疗中的应用提供更强有力的证据。
AA几种肿瘤常用检测方法
AA几种肿瘤常用检测方法1．端粒酶活性检测很多恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性,端粒酶可以作为诊断这些肿瘤的生物学标志。
在某些肿瘤中,端粒酶表达会随着肿瘤的进展而上调,因此又可作为肿瘤恶性度评价的一个指标。
端粒酶常用检测方法1) TRAP 法:端粒酶是由蛋白质和RNA 构成的逆转录酶,可以用自身的RNA 为模板合成端粒DNA 而避免端粒的缩短。
人大部分体细胞都不表达端粒酶。
由于“末端复制问题”的存在,端粒在每次细胞分裂后就会缩短一点,当端粒缩短到一定程度就无法维持染色体的稳定,细胞最终衰亡。
恶性肿瘤中端粒酶却能被重新激活而使细胞获得永生化。
自从Kim创立了端粒重复序列扩增法(telomeric repeat ampli-fication protocol ,TRAP) 检测端粒酶的活性以来,大约85 %的恶性肿瘤被检测出具有端粒酶活性。
在目前的肿瘤标志物中,端粒酶是惟一能在大部分肿瘤中都以高阳性率检测到的物质,因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志。
该方法非常敏感,只要有10 个阳性细胞存在就可以检测出其端粒酶活性。
但是除了恶性肿瘤外,端粒酶活性也在一些正常细胞中被检测到,特别是有增生能力干细胞和活化的淋巴细胞,另外如甲状腺腺瘤和肠腺瘤等一些良性肿瘤中也能检测出端粒酶活性,从而使TRAP 法得到的结果复杂起来,因此光用定性的方法有时很难确认恶性肿瘤。
但不少研究发现正常组织和良性肿瘤中端粒酶的活性相对较低,所以可以用定量的方法进一步鉴定。
传统的TRAP 法无法对端粒酶活性做准确定量。
现在有人把实时PCR 技术与传统的TRAP 法相结合发明了实时定量TRAP 法( realtime quantitative telomeric repeat amplificationprotocal ,RQ2TRAP) ,能够对端粒酶活性进行较精确的定量,为良恶性的鉴别诊断提供了有效的手段。
但由于设备和试剂很昂贵,目前还难以普及。
医用端粒酶检测试剂盒
医用端粒酶检测试剂盒医用端粒酶检测试剂盒是一种用于检测人体端粒酶活性的重要医疗设备。
本文将从以下几个方面进行介绍：端粒酶的作用与重要性、医用端粒酶检测试剂盒的原理与优势、其在临床医学中的应用、未来的发展前景等。
一、端粒酶的作用与重要性端粒酶是一种酶类物质，其主要作用是维持及修复细胞的端粒。
端粒是染色体末端的DNA序列，它在细胞分裂过程中会逐渐缩短，当端粒长度缩短到一定程度时，细胞将无法正常分裂和更新，导致细胞功能衰退和衰老。
端粒酶的活性则决定了端粒的长度和相应细胞功能的正常发挥。
医用端粒酶检测试剂盒的原理与优势医用端粒酶检测试剂盒通过一系列的化学、免疫学和分子生物学技术，可以精确测定组织、细胞或体液中的端粒酶活性水平。
其原理主要包括基于酶促化学反应或荧光标记分子的检测方法。
与传统方法相比，医用端粒酶检测试剂盒具有以下优势：1. 高灵敏度：医用端粒酶检测试剂盒能够检测到非常低浓度的端粒酶活性，可以提高疾病的早期诊断率。
2. 高准确性：医用端粒酶检测试剂盒的结果准确可靠，可以在短时间内得到精确的酶活性水平。
3. 高通量性：医用端粒酶检测试剂盒可以批量化进行样本检测，具有高效高通量的特点，提高了检测效率。
其在临床医学中的应用医用端粒酶检测试剂盒在临床医学中有着广泛的应用，主要表现在以下几个方面：1. 癌症诊断与预后判定：端粒酶活性与癌细胞增殖的相关性很高，通过医用端粒酶检测试剂盒可以帮助医生早期发现并确定癌症，同时可以预测癌症患者的预后阶段。
2. 心血管疾病评估：医用端粒酶检测试剂盒可以评估心血管疾病患者的细胞老化程度，并提供有关心血管疾病的风险评估。
3. 神经退行性疾病研究：医用端粒酶检测试剂盒可以用于神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等的研究，探索端粒酶活性与这些疾病的关系。
未来的发展前景医用端粒酶检测试剂盒在医学领域的应用前景广阔。
随着对端粒酶活性的深入了解，医用端粒酶检测试剂盒将在临床诊断中起到越来越重要的作用。
端粒酶检测金标准
端粒酶检测金标准
端粒酶检测是一种用于评估细胞衰老和癌症风险的检测方法。
端粒酶是一种酶，它可以延长染色体的端粒，从而使细胞能够继续分裂和生长。
端粒酶检测的金标准是通过定量PCR (qPCR) 技术进行的。
qPCR 技术是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以准确地检测端粒酶的活性。
在端粒酶检测中，首先需要从患者的血液或组织样本中提取DNA。
然后，使用qPCR 技术对端粒酶的活性进行定量检测。
检测结果可以用来评估患者的细胞衰老程度和癌症风险。
端粒酶检测的金标准是基于qPCR 技术的，因为它具有高灵敏度和高特异性，可以准确地检测端粒酶的活性。
此外，qPCR 技术还可以对端粒酶的活性进行定量检测，从而提供更准确的评估结果。
需要注意的是，端粒酶检测的结果需要结合其他检测结果和临床表现进行综合评估，以确定患者的健康状况和治疗方案。
同时，端粒酶检测也存在一定的局限性，如检测结果可能受到样本质量和检测方法等因素的影响。
端粒酶活性检测技术在癌症诊断中的应用研究
端粒酶活性检测技术在癌症诊断中的应用研究癌症是一种极具危害性的疾病，其致死率居高不下。
尤其是对于早期诊断而言，癌症的诊断难度较大，而且常常容易出现误诊、漏诊等现象。
针对这一问题，现代医学领域逐渐发展出了一系列高科技、高精度的检测技术，其中端粒酶活性检测技术就是一种极具潜力且备受关注的检测技术。
在人体细胞内，端粒簇是一种不断缩短的DNA序列，同时，端粒酶是一种具有有限的催化活性的酶，主要作用是在DNA细胞分裂时帮助维持端粒簇的长度。
在正常情况下，端粒簇的长度每次细胞分裂时会减短一定长度，随后变得越来越短，最终当端粒簇长度缩短到一定程度时，细胞便进入了衰老阶段，发生细胞凋亡。
然而，在某些细胞异常状态下，端粒簇的长度会被一些因素提前缩短，这些因素可能涉及DNA损伤、有害物质、环境污染等等。
当端粒簇长度处于比较短的情况下，细胞将自我复制并不断增殖，容易形成恶性肿瘤等癌症。
由此引出端粒酶活性检测技术。
这种检测技术的基本原理是利用端粒酶的催化活性，根据细胞内端粒簇的长度进行判断。
在测试中，医生会提取患者细胞的核DNA，随后让其与端粒酶反应，在帮助核DNA复制后，检查端粒簇长度缩短的情况。
如果检测结果显示端粒簇长度较短，则说明该细胞具有癌症的潜在风险。
如果检测结果显示端粒簇长度较长，则说明该细胞的癌症风险比较低。
可以通过多次检测，介入治疗等方法来进行病情监测，及时发现和治疗癌症。
对于癌症患者而言，端粒酶活性检测技术具有很高的应用价值。
该检测技术可以用于各种不同类型的癌症的诊断，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等常见癌症类型。
此外，端粒酶活性检测技术对于早期癌症的诊断也有较高的精度和敏感性，可以及早发现病情，为治疗提供更加准确的依据。
同时，端粒酶活性检测技术还可以引导医生制定更加个性化的治疗方案，对于治疗效果的评估也有一定的作用。
在临床实践中，端粒酶活性检测技术的应用也在不断得到推广。
当前，国内外包括生物制药企业在内的许多机构，都将端粒酶活性检测技术作为主要诊断手段之一，并在相应的诊疗流程中进行了规范化的操作和标准化流程控制。
端粒酶活性检测安全操作及保养规程
端粒酶活性检测安全操作及保养规程一、前言近年来，端粒酶活性检测已成为基础医学和临床医学研究领域的重要实验技术之一。
然而，在进行端粒酶活性检测时，操作人员必须重视实验安全，高度重视实验室的安全和卫生。
为了确保实验室人员的安全以及实验数据的准确性，本文制定了端粒酶活性检测安全操作及保养规程。
二、实验室安全进行端粒酶活性检测的实验室应该具备良好的实验室安全管理体系，并且全面贯彻生命安全第一的原则。
首先，必须具备高级别生物安全实验室（BSL-2）标准的洁净实验环境。
其次，实验室应该建立健全的实验物品调配和管理制度，确保所有的试剂和耗材的真实性和有效性。
此外，还需要建立完善的实验室安全检查和记录制度，并定期对实验室的设施进行维护、维修和升级。
三、端粒酶活性检测的实验物品管理端粒酶活性检测涉及到许多试剂和耗材的使用，包括核酸电泳仪、扫描仪等设备。
对于这些实验物品，必须进行严格的管理和维护。
首先，每个使用过的试剂都要及时标记，标注试剂的使用日期和有效期，避免使用过期或失效的试剂。
其次，对于每次使用的实验用具，必须做好归位整理工作，保证使用的安全性和整洁度。
最后，在使用电器设备时，必须确保设备本身符合标准，同时电器设备也要定期维护和检测，确保安全。
四、端粒酶活性检测的安全操作端粒酶活性检测的标本处理和实验中需要遵循充分的安全操作。
对于危险性样品，如生物样品，不仅要对病原菌进行灭活处理，还要落实实验室人员的个人防护措施。
此外，在进行样品处理过程中，必须使用符合标准的个人防护装备，如口罩、手套等。
对于样本搅拌和离心操作，一定要注意离心管口处理，避免因空气压缩而导致的离心管口破裂，对操作人员造成伤害。
同时在所有操作中，必须严格按照实验步骤和试剂使用说明书来操作，不可随意改变和调整实验条件，以确保实验数据的准确性。
五、实验仪器设备保养管理端粒酶活性检测涉及到的所有仪器设备都需要定期检查、维护和保养。
针对一些高风险仪器，如电泳仪、扫描仪等，必须建立严格的使用规程，确保安全使用。
PCR-EIA法检测端粒酶活性及其临床应用
!PCR-EIA法检测端粒酶活性及其临床应用陈卫群1，陈和明2，胡元佳1（1.中南大学湘雅医学院检验系临床生化教研室，长沙410013；2.中南大学湘雅二医院心胸外科，长沙410011）［摘要］目的：探讨用PCR-EIA法检测人端粒酶活性及其临床应用。
方法：利用kim法处理细胞和组织标本及扩增端粒酶产物，引物TS用生物素标记，CX用地高辛标记，PCR产物与包被有链亲和素的酶标板结合，并与酶标抗地高辛抗体反应，用TMB显色。
结果：PCR-EIA法与TRAP-银染色法有很好的相关性，批内变异系数CV为4.138%，在30例各种恶性肿瘤组织中端粒酶活性检出率为90%，28例癌旁组织中为7.1%。
结论：该法具有较好的灵敏度与重复性，无同位素污染，较银染色法更为简便、快速，检测成本低，无需特殊仪器，适合于各级医院推广。
［关键词］端粒酶活性；肿瘤；多聚酶链反应；酶多重免疫测定技术［中图分类号］R446.61［文献标识码］A［文章编号］1000-5625（2002）03-0221-03(uantitation of telomerase activity using the polymerase chain reaction-based enzyme immunoassay and its clinical applicationCHEN Wei-gun1，CHEN He-ming2，HU Yuan-jia1（1.Department of Clinical Biochemistry，Xiangya School of Medicine，Central South Uniuersity，Changsha410013；2.Department of Thoracic and Cardiac Surgery，Second Xiangya Hospital，Central South Uniuersity，Changsha410011，China）Abstract：Objective To investigate detective methodoIogy of teIomerase activity and its cIinicaI appIica-tion.Methods The teIomerase activity was guantitated by poIymerase chain reaction-base enzyme immunoassay （PCR-EIA）.The TS primer was biotinyIated（TS-B），and CX primer was digoxigeninated（CX-D）.The ampIi-cons containing TS-B were combined with microtiter pIate coated streptavidin，then combined with anti-digoxi-genin antibody IabeIed with POD and finaIIy reacted to tetramethyIbenzidine substrate soIution.Results TeIom-erase activity measured by the PCR-EIA method was comparabIe to that obtained from TRAP-siIver stain protocoI.The CV of the PCR-EIA method was4.138%.TeIomerase activity was detected in90%of various tumer tis-sues.In controI tissues，teIomerase activity was detected onIy in7.1%.Conclusion The PCR-EIA method of-fers a rapid，guantitative，and nonisotopic assay for the determination of teIomerase activity.It is simper than siI-ver stain protocoI.The detection of teIomerase activity may pIay a significant roIe in the diagnosis of cIinicaI tu-mors.Key words：teIomerase activity；neopIasms；poIymerase chain reaction；enzyme-muItypIied im-munoassay technigue［BuII Hunan Med Univ，2002，27（3）：0221-03］端粒酶活性的表达与细胞的衰老凋亡和永生化密切相关，普遍认为端粒酶在肿瘤的发生发展中具有重要作用。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测什么是端粒酶活性检测端粒酶活性检测是一种用于测量细胞端粒酶活性的方法。
端粒酶是一种特殊的酶，它负责维持染色体末端的保护性结构，被称为端粒。
每次细胞分裂时，染色体末端的端粒会缩短一小段，导致细胞老化和损伤。
而端粒酶能够加上丢失的端粒序列，从而保持染色体的完整性和稳定性。
端粒酶活性检测可以帮助科研人员了解端粒酶在细胞中的表达和功能，进而揭示细胞老化、癌症等相关疾病的发生机制。
端粒酶活性检测的原理端粒酶活性检测的原理主要基于PCR（聚合酶链式反应）技术，结合端粒酶的特异性，通过测量PCR扩增产物的长度来间接判断细胞中端粒酶活性的强弱。
端粒酶活性检测通常采用两种主要的方法：1.TRAP（端粒重复序列扩增）方法：该方法通过PCR扩增端粒酶作用后产生的DNA片段。
首先，从细胞中提取总DNA，然后用端粒特异引物和通用引物进行PCR扩增。
PCR的产物是一个长度可变的DNA产物，在琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析后，可以通过观察DNA产物的长度来获得端粒酶活性的信息。
2.TRF（终端限制片段长度）方法：该方法通过限制性酶切和Southern blot等技术来测量端粒长度。
首先，从细胞中提取总DNA，然后用限制性酶切割DNA，产生一系列端粒片段。
然后，使用Southern blot技术将DNA片段转移到膜上，并与端粒特异性探针杂交。
最后，通过观察酶切后的DNA片段长度来推断细胞中端粒的长度和端粒酶的活性。
端粒酶活性检测的应用端粒酶活性检测在许多研究领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.细胞老化研究：端粒酶活性检测可以帮助研究者了解细胞老化的机制。
随着细胞的老化，端粒长度会逐渐变短，端粒酶活性也会随之下降。
通过测量端粒酶活性的变化，可以揭示细胞老化过程中端粒酶的作用和调控机制。
2.癌症研究：端粒酶在癌症细胞中常常被过度表达，维持了癌细胞的无限增殖能力。
端粒酶活性检测可以帮助研究者评估癌细胞中端粒酶的活性水平，从而了解癌细胞生长和扩散的机制，并为癌症的治疗提供新思路。
CML端粒酶活性检测的临床意义
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
端粒酶活性检测方法的研究进展
摘要: 近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。
本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，trap扩增技术，四种结果分析方法（同位素法、染色法、荧光法和elisa法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。
端粒酶（telomerase）是由rna和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。
人端粒酶rna组分（htr）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-cuaacccuaac-3′）；蛋白质组分具有rna依赖的dna多聚酶活性，结构尚不清楚。
端粒酶能以自身rna的模板区为模板复制合成端粒序列。
在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。
因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。
本文对其检测方法综述如下。
1 基本原理端粒酶在体外可以以其自身rna的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（page）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。
1994年kim 建立了基于pcr基础上的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, trap）。
trap反应原理见下图。
首先合成一个18nt的ts做上游引物，端粒酶结合ts末端的gtt并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的cx 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
2 基本技术方法2.1 标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。
2.4 引物设计为了防止上、下游引物之间的结合，在cx引物上设计了3个不匹配碱基（见图1*处），单链结合蛋白t4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合，ts和cx引物被广为采用，在上述条件下，只有延伸了三至更多的ggttag片断才有特异扩增，即得到从40bp 开始的6bp差异的梯带。
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端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）
实验前准备
1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存
2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/
管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释
3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+
and Ca2+-free）
4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗
材均要求RNase-free）
冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。
实验步骤
1．PBS洗去残余培养基；
2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；
3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；
4．冰浴30mins；
5．4℃离心12000g，20mins；
6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。
*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）
10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul
50X dNTP Mix 0.5ul
TS Primer 0.5ul
TRAP Primer Mix 0.5ul
Taq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）
dH2O 19.8ul
Template 1.0ul
每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），
②样本热敏对照（85℃，10mins），
③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他
公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），
④阳性热敏对照（85℃，10mins），
⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）
8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，
程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s
↖70℃，1mins↙30-33cycles
9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h
10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins
②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇
床上轻摇10-15mins
③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上
轻摇至条带显色
④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中
拍照。
附：电泳，银染中所要用到试剂的配制方法。
1．12% PAGE胶的配制30% 丙烯酰胺（19：1） 6 ml
5 X TBE 1.5ml
加水至15 ml
过硫酸胺100 μl
TEMED 15 μl 充分混匀，迅速灌胶。
2．30% 丙烯酰胺（19：1）单丙烯酰胺14.25g
双丙烯酰胺0.75g
加水至50ml
3．5 X TBE 冰醋酸57.1 ml
Tris 242g
EDTA(PH=8.0) 100 ml
加水至1000 ml
4．银染固定液无水乙醇50 ml
冰醋酸 2.5 ml
加水至500 ml
5．银染液硝酸银 1 g
加水至500 ml
6．显色液氢氧化钠 3.75 g
加水至500 ml
甲醛 2.75 ml。