实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)..复习过程
利用ELISA法检测乙肝五项操作过程中的几点注意事项
利用ELISA法检测乙肝五项操作过程中的几点注意事项【中图分类号】R512.6+2 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085(2009)13-0236-02目前，临床乙肝五项检测一般采用ELISA法，因为ELISA法是当前灵敏度较高，特异性较好的方法，被临床广泛认可，而且操作非常简单。
但在操作过程中各个环节对检测结果影响较大。
望广大检验工作者引起高度重视，要严格遵守操作规程。
一般涉及标本的采集和保存、试剂的选择和准备、加样、浴温、冲板、显色、比色各步骤。
下面将操作过程中各个环节的注意事项做以下简介：1 标本的采集及保存采血管，优点是既可以预防血液中的气溶胶粒子在空气中传播，对工作人员造成危害，又可以防止标本被污染。
采血过程一定按无菌操作，保证采血顺畅,不要进行剧烈震荡，避免产生溶血现象，因溶血标本或长菌标本会造成假阳性结果。
血液标本采集后要使其充分凝固再分离血清，最好放置1小时，然后再用3000rmp离心15分钟，若当天检测可以放在室温，如果在次日或几天内检测，可分离血清后，放在2-8℃冰箱内保存，用时提前取出，恢复至室温温度时方可检测，如果长时间保存，必须分离血清后置于-20℃低温冰箱内密封保存，用时先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶，方可使用。
2 试剂的选择及准备选择质量优质的试剂盒，严格阅读使用说明书，操作前将试剂在室温平衡30分钟，目的主要是为了保证试剂及反应微孔在后面浴温过程中能够较快达到所要求的温度，稀释洗板液所用蒸馏水或去离子水一定要保证质量，而且要当天用当天配制。
3 加入样本及反应试剂血清或血浆标本一定要分离好，决不能将纤维蛋白原或血球带入反应微孔中，避免出现假阳性或假阴性。
加样器必须经过校准；加样速度不可以太快，加样太快无法保证微量加样器的准确性和均一性；避免加在孔壁上部，加在孔壁上部的非包被区易导致非特异性吸附；避免样本溅出或产生气泡，溅出会对邻近孔造成污染，出现气泡则反应液界面有差异。
乙肝表面抗原ELISA检测程序
乙肝表面抗原ELISA检测程序第一篇：乙肝表面抗原ELISA检测程序乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序1检验目的及原理1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。
母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。
尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。
1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。
在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。
HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。
在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。
本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。
如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。
方法性能参数2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。
(2)特异性：使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。
标本3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。
3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
HBSAG抗体检测(ELISA)标准操作程序
5.3将实验结果存档保留，收拾实验废物，消毒实验台。
6注意事项
6.1可能对检验结果产生影响的因素：
6.1.1不充分的洗涤，如浸泡时间不够或洗液量不足。ห้องสมุดไป่ตู้
6.1.2洗板机针孔堵塞或位置调节不当，孔底洗液残留量过多。
6.1.3加样量不准。
6.1.4在检验过程中应避免交叉污染及酶结合物及其他试剂的污染。
6.1.5没有使用正确的波长读数。
6.1.6测试的过程中应避免反应孔干燥。
6.1.7用高溶血的样品、未完全凝集的样品、含纤维的样品或微生物污染的样品进行检测，可能会对结果产生不良影响。
6.2检测的局限性
6.2.1必须尊照检验方法和结果解释各要点。
6.2.2此分析适用于个体而非混合样品测试。
6.2.3测试的结果为阴性不排除病毒感染的可能。
4.4.4置于水浴箱或温箱37±1℃孵育60分钟。
4.4.5洗涤6遍,扣干。
4.4.6加入酶标记物50ul，空白对照不加酶标记物，4置于水浴箱或温箱37±1℃孵育30分钟。
4.4.7洗涤6遍，扣干。
4.4.8每孔加入底物缓冲液50微升，再加入底物液50微升，振荡混匀，37±1℃孵育30分钟。
4.4.9加入终止液50微升终止反应，混匀后于15分钟内置酶标仪读数，单波长450nm，或双波长450nm/630nm测各孔A值。
4.3实验准备
4.3.1将待测样品从冰箱中取出，核对样品编号，放置恢复室温，充分混匀。
4.3.2将试剂盒从冰箱中取出，室温放置30分钟。
4.3.3准备好实验所需的废物缸、加样器、吸头等物品。
4.3.4调好水浴箱、恒温箱的温度。
4.3.5检查酶标仪洗板机是否正常。
乙肝标志物ELISA实验规范化操作
2.6.2 双波长比色测定具有能排除由微孔 板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、 刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影 响的优点。
由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸 收具有一定程度的不确定性，也就是说每 次测定或同次测定空白孔位置的不同均有 可能得到不同吸光度测定值，故而在 ELISA测定比色时，最好是使用双波长比 色。
复检项目
HBs Anti- HBe Anti- AntiAg HBs Ag HBe HBc
√× × √√
×× × √×
×× × ×√
×× × √√
初检结果
HBsAg
Anti- HBe HBs Ag
AntiHBe
AntiHBc
复检项目
HBs Anti- HBe Anti- AntiAg HBs Ag HBe HBc
-
-+
-
+ √* × √ × √
S/CO <0.5
-
+ S/CO
<0. 3
+ S/CO<
0.3
无须复查
-
+ S/C
O <2
-
+
+
S/CO S/CO
<0.3 <0.3
×
√
××
×
注：“√”表示需要复检；“×” 表示不需要复检；“*”表示除原 倍血清（或血浆）复检外，同时 还需稀释（可使用生理盐水，至 少1:100稀释）复检。
→加样务必在尽量短的时间内完成，以减少不同
孔间的差异。
→使用微量加样器加样吸液和排液速度应适当，
保证微量加样的准确性和均一性。
→要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
实验五ELISA法检查乙肝表面抗原
实验五ELISA法检查乙肝表面抗原ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学实验方法，用于检测特定物质的存在与否以及其浓度。
ELISA检测乙肝表面抗原（HBsAg）是一种常见的方法，用于筛查乙肝病毒感染。
乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒感染的标志物之一，其检测对于早期诊断和治疗乙肝病毒感染至关重要。
以下将介绍使用ELISA方法检查HBsAg的实验步骤和原理。
实验材料：1.96孔酶标板2.吸附HBsAg的孔板3.检测抗体底物4.洗涤缓冲液5.底物和反应停止溶液6.标本（血清或血浆）7.磷酸缓冲液8.特异性酶联免疫试剂盒9.十二烷基硫酸钠（SDS）10.甲醛11.磷酸盐缓冲液12.高效酶联免疫发色底物-HRP实验步骤：1.将96孔酶标板加入具有HBsAg的孔板，并在4°C下孵育过夜，使HBsAg吸附在酶标板上。
2.从孔板中去除液体并适当洗涤孔板，以去除非特异性结合。
3.加入样本，对齐标准品，并加入特异性酶联免疫试剂盒的试剂盒，使其与酶标板上的HBsAg结合。
4.孵育孔板以使HBsAg与特异性酶联抗体结合。
5.从孔板中去除液体，并适当洗涤孔板，以去除未结合的抗体和试剂。
6.加入底物和反应停止溶液，并孵育孔板，使其形成可观察的颜色。
7.使用酶标仪测量孔板中形成的颜色的吸光度。
8.根据标准曲线绘制HBsAg的浓度。
ELISA原理：ELISA是一种基于抗原抗体相互作用的检测方法，其中抗原是要检测的物质（如HBsAg），而抗体是通过免疫反应产生的具有特异性的蛋白质。
ELISA方法通常包括多个步骤：涂层、结合、洗涤、检测和测量。
-涂层：在测试板上涂覆特异性抗体，以将HBsAg固定在板上。
-结合：向涂有HBsAg的板上加入待测样品，使其中的HBsAg与固定的抗体形成复合物。
-洗涤：洗涤孔板，去除未结合的物质，避免非特异性信号的产生。
-检测：加入与HBsAg互作的酶标记的抗体，使其与孔板中的HBsAg 结合。
【实验诊断学】乙肝两对半检查实验
我国HBV感染概况
• 一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9 300万 人，占全世界的1/4；
• 其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙 肝患者的1/3；
• 15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%；1~ 4岁 组HBsAb阳性率由1992年15.75%升至72.25%; 抗HBcAb阳性率由 1992年30.08%降至3.76%
15
乙型肝炎病毒病毒标志物检测
✓乙型肝炎表面抗原（HBsAg）✓乙肝核心抗体（抗-HBc）
✓乙肝病毒前S1抗原
【实验原理】
• 酶联免疫吸附试验（ELISA） • 一种固相酶免疫测定技术：先将抗体或抗原包被到
某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生 反应，再加入酶标抗体或抗原与免疫复合物结合，最 后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及 其吸光度（A）值的大小进行定性或定量分析。
ELISA检测类型
• HBcAg(核心抗原)： 是乙肝病毒存在的直接标志， 与HBV复制呈正相关。存在于肝细胞内，血中 检测不出。
• 当肝细胞破坏,HBcAg释放出来，被酶水解成 HBeAg,所以HBeAg提示肝细胞损伤，HBeAg阳性 标志着较强的感染和传染性
结果报告
• HBsAg: 阴性（阳性） • HBsAb: 阴性（阳性） • HBeAg: 阴性（阳性） • HBeAb: 阴性（阳性） • HBcAb: 阴性（阳性）
注意事项
• HBcAb测定：待测标本稀释后的检测结果为临 床意义；不作稀释的检测结果为流行病学意义。
人乙肝表面抗原(HBsAg)酶联免疫分析(ELISA
人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。
用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
ELISA(双抗体夹心法)—检测HBsAg
ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg摘要：以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。
【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（找产品，上生物帮>> >>相关专题ELISA免疫实验技术以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。
【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含:1、包被抗-HBs反应条1瓶2、酶结合物1瓶3、HBsAg阳性对照1瓶4、HBsAg阴性对照1瓶5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释1瓶6、显色剂(TMB)A1瓶7、显色剂(TMB)B1瓶8、终止液1瓶【方法】1、加入待测标本每孔0.05ml，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。
2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。
3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。
4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。
【结果】比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。
样品OD值/阴性对照平均OD值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。
备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。
酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒表面抗原
xx医科大学附属第五医院 xx
乙肝五项报告单
教学目标
• 掌握ELISA检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的原理
酶联免疫吸附试验
技术简介
• 酶联免疫吸附试验：ELISA • 是一种固相酶免疫分析技术 • 即可检测抗原，又可检测抗体 • 广泛地应用于临床和科研检测 • 反应类型：双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法…
固相载体（聚苯乙烯塑料） E E 酶标记乙肝表面抗体
乙肝表面抗体 血清中待测乙肝表面抗原
底物（底物缓冲液+ 底物液）
水浴箱37℃温育
血清中其他非待测抗原
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图 1、特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体
包被 固相乙肝表面抗体
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图 2、加入待测标本，温育，形成固相抗体-待测抗原复合物
抗原抗体反应具有高度的特异性
酶联免疫吸附试验
如何应用双抗体夹心法检测HBsAg?
双抗体夹心法
方法简介
• 是ELISA检测抗原最常用的方法 • 适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原
双抗体夹心法
检测HBsAg三个必要试剂
• 固相化的抗体 • 酶标记的抗原 • 酶反应的底物
双抗体夹心法
反应基本原理
课后思考题
• 试着分析乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）的检测原理？
提示：双抗原夹心法
EE
EE
EE
EE
固相乙肝表面抗体-待测乙肝表面抗原-酶标乙肝表面抗体复合物
双抗体夹心法
检测HBsAg反应原理示意图
6、加底物，固相载体结合的酶催化底物显色
乙肝五项检测
⼄肝五项检测⼄肝五项检测（ELISA法）⼀、检测⽬的：⼄型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。
⼆、测定原理：分别采⽤双抗体（抗原）夹⼼法和竞争法。
HBsAg、HBsAb原理：采⽤单克隆抗-HBs(HbsAg)包被反应板，加⼊待测标本，同时加⼊多克隆抗-HBs-HRP(HBsAg-HRP),当标本中存在HBsAg（HBsAb）时，该HBsAg （HBsAb）与包被抗- HBsAg（HBsAb）结合并与抗- HBsAg-HRP（HbsAb-HRP）结合形成抗- HBsAg（HBsAb）-抗- HBsAg-HRP（HBsAb-HRP）复合物，加⼊TMB底物产⽣显⾊反应，反之则⽆显⾊反应。
HBeAg原理：采⽤抗-HBe包被反应板，加⼊待测标本，同时加⼊抗—HBe-HRP，如待测样本中抗HBeAg时，就与包被抗-HBe、抗—HBe-HRP结合形成复合物，加⼊TMB 底物产⽣显⾊反应，反之则⽆显⾊反应。
HBeAb原理：采⽤抗-HBe、HBeAg包被反应板，加⼊待测标本，同时加⼊HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBe含量⾼，则抗—HBe-HRP与HBeAg结合少，加⼊TMB底物时显⾊淡，反之则显⾊深。
HBcAb原理：采⽤基因⼯程重组HbcAg包被反应板，加⼊待测标本，同时加⼊HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBc含量⾼，则抗—HBc-HRP与HBcAg 结合少，加⼊TMB底物时显⾊淡，反之则显⾊深。
三、操作步骤：1、将试剂从冷藏室中取出，30分钟后平衡⾄室温⽅可开启使⽤。
2、⽤蒸馏⽔将PBST浓缩液20倍稀释，作为洗液。
3、将微孔条固定于⽀架上，按序编号。
4、按具体使⽤试剂盒说明书加样、孵育、洗板、显⾊。
9、⽤酶标仪读数，取波长450nm,先⽤空⽩调零，然后读取各孔OD值。
四、结果判断：样品OD值／阴性对照平均OD ≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。
实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)
预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
1 23 4
阴性 阴性 阳性 阳性
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。
实验五：ELISA法检测乙肝表面 抗原（HBsAg）
主讲人：季煜华 2014ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ11月
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性 同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过 检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
• 1、 • 2、
课后问题
• 洗涤必须彻底，防止产生假阳性； • 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实
验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温 度。 • ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在 湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速 平衡。温浴的时间要严格控制。
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
ELISA法检测血清中乙肝病毒表面抗体虚拟实验笔记
ELISA法检测血清中乙肝病毒表面抗体虚拟实验笔记
（实验主编：杨健，川北医学院）
实验一：肘静脉采血与分离血清
实验原理：带受试者完成三针乙肝疫苗免疫接种两个月后，对其进行肘静脉采血，将血液样本静置后离心分离血清用于检测乙肝病毒表面抗体，以判断乙肝疫苗的免疫效果
实验相关设备介绍：器材和试剂
采血针，压脉带，真空采血管，离心机，1000ul移液器，天平，-20℃冰箱，2ml离心管，恒温培养箱，无菌棉签，75%酒精，碘酒，采血垫
实验操作：
点击采血垫→压脉带→握拳→碘酒→酒精→采血针→真空采血管→压脉带→无菌棉签→培养箱→离心机→签字笔→移液枪→冰箱
实验二ELISA法检测血清乙肝病毒表面抗体
实验操作
血清样本→HBsAb阳性对照血清→HBsAb阴性对照血清→HBsAb酶标记抗原
酶标抗原添加1-5孔（左到右）→封口膜→培养箱→酶标板（每孔加入300ul洗涤液，轻晃酶标板1min，弃去，在吸水纸上拍杆，如此重复共洗涤5次）
点击洗涤液→加入1-6孔→酶标板晃动→吸水纸→底物A(1-6孔）
底物B→晃动标板→封口膜→终止液→晃动酶标板→酶标仪。
实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)参考文档
4
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.简介
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它 是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原 或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗 体或抗原。 ELISA具有准确性高、检测时间 短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果 便于记录和保存等优点，适合于大批标本的 检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测 以及免疫实验分析等领域。
实验五：ELISA法检测乙肝表面 抗原（HBsAg）
主讲人：季煜华 2014年11月
1
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性 同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过 检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
•定量标准曲 线计算样品抗原的浓度。
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预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
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阴性 阴性 阳性 阳性
18
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。
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4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。
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预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
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阴性 阴性 阳性 阳性
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。
• 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 • 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应
用
实验材料
✓ HBsAg酶联免疫分析试剂盒 ✓ HBsAg阳性品，阴性对照品 ✓ 移液枪，枪头 ✓ 湿盒 ✓ 酶标板，酶标仪 ✓ 一次性手套 ✓ 记号笔 ✓ 计时器
实验步骤
结果判定
•定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用 “阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作 一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者 为阳性，N为阴性对照孔。
• 1、 • 2、
课后问题
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上)，温育
加入酶标抗体， 加入底物，
温育
显色
终止反应，底物显色深浅与待检抗原 量成正比。
利用已知浓度的抗原制成标准品，稀 释为梯度浓度，对其最终OD值与浓 度作标准曲线，那么样品的浓度可以 根据最终的OD值在标准曲线上查出。
实验内容：
双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 （HBsAg）——定性定量检测
实验目的
• 洗涤必须彻底，防止产生假阳性； • 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实
验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温 度。 • ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在 湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速 平衡。温浴的时间要严格控制。
免疫酶测定法
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获（以双抗体夹心法ELISA为例）：
清洗
清洗
清洗
用抗体包被固 相载体
加入抗原 Sample(二价以
2、ELISA基本原理
(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持 其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚 苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。 (2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此 种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； (3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的 颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的 深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进 行定性或定量分析。
实验五：ELISA法检查乙肝表面 抗原(HBsAg)..
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放射性同位素： 酶：辣根过氧化物酶、 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄
125I、131I
碱性磷酸酶
绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹
明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
• 分类：
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.简介
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它 是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原 或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗 体或抗原。 ELISA具有准确性高、检测时间 短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果 便于记录和保存等优点，适合于大批标本的 检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测 以及免疫实验分析等领域。
3、ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化；
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定；
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色。
ELISA的试剂
ELISA中有3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗 原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性） （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）样品及标准本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液