实验五：ELISA法检查乙肝表面抗原(HBsAg)..复习过程

免疫酶测定法
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
2、ELISA基本原理
(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持 其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚 苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。 (2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此 种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； (3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的 颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的 深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进 行定性或定量分析。
• 1、 • 2、
课后问题
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
实验五：ELISA法检查乙肝表面 抗原(HBsAg)..
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放射性同位素： 酶：辣根过氧化物酶、 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄
125I、131I
碱性磷Biblioteka Baidu酶
绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹
明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。
双抗体夹心法
间接法
5、操作步骤（以双抗体夹心法ELISA为例）：
清洗
清洗
清洗
用抗体包被固 相载体
加入抗原 Sample(二价以
• 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 • 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应
用
实验材料
✓ HBsAg酶联免疫分析试剂盒 ✓ HBsAg阳性品，阴性对照品 ✓ 移液枪，枪头 ✓ 湿盒 ✓ 酶标板，酶标仪 ✓ 一次性手套 ✓ 记号笔 ✓ 计时器
实验步骤
结果判定
•定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用 “阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作 一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者 为阳性，N为阴性对照孔。
上)，温育
加入酶标抗体， 加入底物，
温育
显色
终止反应，底物显色深浅与待检抗原 量成正比。
利用已知浓度的抗原制成标准品，稀 释为梯度浓度，对其最终OD值与浓 度作标准曲线，那么样品的浓度可以 根据最终的OD值在标准曲线上查出。
实验内容：
双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 （HBsAg）——定性定量检测
实验目的
• 洗涤必须彻底，防止产生假阳性； • 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实
验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温 度。 • ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在 湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速 平衡。温浴的时间要严格控制。
•定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲 线计算样品抗原的浓度。
预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
1 23 4
阴性 阴性 阳性 阳性
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。
• 分类：
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.简介
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它 是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原 或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗 体或抗原。 ELISA具有准确性高、检测时间 短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果 便于记录和保存等优点，适合于大批标本的 检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测 以及免疫实验分析等领域。
3、ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化；
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定；
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色。
ELISA的试剂
ELISA中有3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗 原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性） （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）样品及标准本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液