病毒及其疫苗的生产制备技术

地鼠肾细胞悬液 37℃,3天细胞培养液，pH7.0～7.2
单层细 洗涤，去除牛血清 10-4～10-5浓度病毒感染细胞 32～34℃培养2～3天
收获病毒液（收二次） 按1:2000加入甲醛 22℃，8天
原液 加入亚硫酸氨钠
半成品 分装
成品 检定 合格成品
(二)生产方法：
1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产 工艺
3、细胞培养法（详见第二篇第18章）
第二节 病毒疫苗的生产制备
• 病毒疫苗的生产制备与病毒的生 产制备基本相同，目前进行人工 主动免疫，用于病毒病预防的疫 苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）, 又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗 、基因缺失的减毒活疫苗，基因 工程亚单位疫苗，重组牛痘多价 疫苗。
一、病毒生产的目的和用途
1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单 位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免 疫血清（抗体）。
2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗， 以用于预防接种。
3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的 病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫 苗的预防接种。
4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台 病毒等），用于干扰素的生产。
一、病毒疫苗的种类 (一)灭活疫苗 (二)减毒活疫苗 (三)亚单位疫苗 (四)多肽疫苗 (五)基因缺失的减毒活疫苗 (六)基因工程亚单位疫苗
(二)细胞培养法制备的常用疫 苗(表25-1)
疫苗 名 称 活/死(疫苗株)
制备疫苗 的细胞
脊 髓 灰 灭活（Salk株 猴肾细胞（原代
）
/2-3代）
质炎疫苗 活（Sabin株） Vero细胞
培养方法 转瓶培养 微载体培养
腮 腺 炎 活（ME株） 幼地鼠、狗肾 转瓶培养
疫苗
豚鼠肾细胞
Edomonste、 原代鸡胚纤维母
麻疹活疫 苗
L16、沪191 、
Moraten、
细胞，人二倍体 人羊膜、狗肾、 羊肾
Schwar2株 豚鼠肾细胞
罗氏瓶培养
罗氏瓶培养 转瓶培养
单纯疮疹 病毒疫苗 死（72株）
兔肾、豚鼠肾 罗氏瓶培 养
豚鼠胚成纤维细 转瓶培养 胞
巨细胞病 毒疫苗
活（Towne株）
WI-38人胚肺细 胞
转瓶培养
狂犬病毒 死（AV01/AV02 人二倍体细胞 疫苗 株） （CUS株）
微载体培 养
流行性乙 型 灭活（5-3株）
脑炎疫苗
人二倍体细胞
多层滋养 增殖器
森林脑炎 病毒疫苗 灭活
鸡胚纤维母细胞 幼地鼠肾细胞 转瓶培养
第25章 病毒及其疫苗的生产制 备技术
第一节 病毒的生产制备
细胞培养技术，在病毒学研究方面 获得了广泛的应用，为病毒的繁殖 、鉴定提供了来自不同动物（包括 人）、不同组织的细胞来源，通过 敏感性筛选，绝大多数病毒均可有 相应的敏感细胞，为病毒的分离、 鉴定和增殖创造了条件,也为病毒的 大量生产提供了细胞来源，只要有 敏感的细胞，就可以进行大规模生 产。
5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵 抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能 通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病 毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。
二、病毒生产制备的方法
1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用 鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。
2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒 （NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细 胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃ 孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝 效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获 卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接 种，收获全胚体液等。
• （4）甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗 原性，因此普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。
• 六、 生产病毒和制备病毒疫苗的 常用方法
(一)制备工艺流程 • （1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺
• 2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制 备工艺
地鼠肾 剪碎，胰酶消化
灭活病毒液 合并，Biblioteka Baidu全及效力试验
谷氨酰胺 精氨酸
麻疹、脊髓灰质炎病毒 、仙台病毒
痘类病毒、疱疹病毒
脯氨酸、赖氨酸 乙型脑炎
五、影响疫苗质量的因素：
• （1）毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫 苗的质量，毒种不纯会产生相互干扰，减毒活疫苗毒种若毒 力回升易造成事故，因此毒种的选择应挑选那些致病性低， 免疫效价高而持久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在 传代细胞上传代的毒种。
• （2）培养病毒的细胞：细胞若有潜在的致癌性病毒或慢病毒 ，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格 检查。此外若细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只 能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。
• （3）培养液：培养细胞的营养液中多少含有一定量的血清蛋 白，在疫苗使用中常会出现某种程度的过敏反应，为此，应 尽量使细胞适应于无血清蛋白的培养基中，以消除过敏源。
• 三、用细胞培养制备病毒疫苗的优点：
• （1）在细胞传代期间可进行比较全面的检查 ，特别是对潜在病毒和致癌性的检查，确保 安全。
• （2）可使逐渐适应于无血清（或无蛋白）培 基中生产繁殖，以排除过敏因素。
• （3）可挑选对病毒敏感的细胞克隆。以利病 毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量的提 高。
• （4）易于大量生产和进行连续自动化工业生 产，以满足量的需求。
胆固醇或卵磷质 脊髓灰质炎病毒
DEAE-dextran 胰酶 二甲亚砜
脊髓灰质炎病毒、风疹痘类病毒，付流 感病毒
痘类病毒、呼吸道肠道病毒，流感病毒 、鼻病毒
脊髓灰质炎病毒、流感、疱疹病毒
放线菌素D
麻疹、脊髓灰质炎病毒、付流感病毒
在维持液中补充某些物质也有利于某些病毒的复制
增加的药物
刺激的病毒
Tween-80或油酸钠 乙型脑炎
2、转瓶培养法 3、罗式瓶培养
• 四、提高疫苗的效力常采用的方 法：
• （1）细胞的药物处理 • （2）在维持液中补充某些物质也
有利于某些病毒的复制
• （3）毒种的选择 • （4）病毒液的浓缩
处理细胞的药物
刺激的病毒
5-碘-2-脱氧尿核 风疹、腺病毒、巨细胞病SV-40 甙
维生素A或
脊髓灰质炎病毒、滤泡性口腔炎病毒
Tween-80