氯苯类化合物废水处理

氯苯类化合物

1 引言

氯苯类化合物作为农药及染料合成中间体、清洗溶剂及脱脂剂成分广泛使用.自然界微生物

缺乏降解此类化合物的酶或酶系统，很难进行生物处理，微生物降解菌的筛选和降解性能研究是

实现生物降解持久性有机污染物的关键.1，2，3，4-TeCB在GB 6944—2005中危险标记为14(有

毒物品)，是一种典型的氯苯类化合物，对人体的皮肤、上呼吸道和粘膜有刺激作用，可在人体

内积累.目前四氯苯的研究主要围绕其物理特性和毒性.四氯苯的晶体结构和混合晶体结构，在水

和空气之间的传质作用，沉积物和悬浮物对1，2，3，4-TeCB的吸附作用，1，2，3，4-TeCB对

孕鼠肝和生殖率影响等均有广泛研究.对于低分子氯苯类化合物及首先被限制使用的六氯苯微生

物降解已有一些报道.但关于TeCBs的微生物降解研究却鲜有报道.研究发现，五氯苯、六氯苯在

降解过程中往往存在1，2，3，4-TeCB中间产物，这表明1，2，3，4-TeCB的降解是高氯苯化合

物降解的关键步骤.本文从某氯苯试剂厂的土壤中取样，筛选出一株以1，2，3，4-TeCB作为唯

一碳源的降解菌，并研究了该菌株对1，2，3，4-TeCB降解效果及降解途径，为微生物降解氯苯

类物质提供实验依据.

2 材料和方法

2.1 原料与试剂

所用土样取自广东某化学试剂厂长期受四氯苯污染的土壤作为菌株分离源.

化学试剂：1，2，3，4-TeCB、丙酮、正己烷等试剂均为优级纯.培养基：常规牛肉膏蛋白胨;无机盐培养基(组分不含Cl-)均为常规配方(试剂均为分析纯)

2.2 主要实验仪器

生化培养箱;恒温水浴振荡器;超净工作台;高速离心机;COD消解仪;离子色谱仪;高效液相色谱;气相色谱-质谱联用仪.

2.3 菌种富集和分离纯化

取1 g土壤于100 mL蒸馏水中，摇床振荡15 min，样品稀释后直接涂布在100 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB的无机盐培养基.待长出菌落后，挑取单菌落在高浓度(250 mg · L-1)1，2，3，4-TeCB的液体培养基驯化.经过5~7 d驯化后(定期更换培养液)，取1~2 mL菌液涂布于1，2，3，4-TeCB为唯一碳源的无机盐平板，30 ℃恒温培养，挑选生长较快的单菌落接种到100 mg · L-

1 1，2，3，4-TeCB液体无机盐培养基中振荡培养;多次平板划线分离，获得单菌落.

2.4 菌株形态观察、生长曲线及16S rDNA序列分析

将纯化后的菌株在固体培养基上进行划线培养，待长出单个菌落后进行形态观察;对菌株进

行革兰氏染色观察;用OD600处测定生长曲线.PCR产物经凝胶电泳分析检测后将PCR产物送至广

州工业微生物检测中心回收并测序.

2.5 菌株对1，2，3，4-四氯苯降解效果的研究

实验所用废水为25 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB模拟废水，pH 7.

取200 mL无机盐培养基置于500 mL锥形瓶中，经高温灭菌后，配置成25 mg · L-1的模

拟废水，分别加入2%、3%、5%的菌悬液.30 ℃，110 r · min-1.接种后每天定时取样.分别测定模拟培养液中COD、Cl-浓度、1，2，3，4-TeCB浓度的影响，连续测定7 d.每组3个平行.

1)COD测定：快速消解分光光度法.

2)氯离子浓度测定：样品测定前，样品经过0.22 μm 微孔过滤膜，用离子色谱仪测定氯离

子浓度.

3)1，2，3，4-TeCB浓度测定：用高效液相测定.前处理：废水经0.22 μm微孔过滤膜过滤，测定过滤液中1，2，3，4-TeCB.测定条件：TH 1015型C18酸性柱;流动相为甲醇与水按85:15

体积比混合;柱温25 ℃;进样体积10 μL;双波长检测：波长为214 nm、216 nm.

2.6 降解特性分析

不同处理时间的废水经0.22 μm 微孔过滤膜过滤，吹扫捕集后，利用气相质谱联用仪(GC-MS)测定氯苯降解情况及产物分析.吹扫捕集条件：吹脱时间：11 min;吹脱温度：350 ℃;解析温度：225 ℃;解析时间：6 min;烘烤温度：235 ℃;烘烤时间：5 min.注入样品5 mL.色谱条件：

检测器温度：300 ℃;进样口温度：260 ℃;柱箱温度：起始60 ℃，保持2分钟，以

5 ℃· min-1的速度升温至160 ℃，保持2 min.分流比：10 ∶ 1.

3 结果与分析

3.1 菌株生理生化特性、16S rDNA序列分析及生长曲线

以1，2，3，4-TeCB为唯一碳源富集、分离、驯化微生物，筛选出一株在固体培养基上能快

速生长的菌株，命名为L-1号菌.菌落表面圆滑，不透明，呈白色或微黄色.菌株为短杆状，无鞭毛，能运动，能产生中生芽孢.菌株革兰氏染色结果为阳性菌(G+)，如图 1所示.在此基础上，对

L-1号菌的16SrDNA基因系列运用Basics BLAST软件分析，和Genbank比对，L-1菌ITS序列与Bacillus subtilis AF0907(枯草芽孢杆菌)和Bacillus carboniphilus JCM9731具有最高的同

源性，均达到98.5%以上.结合生理生化特性，初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌.为了解菌株生长

特点，对L-1号菌进行生长曲线的测定，见图 2.

图1 菌株 L-1 的菌落形态和革兰氏染色

图2 菌株 L-1 的生长曲线

从图 2中可见该菌株在0~3 h生长较慢，5 h后迅速进入生长期，表明该菌株潜伏期较短能够快速适应生长环境，进入对数生长期.12~34 h该菌株生长减慢，进入稳定期，直到30 h后该菌株一直处于稳定期，表明该菌株生长代谢稳定期长，降解潜能较大，利于工业应用.在菌株培养了15 h后，菌的浓度能达到约108 cfu.为实验用菌提供保证.

3.2 不同接种量对反应液COD的影响

将菌株制成菌悬液(108 cfu)，测定不同接种量对25 mg · L-1模拟废水COD降解效果，初步反映菌液中有机污染物的量，结果见图 3.