药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
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●
采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，
如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
●
采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧
氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定
了：取供试品溶液，臵紫外灯下（254nm）照射4 小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰 的分离度应符合规定。
●
不采用任何方式。
典型强破坏试验图谱
2 : 2 1 0 n m , 8 n m 傾 乕 僥 僗 僱 乕 僩 昗 弨 梟 塼 傾 乕 僥 僗 僱 乕 僩 昗 弨 梟 塼 0 2 R e p 4
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VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112203.D) mAU 6 4 2 0 0 5 10 15 VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112204.D) mAU 6
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在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
●
柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
●
溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
质量标准中制订有关物质的原则
杂质-3 峰面积 5032 22331 31717 33898 38065 450002 百分比 0.05% 0.22% 0.30% 0.32% 0.36% 0.42%
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新杂质
均未 检出
流速、柱温与溶剂的选择
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药品含量测定方法的设计——原料药
• 原料药:对于组份单一的原料药,首选容量法测定 含量 强调：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的 要求（消耗滴定液约20ml）； （2）滴定终点的判断要明确，如选用指示剂法， 应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法 校准其终点颜色。 （3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结 果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用 “将滴定的结果用空白试验校正”的办法； （4）最后要给出滴定度（采用四位有效数字）。
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杂质-1（为已知杂质） 时间(h) 0 0.5 1 1.5 2 3 RSD 峰面积 14811 36028 59520 68980 78948 91708 百分比 0.14% 0.35% 0.57% 0.66% 0.75% 0.86%
物（确认结构后人工合成）来验证与主成分
的分离。
系统适用性试验的配制方法： 在100％浓度的主成分溶液中加入 1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中 有可能存在的状态。 介绍配制方法 —— 先配制杂质贮
备液，再用供试品溶液（或浓的对照
品溶液）来稀释，简便、易行！
专属性试验验证图谱
存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。
药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ，
50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度 为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、 N结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会 出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的 原理知晓。
三、准确度试验 用回收率来衡量
作法：在80%~120%间选择3点或5点， 原因是由外标一点法决定的。
已知杂质、且有杂质对照品的，可采用
加入法，即加样回收率来评价。
一般情况下，只要空白辅料无干扰，
回收率均是良好的！
四、专属性
有关物质为主，其他检测项目（含量） 基本上均参照有关物质。
有关物质的验证，采用中间体和降解产
药品含量测定方法的设计——制剂
• 应考虑辅料等的干扰，首选方法一般为 HPLC法，在有关物质、辅料不干扰的情况 下，也可选用UV法或原料药项下的容量法 。
• 复方制剂首选HPLC法 。
药品含量测定方法的设计——验证
• 订入质量标准的含量测定法不同于一般质量考 察的方法，须经过严格的方法学验证 。 • 容量分析法的验证：①精密度：用原料药精制 品（含量>99.5%）考察方法精密度，平行试验 5个样本的RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料 精制品的回收率计算，应在99.7%～100.3%之 间（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定终点确定的依 据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定 终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂 颜色与电位变化情况的对比结果；
唑 来 磷 酸 结 构 式
引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的 相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定
为中间浓度。举例说明。
3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及
样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理
解。
4）国内只注重相关系数，不注重截距。
二、精密度试验
重复性试验：连续进样6次。 中间精密度试验和重现性试验通过“耐用 性试验中的溶液稳定性试验”来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。 加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被 测物质峰尽快出峰。
• ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样 品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结 果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻 时则应在方法中注明。
• HPLC法的验证：①精密度：RSD≤2%（n＝5）； ②准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响， 将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中 （为标示量的80%～120%）制成高、中、低三 个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品， 按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间 （n＝9, RSD≤2%）。
● 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，
此点应予以重视。
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放臵24小时。
● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在
90℃放臵24小时。
● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在
90℃放臵24小时。
● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在
法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。 普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓 度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰 面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左 右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。
青蒿琥酯 峰面积 10369600 10146525 10382388 10344541 10360386 10432888 0.96％ 百分比 99.26% 98.89% 98.58% 98.45% 98.33% 98.16%
杂质-2 峰面积 57511 55786 58098 59521 59172 59185 百分比 0.55% 0.54% 0.55% 0.57% 0.56% 0.56%
方法学认证中的耐受性试验
是指更换试验因素，如不同人员、 不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，
不同试剂等因素。这一点才是真正至
关重要的！认证时不可能做到这一点， 出现问题时往往要考虑到。
方法学认证中溶液稳定性的全面判定
• 不能单从主成分入手！ • 还要注意所有组分的百分比变化， 绝对值变化！
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有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
积分参数的设定
积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、 峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 ● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。
●
●
供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。
• UV法的验证：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；② 准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%～102% 之间（n＝9, RSD≤2%），同时要求辅料、有关物 质或降解产物在测定波长处无吸收。 • ③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓 度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.3～0.7间）， 用浓度C对A进行回归处理，线性方程的相关系数 r应≥0.9990，截距应趋于零，并提供线性关系图； • ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品 提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温 度、时间、pH值等）有微小变动时，测定结果 不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则 应在方法中注明。
强破坏试验的目的：
验证药品在遭遇了极端的气候环境
条件下产生的杂质，在所建立的色谱
条件下是否能够分离、测定。
● 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否 相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被 测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长 （f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波 长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得 到错误的判断。
90℃放臵24小时。
● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高
温下破坏至外观性状改变
● 强光破坏 取原料适量，臵紫外灯下照射48小时。
四、检测限
● 信噪比的三倍
—— 纯属“纸上谈兵”，实
际测定中根本用不上。
●
是相对值，不是绝对值。是相对于供试品
溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在
5000倍以上。
Hale Waihona Puke Baidu
介绍该项检测的由来和历史背景 要看主峰里是否有杂质，如何判 断？但需注意DAD检测器的局限性，
介绍“土办法”！
结果：目前从来没有推翻现行色
谱条件的。意义在哪里。如何应用，
拿到只是“走形式”？
最小峰面积的设定
● 其设定，不是绝对值，而是相对值。
● 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC
• ③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓 度的溶液（n＝5～7），用浓度C对峰面积A或峰 高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性 方程的相关系数r≥0.9990，截距越小越好，并提 供线性关系图； • ④专属性：辅料、有关物质或降解产物峰对主药 峰应无干扰； • ⑤耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、流动 相组成和pH值、不同品牌或批号的同类色谱柱、 柱温、流速、样品提取次数、时间等）有微小变 动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条 件要求苛刻时则应在方法中注明； • ⑥灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要 求。
• 容量法测定含量要注意参加反应的应是药物分子 活性部分，而不应是次要的酸根或碱基部分。 如盐酸氨溴索 ，有研究者采用氢氧化钠滴定液 测定其含量，事实上这种方法测定的是其中盐酸 的含量，由于其成盐工艺中的酸、碱配比不当时， 可严重影响成品酸碱度，故测定结果并不能代表 其活性成分有机碱的含量 。
应采用非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉 盐酸的干扰，用高氯酸滴定其有机碱的含量。高 氯酸非水滴定法因适应性广（适用于有机弱碱及 其盐类）在化学原料药的含量测定中较为常用。
• 如用容量法不适宜时，可考虑选用HPLC法， 尤其在有关物质干扰，或多组份物质时，具 有特殊优势。 • 一般不选用UV法，尤其不首选“吸收系数 法”定量，不选用末端吸收峰作测定波长； 须用UV法时，可采用不受仪器及其它变化 影响的“对照品比较法”定量，测定溶液的 吸收度宜在0.3～0.7间。 • 元素测定法如定氮法，在其它方法均不适宜 时可采用，但因不能反映化合物含量的变化 情况，此法不可用于稳定性考察中。
采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，
如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
●
采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧
氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定
了：取供试品溶液，臵紫外灯下（254nm）照射4 小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰 的分离度应符合规定。
●
不采用任何方式。
典型强破坏试验图谱
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在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
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柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
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溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
质量标准中制订有关物质的原则
杂质-3 峰面积 5032 22331 31717 33898 38065 450002 百分比 0.05% 0.22% 0.30% 0.32% 0.36% 0.42%
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新杂质
均未 检出
流速、柱温与溶剂的选择
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• 原料药:对于组份单一的原料药,首选容量法测定 含量 强调：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的 要求（消耗滴定液约20ml）； （2）滴定终点的判断要明确，如选用指示剂法， 应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法 校准其终点颜色。 （3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结 果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用 “将滴定的结果用空白试验校正”的办法； （4）最后要给出滴定度（采用四位有效数字）。
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杂质-1（为已知杂质） 时间(h) 0 0.5 1 1.5 2 3 RSD 峰面积 14811 36028 59520 68980 78948 91708 百分比 0.14% 0.35% 0.57% 0.66% 0.75% 0.86%
物（确认结构后人工合成）来验证与主成分
的分离。
系统适用性试验的配制方法： 在100％浓度的主成分溶液中加入 1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中 有可能存在的状态。 介绍配制方法 —— 先配制杂质贮
备液，再用供试品溶液（或浓的对照
品溶液）来稀释，简便、易行！
专属性试验验证图谱
存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。
药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ，
50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度 为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、 N结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会 出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的 原理知晓。
三、准确度试验 用回收率来衡量
作法：在80%~120%间选择3点或5点， 原因是由外标一点法决定的。
已知杂质、且有杂质对照品的，可采用
加入法，即加样回收率来评价。
一般情况下，只要空白辅料无干扰，
回收率均是良好的！
四、专属性
有关物质为主，其他检测项目（含量） 基本上均参照有关物质。
有关物质的验证，采用中间体和降解产
药品含量测定方法的设计——制剂
• 应考虑辅料等的干扰，首选方法一般为 HPLC法，在有关物质、辅料不干扰的情况 下，也可选用UV法或原料药项下的容量法 。
• 复方制剂首选HPLC法 。
药品含量测定方法的设计——验证
• 订入质量标准的含量测定法不同于一般质量考 察的方法，须经过严格的方法学验证 。 • 容量分析法的验证：①精密度：用原料药精制 品（含量>99.5%）考察方法精密度，平行试验 5个样本的RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料 精制品的回收率计算，应在99.7%～100.3%之 间（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定终点确定的依 据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定 终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂 颜色与电位变化情况的对比结果；
唑 来 磷 酸 结 构 式
引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的 相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定
为中间浓度。举例说明。
3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及
样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理
解。
4）国内只注重相关系数，不注重截距。
二、精密度试验
重复性试验：连续进样6次。 中间精密度试验和重现性试验通过“耐用 性试验中的溶液稳定性试验”来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。 加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被 测物质峰尽快出峰。
• ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样 品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结 果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻 时则应在方法中注明。
• HPLC法的验证：①精密度：RSD≤2%（n＝5）； ②准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响， 将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中 （为标示量的80%～120%）制成高、中、低三 个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品， 按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间 （n＝9, RSD≤2%）。
● 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，
此点应予以重视。
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放臵24小时。
● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在
90℃放臵24小时。
● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在
90℃放臵24小时。
● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在
法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。 普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓 度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰 面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左 右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。
青蒿琥酯 峰面积 10369600 10146525 10382388 10344541 10360386 10432888 0.96％ 百分比 99.26% 98.89% 98.58% 98.45% 98.33% 98.16%
杂质-2 峰面积 57511 55786 58098 59521 59172 59185 百分比 0.55% 0.54% 0.55% 0.57% 0.56% 0.56%
方法学认证中的耐受性试验
是指更换试验因素，如不同人员、 不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，
不同试剂等因素。这一点才是真正至
关重要的！认证时不可能做到这一点， 出现问题时往往要考虑到。
方法学认证中溶液稳定性的全面判定
• 不能单从主成分入手！ • 还要注意所有组分的百分比变化， 绝对值变化！
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有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
积分参数的设定
积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、 峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 ● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。
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供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。
• UV法的验证：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；② 准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%～102% 之间（n＝9, RSD≤2%），同时要求辅料、有关物 质或降解产物在测定波长处无吸收。 • ③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓 度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.3～0.7间）， 用浓度C对A进行回归处理，线性方程的相关系数 r应≥0.9990，截距应趋于零，并提供线性关系图； • ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品 提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温 度、时间、pH值等）有微小变动时，测定结果 不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则 应在方法中注明。
强破坏试验的目的：
验证药品在遭遇了极端的气候环境
条件下产生的杂质，在所建立的色谱
条件下是否能够分离、测定。
● 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否 相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被 测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长 （f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波 长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得 到错误的判断。
90℃放臵24小时。
● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高
温下破坏至外观性状改变
● 强光破坏 取原料适量，臵紫外灯下照射48小时。
四、检测限
● 信噪比的三倍
—— 纯属“纸上谈兵”，实
际测定中根本用不上。
●
是相对值，不是绝对值。是相对于供试品
溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在
5000倍以上。
Hale Waihona Puke Baidu
介绍该项检测的由来和历史背景 要看主峰里是否有杂质，如何判 断？但需注意DAD检测器的局限性，
介绍“土办法”！
结果：目前从来没有推翻现行色
谱条件的。意义在哪里。如何应用，
拿到只是“走形式”？
最小峰面积的设定
● 其设定，不是绝对值，而是相对值。
● 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC
• ③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓 度的溶液（n＝5～7），用浓度C对峰面积A或峰 高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性 方程的相关系数r≥0.9990，截距越小越好，并提 供线性关系图； • ④专属性：辅料、有关物质或降解产物峰对主药 峰应无干扰； • ⑤耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、流动 相组成和pH值、不同品牌或批号的同类色谱柱、 柱温、流速、样品提取次数、时间等）有微小变 动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条 件要求苛刻时则应在方法中注明； • ⑥灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要 求。
• 容量法测定含量要注意参加反应的应是药物分子 活性部分，而不应是次要的酸根或碱基部分。 如盐酸氨溴索 ，有研究者采用氢氧化钠滴定液 测定其含量，事实上这种方法测定的是其中盐酸 的含量，由于其成盐工艺中的酸、碱配比不当时， 可严重影响成品酸碱度，故测定结果并不能代表 其活性成分有机碱的含量 。
应采用非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉 盐酸的干扰，用高氯酸滴定其有机碱的含量。高 氯酸非水滴定法因适应性广（适用于有机弱碱及 其盐类）在化学原料药的含量测定中较为常用。
• 如用容量法不适宜时，可考虑选用HPLC法， 尤其在有关物质干扰，或多组份物质时，具 有特殊优势。 • 一般不选用UV法，尤其不首选“吸收系数 法”定量，不选用末端吸收峰作测定波长； 须用UV法时，可采用不受仪器及其它变化 影响的“对照品比较法”定量，测定溶液的 吸收度宜在0.3～0.7间。 • 元素测定法如定氮法，在其它方法均不适宜 时可采用，但因不能反映化合物含量的变化 情况，此法不可用于稳定性考察中。