药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
方法学验证中各项指标的深度剖析2015讲解
质量标准中制订有关物质的原则
● 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定， 如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
● 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧 氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟 定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照 射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与 主峰的分离度应符合规定。
四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”， 实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品 溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在 5000倍以上。
有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
浓 度 进样量 绝对值 相对于样品测定浓度的
最大进样量 50mg/ml 以上 20μl
入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品 中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质贮 备液，再用供试品溶液（或浓的对照 品溶液）来稀释，简便、易行！
存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境 条件下产生的杂质，在所建立的色谱 条件下是否能够分离、测定。
方法学认证中溶液稳定性的全面判定 不能单从主成分入手！ 还要注意所有组分的百分比变化，
绝对值变化！
流速、柱温与溶剂的选择
● 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
● 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
● 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
药物分析 药物分析方法的验证
2. 验证方法
（1） 含量测定
1）基质无（原料药）/可模拟（制剂）
回收率(%)=
测得量 加入量
100
2）基质不可模拟（制剂、中药）
回收率(%)=
测得量 - 本底值 加入量
100
（2） 杂质检查——方法同2）
2. 验证方法（其他方法）
• 可与已知准确度的另一方法的测定结果比较 ——药典标准方法 / 经过验证的方法
• LOD是一种限度检验效能指标， 反映方法的灵敏度
1 直观法
目视法评价的方法: 化学反应 / TLC ——鉴别的显色法； 杂质检查的TLC
2 信噪比法
3 标准偏差/ 标准曲线
显示信号与噪声水平的方法: HPLC ——S/N=3（2） 时的相应浓度或量
其他分析方法: UV-Vis法
LOD 3.3 / S δ空白响应偏差
含量水平
限度（%）
100 % 10 % 1% 0.1%
98~101 95~102 92~105 90~108
0.01 % 10 g/g （ppm） 1 g/g （ppm） 10 g/kg （ppb）
85~110 80~115 75~120 70~125
（二） 精密度
1. 定义 • 同一均匀供试品多次取样测定 所得结果之间的接近程度 • 相对标准偏差（%， RSD）；
• 也可由所测定的精密度、线性和专属性推算 ——原料药含量HPLC测定法
3. 数据要求 • 9个测定结果（n=9）
3水平×3样品 • 化药：1 ︰ 0.8、1 ︰ 1、1 ︰ 1.2 • 中药: 1 ︰ 0.5、1︰1、1︰1.5
3. 数据要求
样品中被测成分的含量水平 与回收率限度 要求的关系
方法学验证中各项指标的深度剖析 谢沐风
● 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否 相同，即所谓重量校正因子的问题。（ 。（f=A杂质 被 杂质/A被 相同，即所谓重量校正因子的问题。（ 杂质 测成分） 测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长 （f=1.0）。 ）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 ），这样可更加严格控制杂质的限度 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 ），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波 应必须加入重量校正因子（ ），否则将得 长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得 ）， 到错误的判断。 到错误的判断。
专属性试验验证图谱
配制相同浓度， 存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大， 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。 峰覆盖。 强破坏试验的目的： 强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境 条件下产生的杂质， 条件下产生的杂质，在所建立的色谱 条件下是否能够分离、测定。 条件下是否能够分离、测定。
测定结果： 测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 ）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 ）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常 、H、O、 ）为什么没有不成线性的？通常C、 、 、 N结构，紫外监测器决定。 结构， 结构 紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时， 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会 出现不成线性。 出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的 ）都成线性、为何还要做？ 原理知晓。 原理知晓。
唑 来 磷 酸 结 构 式
引申使用： 引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的 ） 相互妙用。 相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定 ）缓释制剂溶出度测定， 为中间浓度。举例说明。 为中间浓度。举例说明。 3）回收率试验为何做 ）回收率试验为何做80%~120%即可？亦 即可？ 即可 及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的 理解。 理解。 4）国内只注重相关系数，不注重截距。 ）国内只注重相关系数，不注重截距。
方法学验证中各项指标的深度剖析-
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ， 50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。
杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限 度为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
130
120
91708 5.923 0.86
110
100
90
80
70
60
0
2
4
6
10432888 8.410 98.16
160
150
140
130
120
110
59185 14.626 0.56
100
90
80
70
60
8
10
12
14
16
18
20
22
24
m in
时间(h) 0 0.5 1 1.5 2 3
RSD
● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。
● 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。
方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、 不同仪器，不同色谱柱型号、厂家， 不同试剂等因素。这一点才是真正至 关重要的！认证时不可能做到这一点， 出现问题时往往要考虑到。
四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”， 实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品 溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在 5000倍以上。
方法学验证的7个技术指标详解
方法学验证的7个技术指标详解我们平时做了理化分析, 出来数据后如何对这场实验进行评估？评估的结果有哪几个维度？这就包括准确度、精密度、线性、检测限和定量限、特异性、耐变性、不确定度。
今天小编就和大家一起复习一下, 深度理解了这几个技术指标, 不仅对实验有了整体把握, 写学术论文也不再是难题。
一、准确度准确度是反映方法系统误差和随机误差的综合指标。
检验准确度可参考以下3个维度:1.使用标准参考物质进行分析测定, 比较测定值与保证值, 其绝对误差或相对误差应符合方法规定的要求。
通常应完成1~2个浓度水平的有证标准物质的测定, 每个浓度水平要求采用至少6份同样的标准物质进行测定, 计算测定结果的平均值、标准偏差与相对标准偏差。
准确度（％）=平均检测浓度／标示浓度×100%2.在没有有证标准物质情况下, 应在样品基质中添加分析物测定回收率。
应至少选择3个添加浓度, 并且包含一定的浓度范围, 定量限或靠近定量限的浓度为必选浓度, 如果样品具有容许限, 该容许限也是必选浓度。
每个浓度水平至少平行测定6次, 计算测量结果的平均值、标准偏差与相对标准偏差。
对于元素分析, 回收率指标应在90％～110％之间。
回收率（％）=（加标试样测定值一试样测定值）／添加浓度×100%3.对同一样品用不同原理的分析方法测试比对。
不同待测物浓度范围内回收率要求不同。
二、精密度精密度是指在规定条件下, 相互独立的测试结果之间的一致程度。
精密度包括方法重复性和方法重现性两个分指标。
重复性: 是在重复性条件下, 相互独立的测试结果之间的一致程度。
重复性条件是指在同一实验室, 由同一操作者使用相同设备, 按相同的测试方法, 并在短时间内对同一被测对象取得相互独立测试结果的条件。
重复性表征了该方法实验室内的精密度。
制定的标准方法必须进行方法的精密度试验, 以考察其是否精确可靠。
重复性试验过程中, 选择3个不同浓度水平样品, 每个浓度水平至少6次平行测定, 计算出平均值、标准偏差和相对标准偏差, 其相对标准偏差应符合表2要求。
化学药物分析方法验证的内容和评价
化学药物分析方法验证的内容和评价化学药物分析方法验证的内容和评价质量可控是活性化合物成药及进行药品安全有效性评价的前提。
对药品的质量进行控制应该是多方面的，其中包括生产环境的控制、原辅料来源和质量的控制、生产工艺过程的控制，以及按照质量标准进行成品检验控制等。
但是，在药品研发过程中，揭示药品的品质、控制药品的质量，通常是要针对研制药品的特性(主药的理化性质及制剂的质量要求等)确定相应的研究测试项目，再根据测试项目的需要，建立适宜的分析方法(包括方法的选择和方法的验证)，最后是根据药品质量的要求及安全性研究结果确定各测试项目的限度，起草制订检验药品质量的质量标准。
分析方法是揭示药品品质的工具和手段，方法验证是判断采用的分析方法是否科学、可行的过程。
实际上，方法验证就是根据确定的检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。
下面就根据《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》解读分析方法验证的内容和评价要点，在对目前申报资料中分析方法验证工作中存在的问题进行分析的基础上，以高效液相色谱法为例，阐述方法验证的思路及验证要点，希望能对药物研发者有所帮助。
一、方法验证的内容首先应该明确的是：方法验证的内容应根据检测项目的要求，同时结合所采用的分析方法的特点确定。
相同的分析方法用于不同的检测项目时，其验证要求是不同的。
例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量检查时的验证要求是不同的；前者重点要验证方法的专属性，而后者重点要验证方法的专属性、准确度和定量限。
通常需要验证的检测项目：鉴别、杂质检查(限度试验、定量试验)、定量测定 (含量测定、溶出度、释放度等 )，还有其他特定的检测项目 (粒径分布、分子量分布)等。
方法验证的内容包括专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性(粗放度)和系统适用性等。
1、专属性专属性系指在其他成分 (如杂质、降解物、辅料等 )存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被测物的特性。
方法学验证中各项指标的深度剖析-谢沐风讲解
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
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质量标准中制订有关物质的原则 ● 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨
基酚等。 ● 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在
HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm） 照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规 定。 ● 不采用任何方式。
在100％浓度的主成分溶液中加 入1%浓度的杂质对照品，以模拟样 品中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质 贮备液，再用供试品溶液（或浓的对 照品溶液）来稀释，简便、易行！
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专属性试验验证图谱
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存在问题 —— 配制相同浓度， 测定样品时，主成分峰骤然加大， 将杂质峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环 境条件下产生的杂质，在所建立的 色谱条件下是否能够分离、测定。
柺 愊 曐 帩 帪 娫 柺 愊 %
1 4 0
1 3 0
1 2 0
1 1 0
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0 0
2
药物分析的方法学验证
药物分析的方法学验证
药物分析的方法学验证是指针对某一特定的分析方法，通过一系列的实验验证其可行性、准确性、精密度、重复性、稳定性、线性范围、灵敏度、特异性、精确度等性能指标，确保该方法符合要求。
常见的方法学验证包括以下方面：
1.线性范围：检验药物浓度与信号响应之间的线性关系，通常需要使用多个浓度水平进行验证。
2.准确度：准确度是指药物分析方法在测量结果中接近真实值的程度。
比如通过添加标准品或对标，验证测量结果与标准值之间的误差。
3.精密度：精密度指药物分析方法的测量结果在重复性试验中的一致性。
通常使用多次测量同一样品，计算其相对标准偏差（RSD）或方差。
4.稳定性：稳定性是指药物分析方法在一定时间内，分析结果的变异程度。
通常通过长时间存储、变温、光照等实验验证。
5.特异性：特异性是指药物分析方法针对目标分析物的选择性。
通常需要验证该方法能否识别和测量其他可能存在的干扰物质或杂质。
6.检测限和定量限：检测限是指药物分析方法中能够被检测到的最低限度，定量限是指能够准确测量药物浓度的最低限度。
7.精确度：精确度是指药物分析方法在测量结果中的一致性。
通常通过同一样品在不同条件下进行测量，比较测量结果的一致性。
在药物分析中，以上方法学验证通常需要符合某些国际标准或药典规定，如美国药典、欧洲药典、日本药典等。
杂质检查方法的方法学验证各项指标分析
杂质检查方法的方法学验证各项指标分析(总7页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除杂质检查方法的方法学验证各项指标分析药物分析中药品检验基本程序包括：鉴别、检查、含量测定、写实验报告等步骤。
检查项下包括反映药品安全性有效性的试验方法和限度、均一性、纯度等制备工艺要求等内容。
药物的杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效,甚至对人体的健康有害的物质。
杂质的来源可由生产和贮藏过程中引入：①生产过程中主要是由于所用原料不纯或者原料反应过程中反应未完全,以及反应的中间产物、反应的副产物等造成药品原料中杂质的存在；或者是由原料生产过程中反应的溶媒、催化剂等溶剂的残留所造成的药物的杂质。
②贮藏过程引入主要是受温度、湿度、日光、空气等外界条件的影响或者受微生物的作用产生的杂质[1]。
在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面, 必须保持药物的纯度, 降低药物的杂质,这样才能保证药物的有效性和安全性[2]。
原料药和制剂主要是对药物中的微量杂质进行纯度检查，以判断药物纯度是否符合杂质限量的规定要求，而生物制品的杂质检查除包括一般杂质检查，特殊杂质检查外还应对其进行安全性检查。
杂质定量、定性检查方法主要是根据药物和特殊杂质在理化性质上的差异来进行的，可以采用容量分析法，光谱法分析法，色谱分析法等[3]，各种检测方法所需的方法学验证的指标包括准确度，精密度，专属性，线性，范围，检测线、定量线，耐用性八项指标，但采用不同方法所需的指标不尽相同，杂质限量检查一般需要验证专属性，检测线，耐用性。
而杂质定量分析方法除检测限外其它指标一般都需验证[4]。
不同实验应该根据不同实验目的对对各项指标进行验证，下面就杂质种类及近年来检测杂质最常用的检测方法进行分析：1、特殊杂质特殊杂质是指在药物制备和贮存过程中, 由于药物性质不稳定而产生的降解产物, 或合成过程中产生的副产物等, 多指有机杂质, 也包括残留溶剂和手性化合物中无特殊毒性的对映体[5]。
深度解读分析方法学验证各项关键指标要求
深度解读分析方法学验证各项关键指标要求首先，需验证的分析方法类型有以下四种；① 鉴别试验②杂质的定量试验③杂质控制的限度试验④原料药或制剂中活性成分以及制剂中选定组分的定量试验。
试验类型如下：①鉴别试验旨在确证样品中的一种被测物的特性。
通常将样品的性质（如光谱、色谱行为、化学反应性等）与参比对照品的性质进行比对。
②杂质检查是指样品中杂质的定量检测或限度检测，两种检测均是为了准确反映样品的纯度。
定量试验所需验证项目与限度试验相比是不同的。
③含量测定是指测定样品中被分析物的含量。
本文件中含量测定是指原料药中主要成分的定量测定。
类似的验证项目也适用于制剂中的活性组分或其他指定成分的定量测定，以及与其他分析方法（如溶出度）相关的定量分析。
做药物分析的小伙伴都应该清楚了解分析方法的目的，这将决定需要评价哪些验证项目。
应进行评价的典型的验证项目如下：专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度（进样精密度、重复性、中间精密度）、准确性。
需重新验证的情况① 原料药合成方法的改变②成品组分发生改变③分析方法的改变需要重新验证的程度，应根据改变的情况而定。
某些其他的改变可能也要求验证。
注意：-表示该项目通常不需评价+表示该项目通常需评价(1) 假如已评价重现性（见术语表），可不需再评价中间精密度；(2) 缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来做补充；(3) 有些情况下需要。
各项目的定义及其要求1. 专属性（Specificity）专属性是指可能存在某些组分(如杂质、降解物、基质等)时，对被分析物准确可靠测定的能力。
专属性有以下含义：①鉴别：确证被分析物符合其特性。
②纯度检查：确保采用的分析方法可检出被分析物中杂质的准确含量，如有关物质、重金属、溶剂残留量等。
③含量测定（含量或效价）：提供样品中被分析物的含量或效价的准确结果。
专属性注意事项：(1) 定位分离试验① 主峰峰纯度的确定在专属性验证的相关实验中，主成分峰都应该考察峰纯度，确认主成分峰为单一成分的峰。
药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析共34页
药物分析方法学验证中各项 指标的深度剖析
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
【药物分析方法学验证】分析方法的方法学验证
【药物分析方法学验证】分析方法的方法学验证分析方法的方法学验证一、方法验证1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。
验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。
可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSd）应不大于2.0%。
2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。
具体的验证方法为：在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。
以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。
可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。
3．精密度1）重复性配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。
2）中间精密度配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。
4．专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。
以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。
5．检测限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。
6．定量限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。
另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。
7．耐用性分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。
可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。
药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
介绍配制方法 —— 先配制杂质贮 备液，再用供试品溶液（或浓的对照 品溶液）来稀释，简便、易行！
专属性试验验证图谱
存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境 条件下产生的杂质，在所建立的色谱 条件下是否能够分离、测定。
• ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样 品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结 果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻 时则应在方法中注明。
• HPLC法的验证：①精密度：RSD≤2%（n＝5）； ②准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响， 将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中 （为标示量的80%～120%）制成高、中、低三 个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品， 按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间 （n＝9, RSD≤2%）。
• 容量分析法的验证：①精密度：用原料药精制 品（含量>99.5%）考察方法精密度，平行试验5 个样本的RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料精 制品的回收率计算，应在99.7%～100.3%之间 （n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定终点确定的依据： 包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定终点， 应用电位法校准终点颜色，提供指示剂颜色与 电位变化情况的对比结果；
药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ， 50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。
杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度 为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
方法学验证中各项指标的深度剖析26页PPT
46、法律有权打破平静。——马·格林 47、在一千磅法律里，没有一盎司仁 爱。— —英国
48、法律一多，公正就少。——托·富 勒 49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处 罚才能 使犯罪 得到偿 还。— —达雷 尔
Байду номын сангаас50、弱者比强者更能得到法律的保护 。—— 威·厄尔
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
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0 5 10 15 VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112205.D) mAU 6 4 2 0 0 5 10 15
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药品含量测定方法的设计——原料药
• 原料药:对于组份单一的原料药,首选容量法测定 含量 强调：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的 要求（消耗滴定液约20ml）； （2）滴定终点的判断要明确，如选用指示剂法， 应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法 校准其终点颜色。 （3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结 果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用 “将滴定的结果用空白试验校正”的办法； （4）最后要给出滴定度（采用四位有效数字）。
VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112203.D) mAU 6 4 2 0 0 5 10 15 VWD1 A, Wavelength=280 nm (XMF\05112204.D) mAU 6
14.812 15.928 15.753
20
25
30
35
40
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4 2 0
介绍该项检测的由来和历史背景 要看主峰里是否有杂质，如何判 断？但需注意DAD检测器的局限性，
介绍“土办法”！
结果：目前从来没有推翻现行色
谱条件的。意义在哪里。如何应用，
拿到只是“走形式”？
最小峰面积的设定
● 其设定，不是绝对值，而是相对值。
● 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC
• 容量法测定含量要注意参加反应的应是药物分子 活性部分，而不应是次要的酸根或碱基部分。 如盐酸氨溴索 ，有研究者采用氢氧化钠滴定液 测定其含量，事实上这种方法测定的是其中盐酸 的含量，由于其成盐工艺中的酸、碱配比不当时， 可严重影响成品酸碱度，故测定结果并不能代表 其活性成分有机碱的含量 。
应采用非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉 盐酸的干扰，用高氯酸滴定其有机碱的含量。高 氯酸非水滴定法因适应性广（适用于有机弱碱及 其盐类）在化学原料药的含量测定中较为常用。
青蒿琥酯 峰面积 10369600 10146525 10382388 10344541 10360386 10432888 0.96％ 百分比 99.26% 98.89% 98.58% 98.45% 98.33% 98.16%
杂质-2 峰面积 57511 55786 58098 59521 59172 59185 百分比 0.55% 0.54% 0.55% 0.57% 0.56% 0.56%
• UV法的验证：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；② 准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%～102% 之间（n＝9, RSD≤2%），同时要求辅料、有关物 质或降解产物在测定波长处无吸收。 • ③线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓 度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.3～0.7间）， 用浓度C对A进行回归处理，线性方程的相关系数 r应≥0.9990，截距应趋于零，并提供线性关系图； • ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品 提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温 度、时间、pH值等）有微小变动时，测定结果 不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则 应在方法中注明。
90℃放臵24小时。
● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高
温下破坏至外观性状改变
● 强光破坏 取原料适量，臵紫外灯下照射48小时。
四、检测限
● 信噪比的三倍
—— 纯属“纸上谈兵”，实
际测定中根本用不上。
●
是相对值，不是绝对值。是相对于供试品
溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在
5000倍以上。
●
采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，
如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
●
采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧
氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定
了：取供试品溶液，臵紫外灯下（254nm）照射4 小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰 的分离度应符合规定。
●
不采用任何方式。
典型强破坏试验图谱
• ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样 品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结 果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻 时则应在方法中注明。
• HPLC法的验证：①精密度：RSD≤2%（n＝5）； ②准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响， 将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中 （为标示量的80%～120%）制成高、中、低三 个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品， 按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间 （n＝9, RSD≤2%）。
杂质-3 峰面积 5032 22331 31717 33898 38065 450002 百分比 0.05% 0.22% 0.30% 0.32% 0.36% 0.42%
mAU
1 1 0
91708 5.923 0.86
1 1 0
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0
新杂质
均未 检出
流速、柱温与溶剂的选择
●
在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
●
柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
●
溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
质量标准中制订有关物质的原则
• 如用容量法不适宜时，可考虑选用HPLC法， 尤其在有关物质干扰，或多组份物质时，具 有特殊优势。 • 一般不选用UV法，尤其不首选“吸收系数 法”定量，不选用末端吸收峰作测定波长； 须用UV法时，可采用不受仪器及其它变化 影响的“对照品比较法”定量，测定溶液的 吸收度宜在0.3～0.7间。 • 元素测定法如定氮法，在其它方法均不适宜 时可采用，但因不能反映化合物含量的变化 情况，此法不可用于稳定性考察中。
法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。 普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓 度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰 面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左 右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。
强破坏试验的目的：
验证药品在遭遇了极端的气候环境
条件下产生的杂质，在所建立的色谱
条件下是否能够分离、测定。
● 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否 相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被 测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长 （f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波 长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得 到错误的判断。
药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ，
50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度 为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
பைடு நூலகம்
测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、 N结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会 出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的 原理知晓。
药品含量测定方法的设计——制剂
• 应考虑辅料等的干扰，首选方法一般为 HPLC法，在有关物质、辅料不干扰的情况 下，也可选用UV法或原料药项下的容量法 。
• 复方制剂首选HPLC法 。
药品含量测定方法的设计——验证
• 订入质量标准的含量测定法不同于一般质量考 察的方法，须经过严格的方法学验证 。 • 容量分析法的验证：①精密度：用原料药精制 品（含量>99.5%）考察方法精密度，平行试验 5个样本的RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料 精制品的回收率计算，应在99.7%～100.3%之 间（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定终点确定的依 据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定 终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂 颜色与电位变化情况的对比结果；
唑 来 磷 酸 结 构 式
引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法的 相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定
为中间浓度。举例说明。
3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及
样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理
解。
4）国内只注重相关系数，不注重截距。
二、精密度试验
重复性试验：连续进样6次。 中间精密度试验和重现性试验通过“耐用 性试验中的溶液稳定性试验”来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。 加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被 测物质峰尽快出峰。
有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
积分参数的设定
积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、 峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 ● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。
●
●
供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。